核转录因子κB与前列腺癌

核转录因子κB(nuclearfactorofkappaB ,NF κB)是一种多极性核转录因子 ,参与调控多种与免疫反应、凋亡、炎症、肿瘤形成和转移有关的基因表达。近年来 ,NF κB在肿瘤发生、耐药、转移中的作用及其机制逐渐成为医学研究的热点。本文主要综述了NF κB的结构、生物学功能及其抗凋亡诱发肿瘤的机制 ,NF κB调控的前列腺癌相关基因的表达和调控 ,NF κB参与前列腺癌浸润与转移的机制及其在前列腺癌基因治疗中的可能策略等。     

核因子—κB与创伤

核因子－κＢ是调节基因转录的关键转录因子之一,在多种病理生理情况下都具有非常关键的作用,并与创伤也有密切关系。本文就创伤后核因子－κＢ活性的变化及其对创伤的影响方面研究进展作一综述。     

稳定阻断前列腺癌细胞中p65的shRNA基因序列的获得及蔓病毒载体的构建

目的 获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中核因子[NF-κB(p65)]表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3 3条针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5'向3'顺序依次为:酶切位点(BamH Ⅰ)、干扰序列(19bp)、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19 bp)、中止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR Ⅰ).将合成的序列插入空载体pSI H1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time聚合酶链反应(PCR)检测不同序列片段对p65的mRNA抑制效果,通过Western blot检测对p65蛋白表达的抑制效果.从而获得可以稳定高效抑制前列腺癌细胞中p65表达的shRNA序列.结果 设计的3条针对p65的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于p65(NM_021975)的1096～1113,茎环序列为5'-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTTTT G-3'.其对前列腺癌细胞株中p65的mRNA的干扰效率为59%,对其蛋白表达的抑制率为81%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中p65表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.     

核因子κB抑制因子α基因多态性与胃癌的相关性研究

目的研究核因子κB抑制因子“（NFκBIA）基因多态性及其与胃癌的相关性。方法采用PCR-RFLP方法检测171例胃癌患者（胃癌组）和152例正常对照者（对照组）的NFκBIA基因多态性分布。结果胃癌组和正常对照组NFκBIA基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。胃癌组NFκBIAG/G基因型（34%）高于正常对照组（25%）,而A/A基因型（13%）明显低于正常对照组（32%）,两组比较差异有统计学意义（均P〈0.05）。等位基因G与胃癌呈正相关（χ^2=11.871,P=0.0006,OR=1.751,95%CI1.281～2.394）,而等位基因A与胃癌呈负相关（χ^2=18.886,P=0.0001,OR=0.487,95%CI0.354～0.671）。结论NFκBIA基因多态性与胃癌有显著相关性。     

核因子—κB与急性胰腺炎

核因子—κB(nuclear factor—kappa B，NF—κB)是一种具有基因转录调节作用的核蛋白，调控多种炎性细胞因子的表达。它在急性胰腺炎中的作用日益引起人们的关注。本文就NF—κB的构成、活化途径、在急性胰腺炎中所起的作用，及其抑制剂的治疗价值等研究进展作一综述。     

核因子—κB与急性肺损伤

核因子-κB是一种对许多参与免疫与炎症反应等有关基因的表达具有调控作用的转录因子。其在急性肺损伤发病机制及诊疗中的作用已日益引起人们关注。本文就核因子-κB构成、活化、生物学效应及其在急性肺损伤中的作用作一综述。     

