简易大鼠海马神经元原代培养方法及神经元兴奋性检测

目的 对原有大鼠海马神经元原代培养方法进行改进,在获得数量多、纯度高、体外生长时间长的神经细胞的同时,简化操作流程、节省时间、减少污染.方法 分离24h内出生的Wistar大鼠双侧海马,采用机械吹打法,以沉降法代替过滤制备单细胞悬液,细胞接种24h后培养液更换为添加B27的DMEM/F12无血清培养基,以后每周半量换液2～3次.用倒置相差显微镜观察细胞形态,利用神经元特异性标志物神经元特异烯醇化酶(NSE)鉴定神经细胞的纯度,并以钙影像仪测定KCl作用神经元后细胞的钙离子浓度变化,了解神经元的兴奋性.结果 此简易方法节约操作时间及科研成本,减少了污染的机会.所培养的神经元杂质少、纯度高、细胞活性好,体外存活时间长.结论 该方法简便可行,结果稳定,用该方法培养的大鼠海马神经元可作为神经元体外培养的良好实验模型.     

大鼠脊髓神经元的分离、培养与鉴定

目的通过对新生大鼠脊髓神经元分离、培养过程中细节的探讨,建立一种高效、稳定的大鼠脊髓神经元培养方法,为研究脊髓损伤相关的病理生理及其治疗提供种子细胞。方法取新生SD大鼠的脊髓组织,通过木瓜酶消化制成单细胞悬液,经差速贴壁后种于12孔细胞培养板内,用无血清培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学对神经元β-ⅢTubulin行特异性荧光素染色,结合DAPI核染色鉴定神经细胞及其含量。结果该方法培养的脊髓神经元生长状态良好、密度适中,纯度较高,约83%。结论采用木瓜酶消化、差速贴壁及无血清培养的新生大鼠脊髓神经元符合体外实验的要求,为进一步进行相关实验提供目的细胞。     

Isolation, culture and identification of spinal cord neurons from neonatal rats

目的 通过对新生大鼠脊髓神经元分离、培养过程中细节的探讨,建立一种高效、稳定的大鼠脊髓神经元培养方法,为研究脊髓损伤相关的病理生理及其治疗提供种子细胞.方法 取新生SD大鼠的脊髓组织,通过木瓜酶消化制成单细胞悬液,经差速贴壁后种于12孔细胞培养板内,用无血清培养基培养,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫细胞化学对神经元β-ⅢTubulin行特异性荧光素染色,结合DAPI核染色鉴定神经细胞及其含量.结果 该方法培养的脊髓神经元生长状态良好、密度适中,纯度较高,约83％.结论 采用木瓜酶消化、差速贴壁及无血清培养的新生大鼠脊髓神经元符合体外实验的要求,为进一步进行相关实验提供目的细胞.     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的建立一种简便的新生大鼠皮层神经元的体外原代培养方法。方法取新生24 h内的大鼠,分离大脑皮层,消化后接种于L-多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶内,以含胎牛血清的DMEM高糖培养基为种植液,24 h后换用含有B27的Neurobasal的无血清培养基维持,倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光染色法鉴定皮层神经元纯度。结果接种后2 h,皮层神经元开始贴壁;随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞长出突起,神经元突起间逐渐开始交织成网。接种后7 d神经元胞体丰满,突起明显延长,相互间形成了明显的神经网络。经NSE免疫荧光技术鉴定神经元纯度为(93.57±3.9)%。结论该方法简单易行,可获得高纯度的大鼠皮层神经元。     

原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定

目的 建立原代海马神经细胞体外培养纯化及鉴定的优选方法.方法 取新生Wistar乳鼠,分离海马后在体外采用含血清结合无血清法进行培养,并用NSE、GAP-43、MAP2等海马神经细胞特异抗体经免疫细胞化学方法鉴定细胞性质及纯度.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,并长出突起,随时间增加,突起延长并交错形成网络,至第7～8天神经元形态最为成熟饱满,随后逐渐出现细胞老化,神经元最长可生存4周.经鉴定,海马神经元纯度达96%以上.结论 体外采用含血清和无血清法相结合进行原代海马神经细胞培养,细胞纯度高,杂细胞少,可为神经疾病体外研究提供必要细胞基础.     

