pEGFP-C2基因因转染恒河猴骨髓源神经干细胞的实验研究

目的 探讨恒河猴骨髓基质源神经干细胞进行基因修饰的可行性。方法 分离恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)，体外培养，bFGF诱导增殖，细胞生长至神经干细胞期时以Nucleofector^TM核转染仪行pEGFP—C2转染，倒置荧光显微镜观察基因表达情况，并检测细胞的活力。另外，对同期培养的未转染细胞进行神经干细胞特异性抗原-nestin和CD133抗原的免疫细胞化学检测。结果 分离得到的BMSCs能在体外培养液中进行增殖和分化．而在bFGF诱导的情况下．细胞的增殖更为明显；转染pEGFP—C2的细胞于转染后24h后即表达强绿色荧光蛋白，转染率达30％以上，且细胞的活力基本不受影响；免疫细胞化学检测可见有nestin和CD133抗原在同期培养的未转染细胞内表达。结论 灵长类骨髓基质细胞具有向神经干细胞分化、增殖的能力，bFGF能促进细胞的增殖，在神经干细胞培养条件下，可发育分化成神经干细胞；在神经干细胞阶段，应用电转染技术进行神经干细胞基因修饰是可行的，可应用于骨髓基质源神经干细胞的基因治疗领域。     

骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗脑干损伤初步观察

目的探索骨髓基质细胞源神经干细胞对脑损伤的治疗作用。方法将犬自体骨髓基质细胞在体外扩增并经BrdU标记及预分化处理后,通过脑室或循环途径将其植入脑干损伤模型组及对照组动物脑内或体内,并通过组织学方法观察其在损伤脑区及其它脑区的分布情况。结果骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗组(C、D组)BrdU阳性细胞在脑损伤区的分布明显多于(P<0.05)对侧非伤区、对照组(A组及B组)同部位、及其它非损伤脑区。结论骨髓基质细胞源神经干细胞对损伤脑区有亲合性;骨髓基质细胞源神经干细胞可通过向损伤脑区的迁移而发挥治疗作用。     

GAD65基因转染神经干细胞的实验研究

目的检测神经干细胞经谷氨酸脱羧酶（GAD65）基因转染并诱导分化后γ-氨基丁酸（GABA）的表达,为GAD65基因修饰神经干细胞移植治疗癫痫提供理论依据。方法采用新一代高效脂质体作为转染试剂的基因转导方法转染神经干细胞,通过免疫细胞荧光方法鉴定神经干细胞分化为GABA阳性神经元情况。结果采用脂质体转染方法能成功地将GAD65基因转染至神经干细胞中,转染的神经干细胞在分化第7天及第14天GABA阳性神经元分别占（31．9±4．2）％、（26．5±2．3）％,未转染的神经干细胞分化的GABA阳性神经元则分别占（28.4±1．9）％和（20．3±3．5）％,转染者与未转染者相比,分化的GABA阳性神经元百分比有显著性差异（P〈0．05）。结论采用脂质体基因转染技术,可以将GAD65基因转染至神经干细胞中,并促进神经干细胞分化为GABA神经元。     

骨髓基质干细胞神经分化潜能的研究

骨髓存在两种干细胞，一种是造血干细胞，一种是骨髓基质细胞（ＢＭＳＣｓ），ＢＭＳＣｓ具备干细胞的性质。骨髓基质系统中，不同的终末分化细胞的细胞表型可以相互转化，即所谓的反分化和跨化。在使用一定的诱导剂后，ＢＭＳＣｓ能够表现为神经细胞的形态，同时可以表达神经细胞的特异性标记物。基因芯片分析也揭示了ＢＭＳＣｓ的这种潜能，同时发现造血系统的形成和神经系统形成之间存在着共性。这些研究均揭示了ＢＭＳＣｓ的神经分化潜能，为治疗多种中枢神经系统疾病开启了一扇大门。     