核转录因子—κB与炎性疼痛

本文介绍核转录因子—κB的构成、活化及生物学效应，探索它在炎性疼痛的发生、发展以及疼痛抑制中的作用和地位。力图建立核转录因子—κB与炎性疼痛之间的回路关系。     

核因子-κB活化受抑对TRAIL诱导前列腺癌细胞株PC-3M凋亡效能的影响

目的 观察二硫代氨基甲酸毗咯烷(PDTC)对核因子(NF)-κB活化的抑制作用,探讨PDTC对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导激素耐受型前列腺癌细胞株PC-3M凋亡的促进作用.方法 根据单用TRAIL(25、50、100 μg/L)或PDTC(25、50、100μmoL/L)或两者合用[25/25、25/50、25/100、50/25、50/50 PDTC(μmoL/L),TRAIL(μg/L)]等不同干预情况将PC-3M细胞分组,以细胞免疫组织化学和凝胶电泳迁移率(EMSA)检测法分析NF-κB核转位的活化情况,并通过MTY和流式细胞分选法研究PDYTC的参与对TRAIL诱导凋亡能力的影响.结果 EMSA和细胞免疫组织化学结果显示TRAIL单独诱导PC-3M细胞凋亡过程中引起NF-κB的显著活化,但是经PDTC预处理的PC-3M细胞中NF-κB的核转位受到抑制.导致其对细胞凋亡的保护作用丧失.检测凋亡显示PDTC作为NF-κB的强抑制物本身并不具有明显的细胞毒性,TRAIL+PDTC作用组的杀伤效应显著增强,远远超过单用TRAIL组对细胞的杀伤率(P<0.01).结论 TRAIL杀伤激素耐受型前列腺癌细胞的作用受到NF-κB活化的影响,抑制NF-κB活化可以显著增强TRAIL的凋亡诱导效用.     

核转录因子—κB与肾脏疾病

NF-κB是细胞内一个具有多向性调节作用的核转录因子,在细胞因子诱导的基因表达中起着关键性的调控作用。多种不同的刺激信号可激活核转录因子参与细胞生长、分化、粘附、凋亡及炎症反应。本篇NF-κB的性质及其与肾脏疾病的关系作一综述。     

靶向于前列腺癌特异性膜抗原shRNA的筛选与鉴定

目的 获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中前列腺癌特异性膜抗原(PSMA)表达的shRNA序列.方法 根据PSMA基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列,组建与之对应的4对互补的单链DNA序列,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5'向3'顺序依次为:酶切位点(BamH Ⅰ)、干扰序列(19 bp)、loop环(TrCAAGAGA)、干扰序列的反向互补序列(19 bp)、中止信号(TTTTT)、酶切位点(EcoR Ⅰ).将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time PCR检测不同序列片段对PSMA的mRNA抑制效果并通过Western blot检测对目的 蛋白PSMA的抑制效果.结果 设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好,目的 序列位于PSMA(NM_004476)的1207到1226,茎环序列为5'-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAATrcAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3'.其对前列腺癌细胞株中PSMA的mRNA的抑制率为60.0%,对其蛋白表达的抑制率为86%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达PSMA.结论 成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中PSMA表达的shRNA序列.     

NKX3.1短发卡RNA表达载体对NKX3.1基因表达的抑制作用

目的 研究同源框基因NKX3．1短发卡RNA（shRNA）表达载体在前列腺癌LNCaP细胞中对目的基因的沉默作用，为研究NKX3．1基因功能建立平台。方法 构建针对NKX3．1的shRNA质粒载体（pU6／NKX3．1-1和pU6／NKX3．1-2），并观察其介导LNCaP细胞中NKX3．1表达沉默的效果以及NKX3．1表达沉默对LNCaP细胞生长的影响。结果 构建的质粒pu6／NKX3．1—1和pU6／NKX3．1-2能够有效地抑制NKX3．1的表达，使NKX3．1mRNA和蛋白表达量显著下降，其中pU6／NKX3．1-2的效应高于pU6／NKX3．1—1，分别达到83．7％和72．1％。NKX3．1表达沉默能够使LNCaP细胞生长加快，细胞形态无明显改变。结论 成功构建NKX3．1特异性shRNA真核表达载体，使LNCaP中的NKX3．1表达下调，初步证明NKX3．1在LNCaP细胞生长中起非常重要的作用，为进一步深入研究NKX3．1基因的功能提供实验基础。     