大鼠海马神经元及星形胶质细胞的体外培养

目的：改进大鼠海马神经元、星形胶质细胞及两者混合状态的体外培养方法,获得高纯度的海马神经细胞。方法：选取孕期18~20 d 的SD 大鼠胎鼠作为原代海马细胞培养的材料来源。断头后于冰板上剥离双侧海马,去除表面血管及薄膜,利用眼科剪分离为小块。随后使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,将海马组织碎块移入酶消化液中。本方法选择Accutase 和0.1% DNase 作为酶消化液,37 ℃消化 15 min,期间轻柔振动。使用冷平衡盐溶液洗涤3 次,终止消化。0.1% DNase 加入Neurobasal 和B-27 的混合液对消化后的海马组织碎块进行轻柔吹打,获得单细胞悬液。将悬液过200 目筛,进行细胞计数。将过筛的单细胞悬液移入DMEM 培养基（DMEM+10%胎牛血清）中,按照每平方厘米2.5×104 的细胞密度进行接种。经PDL 孵育的塑料片置于培养基底部。细胞于37 ℃、5% CO2 培养箱内培养。4 h 后,依据所需细胞种类的不同,更换相应培养基。海马神经细胞于培养后7~10 d 可用于实验。结果：通过本方法可得到高纯度的大鼠海马神经细胞,且根据实验需求,通过更换培养基,可得到纯神经元、纯胶质细胞及两者混合的三种培养状态。培养的神经元及星形胶质细胞纯度均>98%。结论：该文在传统海马神经细胞体外培养方法基础上,进一步降低了实验操作难度,方法稳定有效。     

两种不同培养基对体外培养脊髓神经元的影响

目的建立体外稳定获取大数量及高纯度脊髓神经元的培养方案,比较当前国内外最常用的无血清培养基（Neurobasal+B27,NCM）与传统含血清培养基（DMEM/F12+10%胎牛血清+5%马血清,SCM）对体外培养脊髓神经元生长状态的影响。方法取E14 15?d Wistar大鼠的胚胎脊髓组织行胰酶消化获取脊髓神经元的单细胞悬液,分别用NCM与SCM进行培养,差速贴壁法及Ara C干预纯化培养的神经元。于接种后第1、2、3、4、5、6、7?d倒置相差显微镜下观察细胞生长状态的变化,并用免疫荧光细胞化学法比较两种培养基培养下获取的神经元纯度。结果采用NCM培养的脊髓神经元生长良好,对环境变化如换液及加入Ara C更为耐受;NCM培养的神经元的纯度为(87.70±8.70)%,SCM培养的神经元纯度为（78.61±7.00）%,前者纯度更高（P=0.019）。结论NCM较之SCM更加适合脊髓神经元的体外培养。     

海马神经元原代培养与纯度鉴定方法的优化

目的:通过优化和改进传统的神经元培养方法,探讨一个简单、高纯度的大鼠胚胎海马神经元的原代培养及活性检测方法。方法:颈椎脱臼处死孕鼠,迅速取海马,剥离血管网等结缔组织后,消化并吹打制成细胞悬液,以适当的密度接种入DMEM/HG培养基,4h后换用Neurobasal培养基,以后每2-3d进行1/3量换液。倒置显微镜观察神经元的形态变化,并采用CCK-8试剂盒检测神经元活性和神经元特异性烯醇化酶(NSE)鉴定神经元纯度。结果:细胞接种4h后贴壁,随着培养时间的延长神经元的形态发生一系列变化,从圆形、透亮、体积小逐渐变为椭圆形、三角形或椎形,有光晕,胞体增大,突起伸长且分支增多,在培养第4天后逐渐连接呈网络状。神经元纯度随时间的延长逐渐升高,培养第7天纯度高达90%以上。神经元在培养的第9、10天达到成熟,即可用于后续研究。结论:本实验方法简便易行,神经元纯度高、细胞活性好,体外存活时间长,是体外研究的良好实验模型,值得推广应用。     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．     

三种皮质神经元原代培养方法的改良及对比

目的：改良并比较机械分离法、胰蛋白酶消化法和木瓜蛋白酶消化法在大鼠皮质神经元培养中的优缺点,为研究工作者根据各自条件选择合适的培养方法提供理论依据。方法：采用胎龄为16-18天的SD大鼠胚胎,分别用机械分离、胰酶消化以及木瓜蛋白酶消化三种方法对SD胎鼠皮层神经元进行培养,并对不同培养时间的神经元进行形态学观察和免疫荧光显微镜纯度鉴定。结果：三种方法均能成功培养出杂质少且纯度高的皮层神经元,其在不同生长阶段具有典型的形态学特征。经NSE免疫荧光染色,神经元纯度分别在96.28%,95.63% 及97.34％,三组间无统计学差异(P>0.05)。结论：本实验改良并比较了三种皮质神经元的培养方法,三种方法均成功培养出杂质量较少且纯度高的皮层神经元,均可作为神经元体外培养的良好实验模型,且三种培养方法都有其不同的特点。     