神经干细胞诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化

目的：研究骨髓基质细胞向神经元样细胞分化的条件。方法：神经十细胞诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化，免疫细胞化学方法对分化的和未分化的细胞进行鉴定。结果：神经于细胞可诱导骨髓基质细胞向神经元样细胞分化，分化的细胞表达神经元的标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论：骨髓组织中存在能分化为神经元的于细胞，可能成为中枢神经系统自体移植的于细胞的来源。     

猫骨髓源性神经干细胞诱导分化的实验研究

目的探讨猫骨髓分离培养、诱导分化神经干细胞的可行性。方法无菌条件下行骨穿,梯度密度离心获取猫骨髓基质细胞,以“神经干细胞培养基”培养,用分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果猫骨髓基质细胞在相应培养条件下能在体外培养中增殖、分化,克隆形成细胞球(或称“神经球”),这些细胞球能表达神经干细胞特异性抗原nestin,而且能进一步诱导分化出胶质样细胞和神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有胶质源性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原表达。结论猫骨髓基质细胞在一定条件诱导下可分化成神经胶质样和神经元样细胞。     

猫骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的实验研究

目的观察猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况。方法从猫的骨髓中分离得到骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal cells．BMSC），在体外给予神经干细胞培养基培养，增殖后用分化诱导因子(维甲酸，Retinoic acid，RA)进行诱导分化．倒置相差显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大，镜下可见丰富的胞浆颗粒，继之出芽，贴壁生长，可形成克隆团，同时可传代培养。这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原nestin，而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞。结论猫骨髓基质细胞具有干细胞特征，在合适的条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞，它们可考虑作为神经系统功能缺失细胞移植治疗的种子细胞来源。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

神经胶质瘤诱导骨髓基质干细胞定向迁移的初步研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)对神经胶质瘤的定向迁移能力及其在脑内的分布规律. 方法 从雄性Wistar大鼠股骨和胫骨中分离出BMSCs并进行传代培养,采用免疫荧光检测BMSCs表面抗原并将其向脂肪细胞和成骨细胞方向诱导分化.证明BMSCs性质.立体定向接种C6胶质瘤细胞于Wistar大鼠脑内基底节区以建立鼠腩胶质瘤模型,7 d后将5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记的BMSCs接种入鼠脑对侧半球、对侧脑室和鼠尾静脉.BMSCS移植14d后心脏灌注取脑制成石蜡切片.以HE染色确定胶质瘤性质.SABC法免疫荧光染色显示BMSCs对神经胶质瘤组织的定向迁移能力及其在脑内的分布规律. 结果 对侧半球组和对侧脑室组均可见移植的BMSCs多沿针道直线分布并向对侧胶质瘤迁移.在胶质瘤与正常脑组织交界处可见激发出绿色荧光的阳性BMSCs:鼠尾静脉组亦可见少量BMSCs阳性细胞分布在胶质瘤组织周围. 结论 BMSCs通过脑实质、脑室及静脉注射途径均可定向迁移到胶质瘤组织,提示BMSCs可作为一种新的细胞载体用于胶质瘤的基因治疗.     

人类GAD67基因扩增及pEGFP-C2-GAD67真核表达载体的构建

目的扩增人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因，并构建pEGFP-C2-GAD67真核表达载体。方法应用基因重组技术，采用反转录PCR方法对来自人类脑组织cDNA中编码GAD67的基因片段进行扩增，插入PUC57克隆载体，经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切出GAD67基因片段，再克隆入真核表达载体pEGFP-C2后构建pEGFP-C2-GAD67重组载体，经PCR扩增、酶切后测序鉴定。结果人类GAD67基因扩增产物大小为1785bp，编码594个氨基酸残基。重组真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，PCR正确扩增出目的条带。与GenBank中人类GAD67基因序列比较，核苷酸和氨基酸水平的同源性分别达99．78％和99．66％。结论人类GAD67基因克隆后，可成功构建真核表达载体pEGFP-C2-GAD67为进一步该基因转染神经干细胞移植治疗癫痫提供了实验基础。     