沉默PAK6基因可抑制前列腺癌生长并增强多烯紫杉醇的作用

目的 观察沉默p21活化激酶6(PAK6)基因对前列腺癌生长及联用多烯紫杉醇的作用.方法 转染siRNA(30 nmoL/L)前列腺癌细胞PC-3和DU145中,检测细胞增殖、集落形成能力、侵袭性能力、细胞周期及凋亡.以3 x 106个PC-3细胞(100μl)注射裸鼠皮下成瘤,观察siRNA及联用多烯紫杉醇对肿瘤生长效应.结果 PAK6-siRNA能有效沉默PAK6并抑制前列腺癌细胞的生长、集落形成能力和侵袭力、使细胞周期停滞在G2/M期.还可抑制裸鼠体内移植瘤生长.PAK6-siRNA治疗组瘤体重为(146.0±8.5)mg,低于对照组(451.0±22.3)mg(P<0.01).PAK6-siRNA在体内外均可增强多烯紫杉醇作用.结论 沉默PAK6可抑制前列腺癌生长并增强多烯紫杉醇的化疗作用.     

RNA干扰封闭转化生长因子-β/Smad信号诱导人前列腺癌细胞PC-4凋亡

目的探讨RNA干扰技术（RNAi）封闭人前列腺癌细胞系PC-4中Smad4的表达以阻断转化生长因子（TGF）-β／Smad信号转导进而诱导细胞凋亡的机制。方法以RNAi特异性封闭PC-4中Smad4的表达，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot分别检测Smad4的表达，RT-PCR检测TGF-13／Smad信号通路下游分子Smad2／3的表达，并绘制细胞生长曲线。结果自RNAi后12h起，PC-4细胞中Smad 4mRNA表达量为封闭前的20％～68％，蛋白表达量为封闭前的8．0％～17．2％。Smad2／3mRNA表达量为封闭前的0％～52％，且细胞凋亡加速。结论抑制Smad4表达可以在-定程度上阻断PC-4细胞TGF-13／Smad信号的转导，进而促进细胞凋亡。     

沉默RANK真核表达载体的构建及有效干扰序列的筛选

目的构建沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK,筛选沉默RANK的最佳干扰序列。方法针对小鼠RANK基因设计并合成3对干扰序列,将其连接到真核表达载体pSuper上,酶切及测序鉴定正确后命名为pSuper-shRANK,后将其用脂质体瞬时转染小鼠骨髓巨噬细胞,用荧光显微镜观察转染情况,用Real-timePCR和Westernblot分析干扰效率。结果酶切分析与测序结果表明重组载体pSuper-shRANK构建成功,脂质体共转染后,Real-timePCR和Western blot分析结果显示shRANK-3干扰效果最好,干扰效率达88.7%,筛选出shRANK-3为最佳干扰序列。结论成功构建了沉默小鼠RANK基因的真核表达载体pSuper-shRANK;筛选出了沉默小鼠RANK的最佳干扰序列,为研究抑制该基因在破骨细胞分化及活化作用机制中奠定了基础。     

RNA干扰双位点抑制Survivin基因诱导雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究采用RNA干扰技术抑制雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中Survivin 基因的表达对PC-3细胞增殖及凋亡的影响。方法设计2条靶向Survivin mRNA的Survivin shRNA,克隆至同一质粒载体,并鉴定分析;质粒转染PC-3细胞,绘制细胞生长曲线;并于转染48 h 后进行Survivin基因蛋白表达及细胞凋亡检测。结果酶切鉴定、测序分析证实负载双片段Sur- vivin shRNA的质粒载体构建成功。转染PC-3细胞后,细胞生长曲线示实验组PC-3细胞增殖明显受抑制;转染后48 h．实验组、阴性对照组、空白对照组Survivin蛋白表达强度分别为(4．62± O．84)％、(38．83±7．96)％和(40．98±3．83)％,实验组与两对照组相比差异均有显著性意义(P< 0．05);转染48 h后PC-3细胞凋亡率开始增加。结论负载双片段Survivin shRNA的质粒载体转染PC-3细胞后能明显抑制PC-3细胞增殖,抑制PC-3细胞Survivin蛋白表达,并能诱导PC-3细胞凋亡。但诱导PC-3细胞凋亡最明显的时机需要进一步观察。     