特比萘芬的合成

目的：从番荔枝科植物圆滑番荔枝（annona glabra Linn.)树皮提取分离活性成分。方法：95％乙醇提取,溶剂萃取,硅胶柱层析,重结晶等。结果：分离到6个化合物,其中5个为贝壳杉烷型二萜,1个生物碱,5个二萜I,II,III,IV,V分别为（-)-kaur-16-en-19-oic acid,16a-hydro-19-acetoxy-ent-kauran-17-oic acid,(-)-kauran-19-al-17-oic acid,ent-19-carbomethoxykauran-17-oic acid,19-hydroxy-16a-(-)-kauran-17-oic acid,生物碱为xooglaucine.结论：萜IV ent-19-carbomethoxykauran-17-oic acid,,萜V 19－hydroxy-16a-(-)-kauran-17-oic acid和生物碱oxoglaucine为首次从该植物中分得。     

不使用免疫抑制剂大鼠胚胎后肾同种移植器官形成

目的:探索扩大器官移植供源,诱导免疫耐受的新途径.方法:在不使用免疫抑制剂的情况下,将远交系SD大鼠孕第14～19天(E14～E19)的胚胎后肾分组移植到行单侧肾脏切除的成年SD大鼠的腹腔,移植后4周开腹观察器官形成情况,并取标本进行生化和组织病理学检查.结果:植入大网膜28 d后,E18、E19胚胎后肾增大,但已被纤维结缔组织完全替代;E16、E17胚胎后肾移植后出现排斥反应,使用环孢霉素A者,E17胚胎后肾则发育良好;E14、E15胚胎后肾植入大网膜或残留肾蒂周围,发育的肾单位、集合管、输尿管结构正常,组织中少有淋巴细胞浸润;移植时宿主肾脏不切除而植入胚胎后肾,其后肾不发育;部分E15、E16胚胎后肾出现输尿管或肾盂积液现象,积液中尿素氮、肌酐值浓度与尿液中接近.结论:不使用免疫抑制剂的E14、E15组或使用环孢霉素A的E17组移植后肾在同种成年大鼠体内能够再血管化,并形成器官,显示其具有一定的泌尿功能.多种因素影响胚胎后肾的移植效果,但是排斥反应仍然是最主要的制约.     

Preoperative transarterial embolization of hypervascular vertebral tu mor with permanent particles

Objective To evaluate the safety and value of preoperative transarterial embolization of hypervascular vertebral tumors.Methods Sixteen patients with hypervascular vertebral tumors underwent transarterial embolization before surgery. The lesions were located between the middle cervical and lower lumbar spine. Forty-one arteries were embolized with permanent particles injected through a microcatheter, including polyvinyl alcohol (PVA) particles (150-500 μm) in 25 arteries and Dextran particles (150-350 μm) in 16. Of these, 31 had pieces of gelatin sponge added for proximal pedicled embolization. The criteria for judging the effectiveness of embolization were completeness of tumor removal and estimated blood loss during surgery.Results The particles were injected into the tumor feeders through superselection in 17 arteries or flow control in 24. Tumor embolization was defined as 'total' in five patients, 'nearly total' in eight, 'subtotal' in two, and 'partial' in another. There were no symptomatic complications associated with embolization. Tumors were entirely removed in all patients. The average estimated blood loss during surgery was 1510 ml (range of 200-6000 ml) for all 16 patients. Conclusion Preoperative embolization of hypervascular vertebral tumors is safe and effective. It can make complete resection of a tumor possible and can make a previously unresectable tumor resectable. Superselection or flow control is necessary to achieve effective devascularization and to avoid complications.     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