诱导成人骨髓基质细胞成为神经干细胞及其分化的实验研究

目的　体外诱导成人骨髓基质细胞 (BMSCs)转化为神经干细胞 (NSCs)进而分化为神经元和胶质细胞。方法　以含有碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)或表皮生长因子 (EGF)加 b FGF或 b FGF、EGF加全反式维甲酸 (ATRA)的培养液培养 BMSCs,进行显微镜观察 ,纤维连接蛋白 (fibronectin)、I型胶原 (collagen )和神经上皮干细胞蛋白 (nestin)免疫组织化学染色和神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫荧光染色。结果　经诱导物诱导 72 h后 ,fibronectin和 collagen I免疫阳性细胞减少。nestin免疫阳性细胞增多。 7d后 ,其又减少。同时 NSE和 GFAP免疫阳性细胞增多。细胞分化后 ,NSE阳性细胞最多占细胞总数的 2 4 .76 %±2 .72 % ,同时 GFAP阳性细胞占细胞总数的 36 .5 8%± 3.2 6 %。结论　 EGF、b FGF、ATRA及适宜的培养液可使BMSCs定向 ,转化为 NSCs,进而分化为神经元和胶质细胞。     

高海拔地区骨髓源神经干细胞及BDNF联合移植对大鼠缺血再灌注模型的治疗

目的 探讨高海拔地区大鼠骨髓源神经干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells,BMSCs-NSCs)及脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)联合移植对大鼠脑缺血再灌注模型的疗效及其相关机理。方法 60只Wistar雄性大鼠,置西宁地区正常饲养,制备大鼠脑缺血-再灌注损伤模型; 模型制备完毕后立体定向下进行细胞移植治疗,将大鼠分为3组,即A组:大鼠骨髓源性神经球组(BMSCs-NSCs组,n=20); B组:大鼠骨髓源性神经球联合BDNF组(BMSCs-NSCs+BDNF组,n=20),注射大鼠骨髓源性神经球细胞的同时,联合注射100 ng BNDF; C组:对照组(仅注射DMEM/F12培养基,n=20); 术后对其神经功能进行评定,并于术后24 d取脑组织,行Nestin、GFAP、Map2免疫荧光检测。结果 细胞移植后第3 d,各组间神经功能评分无显著性差异; 细胞移植后第14 d BMSCs-NSCs+BDNF组神经功能评分显著优于BMSCs-NSCs组,BMSCs-NSCs组优于对照组; 免疫组化检测发现,BMSCs-NSCS+BDNF组Nestin、GFAP、Map2的IOD值均显著高于BMSCs-NSCs组; BMSCs-NSCs+BDNF组、BMSCs-NSCs组各检测指标水平均高于对照组; Nestin、GFAP、Map2的表达主要集聚于脑梗死灶与正常脑组织交界处。结论 在西宁地区联合移植大鼠骨髓源神经干细胞及BDNF可显著促进大鼠大脑中动脉闭塞再灌注损伤模型的神经功能恢复。     

骨髓间充质干细胞源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性

目的探索骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性神经细胞对C6胶质瘤的趋向性。方法阿尔法最低必需培养基(α-MEM)、神经细胞生长添加剂B27、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)和全反式维甲酸(ATRA)诱导BMSCs向神经细胞分化。体外通过Transwell系统共培养BMSCs源性神经细胞与C6胶质瘤细胞培养基,HE染色分析穿过聚醋酸纸膜微孔的细胞数量;体内在C6胶质瘤模型中移植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记的BMSCs源性神经细胞,免疫组化分析移植细胞的迁移能力。结果条件培养基诱导BMSCs分化的细胞表达神经元核抗原(NeuN)为47%±0.08%,高分子量神经丝蛋白(NF-H)为45%±0.07%及部分巢蛋白(Nestin)为10%±0.04%,体外Transwell结果显示BMSCs源性神经细胞透过聚碳酸酯膜微孔的数量明显高于对照组(P<0.05),体内移植结果显示BMSCs源性神经细胞与BMSCs对胶质瘤的迁移无明显差异(P>0.05)并呈现时间特异性(P<0.01)。结论 BMSCs源性神经细胞对C6胶质瘤有明显的趋向性。     

骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元的影响

采用细胞共培养方式和免疫化学染色方法 ,研究骨髓基质细胞对神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的影响。实验发现 ,体外培养的中脑神经干细胞在与成年大鼠骨髓基质细胞共培养 7d后 ,在神经干细胞后代中神经元比例可达 38.6 %± 10 .8% ,明显高于自然分化组 2 0 % ,提示骨髓基质细胞提供的微环境可明显提高神经干细胞后代中神经元的比例。     

The effect of bone marrow stromal cells on neuronal differentiation of mesencephalic neural stem cells in Sprague-Dawley rats

There are numerous parallels between the heamatolymphopoietic and nervous systems in terms of the mechanisms regulating their development. We proposed that neural stem cells (NSCs) may respond to the microenvironmental signals provided by bone marrow stromal cells (BMSCs) which regulate the differentiation and maturation of hematolymphopoietic stem cells. First, we isolated and proliferated BMSCs from the femur and tibia, and NSCs from the midbrain of Sprague-Dawley (SD) rats, and then investigated the effects of BMSCs on the differentiation of NSCs into neurons, astrocytes and oligodendrocytes by directly plating neurospheres on BMSC monolayers in serum-free conditions. The results confirmed that BMSCs induced NSCs to differentiate selectively into neurons. The percentage of neurons significantly increased in 7 days in vitro co-cultures of NSCs and BMSCs as compared to NSCs cultures alone. When the duration of the cultures was extended to 12 days in vitro, BMSCs enhanced the survival of neurons derived from these NSCs; our investigation then focused on the underlying mechanism for this effect of BMSCs. NSCs were cultured with BMSC conditioned-medium and co-cultured with membrane fragments of live BMSCs or paraformaldehyde fixed BMSCs, the inducing activity of BMSCs was solely detectable in BMSC conditioned-medium, indicating that soluble factors secreted by BMSCs were responsible for its effect on the neuronal differentiation of NSCs. Therefore, BMSCs may provide a powerful tool for therapeutic neurological applications.     

骨髓基质细胞诱导后与神经细胞的比较研究

目的 通过体外诱导骨髓基质细胞（BMSCs)与神经细胞作比较。探索BMSCs体外诱导分化为神经细胞的可行性。方法 应用bFGF,BHA,EGF,Forskolin等配成诱导前剂，诱导剂和长期诱导剂，对大鼠BMSCs进行诱导，全程观察其变化，并聚诱导后4d细胞行神经元特异烯醇化酶（NSE），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组化染色和Western Blot检测，与大鼠脊髓来源的神经细胞对比。结果 BMSCs诱导前后细胞形态。免疫组化，West-ern Blot检测有明显区别；诱导后细胞与神经细胞极为相似；诱导后细胞13-17d凋亡。结论 BMSCs诱导前后细胞形态，生长，凋亡和NSE，GFAP表达变化支持BMSCs可以体外诱导成神经细胞。     

人骨髓基质细胞分化为神经细胞潜力的研究

目的研究骨髓基质细胞在含血清培养基中向神经细胞分化的潜能.方法从健康人肋骨分离原代骨髓基质细胞,接种于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中,分为A组(3～4 d换液一次)、B组(不换液),在相差显微镜下观察生长情况.在培养的1,5,10 d用免疫荧光法检测两组骨髓基质细胞的各种表面标志物巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白(MAP-2)、S-100表达情况.并在培养的第1,4,7,10,13 d用酶联免疫吸附法(ELISA)检测 B组培养细胞上清中的脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的分泌水平.结果 A组细胞分裂繁殖速度明显高于B组,在培养的第11～12 d,B组中部分细胞表现为胞体锥形并有长突起的神经元样形态,且形成网状.A组中随着培养时间的延长仅仅有nestin表达增加 ,B组中Nestin, GFAP, MAP-2的表达随时间的不同有差异,S-100在体积较小的细胞表达较强.B组细胞培养的第10d,检测到BDNF的表达,培养第7,10,13 d检测到NGF分泌.结论人骨髓基质细胞在含血清培养基中能够表达神经前体细胞和神经细胞的相关表面标志物,并且能够分泌一定水平的神经营养因子,表现出可分化成神经细胞的潜能.血清和骨髓基质细胞自身分泌物质的蓄积可能在其中起到了重要的作用.     

骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的动态影响

目的探讨骨髓基质细胞源神经干细胞对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及相关蛋白表达的影响。方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。32只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组、缺血对照组、缺血骨髓基质细胞移植组和缺血骨髓基质细胞源神经干细胞移植组。分别在移植后7d和14d行脑灌注固定取材,应用免疫组化染色及原位细胞凋亡检测脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达及凋亡细胞数。结果缺血移植组各时点的凋亡细胞数均少于缺血对照组(P<0.01),缺血移植14d组凋亡细胞数明显少于缺血移植7d组(P<0.01),骨髓基质细胞源神经干细胞移植组凋亡细胞明显少于骨髓基质细胞移植组(P<0.05)。缺血移植组Bcl-2表达显著高于缺血对照组(P<0.01)。缺血移植组Bax蛋白表达明显低于缺血对照组(P<0.01)。结论骨髓基质细胞源神经干细胞可能通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。     

骨髓基质细胞源神经干细胞移植对脑出血大鼠行为及神经细胞凋亡的动态影响

目的 探讨骨髓基质细胞源神经干细胞对实验性脑出血大鼠行为及神经细胞凋亡的影响.方法 采用自体血注入法建立大鼠脑出血模型.32只健康Sprague-Dawley(SD)大鼠分为假手术组、出血对照组、出血骨髓基质细胞移植组和出血骨髓基质细胞源神经干细胞移植组.分别于移植后1d、7d、14d对大鼠进行神经功能缺损评分和空间学习能力检测,并在移植后7d和14d,分别应用TUNEL法检测神经细胞凋亡.结果 移植后7d各组神经功能均有不同程度的恢复(P<0.05),BMSCs源神经干细胞移植组大鼠的神经功能评分显著优于BMSCs移植组(P<0.01).移植7d后可提高大鼠空间学习能力,且各时间点BMSCs源神经干细胞移植组的空间学习能力改善优于BMSCs组(P<0.05).BMSCs源神经干细胞移植组出血边缘区凋亡细胞数明显少于BMSCs移植(P<0.05).结论 骨髓基质细胞源神经干细胞移植可改善脑出血大鼠神经行为,减少神经细胞凋亡,显著优于BMSCs移植.

Abstract：

Objective To study the effects of bone marrow stromal cells ( BMSCs) derived neural stem cells on behavior and celluar apoptosis in experimental intracerebral hemorrhage (ICH) . Methods The model was established by ster-otactic infusing autologous caudate artery blood into right nucleus caudatus of SD rats. 32 Sprague-Dawley rats were divided into sham-operated group,ICH control group,BMSCs transplanted group and BMSCs derived neural stem cells transplanted group. The neurogenic behavior of the rats were evaluated on 1,7,14 days after transplantation. The rats were killed separat-edly on 7,14days after transplantation. The brain sections were used for TUNEL staining. Result The neurological function of rats were recovery on 7 days later after transplantation( P < 0. 05 ) . The recovery of neurological function in BMSCs derived neural stem cells transplantation group was much evidentl than BMSCs transplantation group( P < 0. 01). The abilities of spatial learning and memory of rats on 7 days later after transplantation got improved (P < 0. 05). More satisfactory outcome got in BMSCs derived neural stem cells transplanted group than in BMSCs transplanted group ( P < 0. 05 ) . The number of apoptotic cells in the group of BMSCs derived neural stem cells transplanted group decreased evidently compared with that of the BMSCs transplantation group (P <0.05). Conclusion BMSCs derived neural stem cells may make the neurogenic behavior recovery, and decrease the infarct volumes and the number of apoptotic cells in ICH.