RNA干扰靶向抑制表皮生长因子受体表达对大肠癌细胞增殖的影响

目的观察RNA干扰（RN加）技术能否有效抑制大肠癌LoVo细胞株表皮生长因子受体（EGFR）的表达以及对细胞增殖的影响。方法构建质粒表达载体pU6-EGFR-shRNA-1和pU6-EGFR-shRNA-2；脂质体瞬时转染后24、48、72、96、144h实时荧光定量PCR（Real Time PCR）和Western blot检测EGFR表达，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，并绘制细胞生长曲线；分5组：A组：Lov0细胞组；B组：Lipofectamine2000组；C组：对照载体HK组；D组：pU6-EGFR-shRNA-1组；E组：pU6-EGFR-shRNA-2组。结果D组E组细胞转染shRNA后mRNA和蛋白表达降低，G0～G1期细胞增加，S期细胞减少，细胞凋亡率增加，对数生长期延迟，以48h效果最显著，和A组B组C组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；但随着时间的推移其干扰作用降低。结论两条EGFR-shRNA均可有效抑制大肠癌LoVo细胞EGFR表达，阻滞更多的细胞位于Go～G1期，促进细胞凋亡而抑制细胞增殖。     

畸胎瘤细胞源性生长因子shRNA增强胰腺癌细胞株Panc-1对健择敏感性的研究

目的 通过转染针对畸胎瘤细胞源性生长因子(PCDGF)shRNA至胰腺癌细胞株Panc-1中,观察对健择敏感性的变化,分析PCDGF因子对化疗药物敏感性的影响.方法 免疫组织化学和定量聚合酶链反应(PCR)测定PCDGF在胰腺癌组织中的表达,构建含2条shRNA的RNAi质粒,脂质体转染PCDGF shRNA至Panc-1,测定转染前后细胞对健择敏感性的变化.结果 PCDGF表达于多数胰腺癌细胞的细胞质中(阳性率为84.5%),显示胰腺癌组织PCDGF的表达明显高于胰腺囊腺瘤和胰腺炎(t=11.41,P<0.05),构建PCDGF shRNA质粒经脂质体转染后PC-DGF的表达显著受到抑制(抑制率为82.3%),在较高浓度时,健择的细胞毒作用明显增强.结论 针对PCDGF的shRNA能显著增加Panc-1对健择的敏感性.     

CTGF shRNA表达质粒的构建及对大鼠肌源性干细胞CTGF表达的影响

目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)所构建的短发卡RNA(shRNA)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)表达CTGF的影响.方法 针对CTGF mRNA上的序列,体外合成表达shRNA的DNA质粒载体pGenesil-3-shRNA并行测序鉴定;从新生SD大鼠骨骼肌中分离培养MDSCs并鉴定.实验分成对照组(MDSCs+TGF-β1培养),实验组(MDSCs+ TGF-β1+pGenesil-3-shRNA培养).观察shRNA质粒转染结果.利用Real-Time PCR及Western Blot检测CTGF mRNA和CTGF蛋白表达.结果 正确构建了靶向CTG,F基因的质粒载体pCenesil-3-shCTGF;大鼠MDSCs 48 h、72h和96h时实验组的CTGF mRNA及蛋白质水平均低于对照组(P＜0.05).结论 针对CTGF构建的pGenesil-3-shCTGF能够转染MDSCs,并在48h、72h和96h时能明显降低TGF-β1刺激MDSCs所产生CTGF的表达.