胆脂瘤性中耳炎根治术后Ⅰ期鼓室成形

目的：评估胆脂瘤根治术后Ⅰ期盛开菜的效果。方法：146例胆脂瘤根治后Ⅰ期鼓室成形中男65例。女81例，7-70岁，平均40.32岁；双侧耳10例，共156耳；占同期全部胆脂瘤手术228耳的67%。16耳胆脂瘤复发，听力未提高31耳，1-10年间均再次手术，随访0.5-10年，平均3.1年，结果：Ⅰ期手术后随访期内获得干耳146耳（90%），16下胆脂瘤复发，再次手术，85耳术后骨导差缩小10dB以上，另10耳手术前气骨导差小于10dB，且气导在40dB以内，术后听力仍保存，气骨导差没有扩大，此95耳（61%）为听力有效。另外61耳中16耳鼓膜连接不良。复发性胆脂瘤16耳再手术后随访0.5年以上，全部获干耳并保持，再手术后10耳963%）听力提高10dB以上或保持在术前的40dB水平以内，听力不良31耳再手术后26耳（84%）听力提高10dB以上，随访0.5年以上获得保持，另5耳因咽鼓管功能不佳，鼓室黏连听力短暂提高后恢复至术前。结论：胆脂瘤根治后Ⅰ期成形可使61%的患耳听力改善。通过补救手术可使84%的患耳听力改善，成功与病灶范围，医生技术水平，中耳通气状态相关。     

促性腺激素及雌二醇对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的:探讨取卵前给予孕马血清(PMSG)或人绒毛膜促性腺激素(HCG)以及在培养液中添加不同浓度雌二醇对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)及胚胎发育的影响。方法:将雌性小鼠随机分成5组,即24 h PMSG组(取卵前24 h给小鼠腹腔注射PMSG)、48 h PMSG组(取卵前48 h给小鼠腹腔注射PMSG)1、6 h HCG组(取卵前16 h给小鼠腹腔注射HCG)、PMSG+HCG组(给小鼠腹腔注射PMSG 48 h后腹腔注射HCG 16 h取卵)和未用药组。取未成熟卵丘-卵母细胞复合体(COCs)置入含不同浓度E2(0,0.5,1.0,2.0 mg/L)培养液中培养24 h,并行卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)及胚胎培养。比较各组之间卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率。结果:①24 h PMSG组和48 h PMSG组COCs的卵母细胞成熟率明显高于未用药组或16 hHCG组,差异有统计学意义(P<0.05)。PMSG+HCG组的受精率和卵裂率明显高于其他4组(P<0.01)。②与对照组比较,1.0 mg/L E2组和1.5 mg/L E2组中COCs的卵母细胞受精率和卵裂率明显增高(P<0.05)。各浓度17β-E2组间以及与对照组比较DO的成熟率和受精率无显著差异(P>0.05),但极少数受精卵发生卵裂。结论:①取卵前给予小鼠PMSG或者联合给与HCG均可促进卵母细胞体外成熟,但不能提高其早期胚胎发育能力;取卵前给予小鼠HCG不能提高卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育能力。②在培养液中添加一定浓度E2可促进未成熟卵母细胞胞质成熟,但不能促进核成熟。     

Assessment of left ventricular systolic synchronicity by real-time three-dimensional echocardiography in patients with dilated cardiomyopathy

Background Recent advances in real-time three-dimensional echocardiography (RT3DE) offer the potential to assess the left ventricular (LV) dyssynchrony simultaneously by analyzing the 17 segments time-volume curves. The purpose of this study was to test the feasibility and accuracy of RT3DE for quantitative evaluation of left ventricular systolic synchronicity.Methods Twenty-four patients with dilated cardiomyopathy (DCM) and twenty-five healthy volunteers were enrolled in this study. Full volume RT3DE was performed by using Philips IE33 with X3-1 probe. The global and 17-segmental time-volume curves were obtained by the on-line Qlab software (version 4.2). The time to minimal systolic volume in each segment (T(msv)) was taken to derive the following indexes of systolic asynchrony: T(msv) 16-SD, T(msv) 16-Dif, T(msv) 12-SD, T(msv) 12-Dif, T(msv) 6-SD and T(msv) 6-Dif, which meant the standard deviation or the maximal difference of T(msv) among the 16, 12 and 6 segments of the left ventricle respectively. The software also provided with each of the above parameters as a percentage of the cardiac cycle. Results T(msv) 16-SD, T(msv) 12-SD and T(msv) 6-SD were all significantly larger in the DCM group than those of the control group [T(msv) 16-SD: (52.9±40.6) ms vs (8.8±6.2) ms; T(msv) 12-SD: (29.5±30.8) ms vs (6.9±4.0) ms; T(msv) 6-SD: (28.9±34.6) ms vs (7.0±4.7) ms, all P≤0.001]. T(msv) 16-Dif, T(msv) 12-Dif and T(msv) 6-Dif were also significantly larger in the DCM group. There were close negative relations between the LVEF determined by RT3DE and each of the indexes of systolic asynchrony, among which the indexes of T(msv)-16-SD% and T(msv)-16-Dif% correlated most closely (r=－0.703 and r =－0.701, respectively). The DCM patients had significantly larger EDV and ESV, with significantly reduced LVEF compared with the healthy subjects. Conclusion RT3DE provides a simple, useful and unique approach to assess the systolic synchronicity of all the left ventricular segments simultaneously.     

细胞内游离Ca2+在发育中大鼠皮层神经元无镁诱导惊厥性损伤中的作用

目的: 观察细胞内游离Ca2+([Ca2+]i)在培养的不同发育阶段皮层神经元无镁诱导惊厥性损伤中的作用,探讨惊厥性脑损伤年龄依赖性的可能机制.方法:体外培养6 d、17 d的胚胎大鼠皮层神经元用无镁细胞外液处理3 h,或于无镁处理前用NMDA(N-甲基-D-门冬氨酸)受体拮抗剂或Ca2+通道阻滞剂预处理,用MTT代谢率测定的方法检测神经元损伤,以Fluo-3作标记用激光共聚焦显微镜扫描的方法检测[Ca2+]i.结果:体外培养6 d、17 d的神经元单纯无镁组MTT代谢率较同期对照组降低.应用MK-801 10 μmol*L-1、AP-5 50 μmol*L-1、尼莫地平10 μmol*L-1预处理后再给无镁处理,培养6 d、17 d的神经元MTT代谢率均不同程度高于同期单纯无镁组.培养6 d、17 d的神经元相对荧光强度之间差异有显著性,两者与基线荧光强度比较差异亦有显著性.应用上述各种拮抗剂后,[Ca2+]i改变的峰值均明显低于同期单纯无镁组.结论: 在体外不同发育阶段的神经元,短暂无镁处理诱导惊厥样放电所引起的神经元线粒体功能损伤以及[Ca2+]i改变程度不同.这种[Ca2+]i改变的年龄依赖性可能是惊厥导致神经元损伤的年龄依赖性的机制之一.NMDA受体-Ca2+通道激活是导致这种[Ca2+]i改变及神经元损伤的关键环节.     

DOAP方案治疗复发性及对常用化疗无效的急性白血病

采用DOAP联合方案治疗复发性及对常用化疗无效急性白血病31例(ALL16例,ANLL15例)。所有病例曾用HOAP、HOMP或COAP、COMP等方案治疗无效或缓解后复发。改用本方案疗效较好,完全缓解(CR)率51.6％,部分缓解率12.9％;其中复发性病例疗效更佳(CR11/16例68.8％)。CR16例中12例仅用一疗程即达到、3例用二疗程。中位CR时间8个月,中位存活期9.5个月。     

环孢素对大鼠同种胚胎后肾移植的影响

目的探讨环孢素对胚胎后肾在同种异体成年大鼠体内生长发育及功能发挥的影响。方法将实验组60只行单侧肾脏切除的成年SD大鼠按照使用CsA与否以及移植不同时期(孕后第15、16、17天,E15、E16、E17)的胚胎后肾随机分为6组(E15CsASD、E16CsASD、E17CsASDE15SD、E16SD、E17SD),每组10只,对照组30只SD大鼠同法分组,每组5只,宿主肾脏不切除。Lewis大鼠E15后肾移植到行单侧肾脏切除的成年BN大鼠大网膜(E15CsABN和E15BN),按照使用环孢素与否分为2组,每组15只。术后首日起,使用环孢素组受体大鼠以环孢素8mg·kg-1·d-1皮下注射;不使用环孢素组以等量的生理盐水皮下注射。移植后2～4周开腹观察器官形成情况,并进行组织病理学和后肾功能检查。结果(1)移植后28d,E16SD、E17SD组出现不同程度的排斥反应。E16CsASD、E17CsASD组后肾发育良好、无排斥反应;停用CsA后,原先发育良好的E16CsASD、E17CsASD后肾出现排斥反应。(2)移植后28d,E15SD后肾发育良好,无排斥反应,到100d检查时,发生排斥反应;移植后2周,E15BN组后肾即被完全排斥,而E15CsABN组后肾发育完好。E15CsABN组停用CsA后,原先发育完好的后肾被排斥。(3)移植时宿主肾脏不切除而植入后肾,其后肾不发育。(4)E15CsASD组移植后肾湿重、体积均小于E15SD组(分别为t=-3.74