LPS、TNF-α、IL-1β对人脐静脉内皮细胞COX-2表达的影响

目的:探讨LPS、TNF-α、IL-1β对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)环氧合酶2(COX-2)表达及前列腺素(PGs)的影响。方法:在分离培养的HUVEC细胞给予LPS、TNF-α、IL-1β刺激24h后,采用原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化检测HUVECCOX-2mRNA及蛋白的表达并观察了培养液前列腺素(PGs)的变化。结果:静息状态的HUVEC表达极少量的COX-2;受炎性刺激后,HUVEC大量表达COX-2mRNA及蛋白,同时伴有PGs的升高。结论:结果提示,静息状态下HUVEC表达极少量的COX-2,炎性刺激可诱发COX-2高表达和PGs升高,因此内皮细胞可通过COX-2的调节参与炎症反应。     

热休克蛋白参与NF-κB介导的H2O2预处理的细胞保护作用

目的探讨热休克蛋白(HSP)是否参与核因子-κB(NF-κB)介导的H2O2预处理的细胞保护作用。方法应用碘化丙啶(PI)染色流式细胞技术(FCM)检测细胞凋亡率,免疫印迹法(Westernblot)测定NF-κB的表达水平,免疫细胞化学染色法测定NF-κB的核转移。结果100μmol/LH2O2预处理PC12细胞90min可显著地抑制300μmol/LH2O2引起的细胞凋亡,并可明显地上调PC12细胞NF-κB的表达及促进NF-κB的核转移,同时也能上调HSP70和HSP90的表达。NF-κB的抑制剂TPCK阻断NF-κB表达,并显著地阻断H2O2预处理的细胞保护作用及HSP70和HSP90的表达。结论HSP70和HSP90参与NF-κB介导的H2O2预处理的适应性细胞保护作用。     

热休克蛋白在子宫内膜异位症中的表达及意义

目的 探讨热休克蛋白27（HSP27）和HSP70在子宫内膜异位症发病中的作用。方法 采用免疫组化链霉菌抗生素蛋白－过氧化物酶染色法（SP法），检测子宫内膜异位症中56例异位内膜与在位内膜（30例）中HSP27和HSP70的表达。采用原位杂交，检测HSP70mRNA的水平，并与正常子宫内膜相比较。结果 免疫组化结果显示，异位内膜组织中HSP27与HSP70均呈高表达，与正常内膜组的表达差异显著（P＜0．01），而且失去其在正常内膜组织中表达的周期性变化。卵巢子宫内膜异位症组（OEM）与子宫腺肌症组（AM）组中，HSP27和HSP70的表达无显著差异（P＞0．05）。原位杂交结果显示，HSP70 mRNA（分别为P＜0．01和P＜0．05）。HSP27与HSP70的表达水平，同OEM的严重性无关。结论 异位内膜组织中的HSP70基因被激活，转录增加。HSP27和HSP70呈高表达，可能在EM的发病中起重要作用。     

大鼠原代肾小管上皮细胞上IL-18Rα、β链的表达

目的:检测培养的大鼠原代肾小管上皮细胞(renal tubularepithelialcells,RTECs)是否表达IL-18Rα和IL-18RβmRNA。方法:以肾小管节段贴块法进行原代RTECs的培养。用免疫细胞化学染色法鉴定细胞的类型,用RT-PCR检测RTECs中IL-18RαmRNA及IL-18RβmRNA的表达。结果:免疫细胞化学染色法证实,原代培养的细胞均为RTECs,并表达IL-18RαmRNA和IL18RβmRNA。结论:在RTECs中有IL-18RαmRNA和IL-18RβmRNA的表达,为探讨IL-18R在肾间质纤维化中提供了实验依据的作用。     

Ghrelin通过ERK1/2磷酸化上调HSP70发挥细胞保护作用

目的:探讨细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellcular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)信号转导通路在ghrelin上调热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)表达及抑制氧化应激诱导PC12细胞凋亡中的作用。方法:采用硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)诱导PC12细胞构建氧化应激损伤模型;实验分为SNP损伤组(0.5 mmol/L SNP分别孵育PC12细胞6 h、12 h、18 h和24 h),ghrelin预处理组(加SNP前30 min给予100 nmol/L ghrelin),HSP70抑制剂组[ghrelin处理前60 min加入10μmol/L槲皮素(quercetin)],ERK阻断剂组(ghrelin处理前60 min加入ERK1/2抑制剂PD98059)和对照组(只加入等量的培养液);利用流式细胞术检测细胞凋亡率,通过Western blot和免疫细胞化学染色法检测蛋白表达的变化。结果:(1)与对照组比较, SNP损伤组PC12细胞的凋亡率显著增加(P0.05);(2)与SNP损伤组比较,100 nmol/L ghrelin预处理可显著抑制SNP诱导的PC12细胞凋亡(P0.05),且显著上调HSP70蛋白表达(P0.05);(3)时-效分析表明,SNP损伤后18 h, ghrelin上调HSP70表达的作用最为显著。使用HSP70抑制剂quercetin可显著削弱ghrelin的抗凋亡作用(P0.05);(4)Ghrelin预处理促进ERK1/2的磷酸化。ERK1/2抑制剂PD98059可显著削减ghrelin对HSP70表达的上调作用(P0.05)。结论:Ghrelin可通过促进ERK1/2磷酸化上调HSP70的表达,进而抑制氧化应激诱导的PC12细胞凋亡。     

内毒素脂多糖诱导培养的人脐静脉内皮细胞表达巨噬细胞炎性蛋白-1α

目的了解内毒素脂多糖是否诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)。方法使培养的HUVEC暴露于不同浓度的脂多糖,用地高辛标记的MIP-1αcDNA探针与HUVEC的总。RNA进行斑点杂交,并与HUVEC进行原位杂交,同时用HUVEC的总RNA与MIP-1α引物的混合物进行逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR),以检测HUVEC的MIP-1αmRNA的表达;再者,将培养的HUVEC用MIP-1α单克隆抗体进行细胞酶联免疫吸附试验(ELISA),以检测其MIP-1α蛋白表达。结果斑点杂交显示,暴露于浓度为1μg／,ml和10μg／,ml脂多糖时HUVEcmRNA在硝酸纤维素膜上斑点的积分吸光度(A)值分别为1．490和3．310,分别为对照组(0．775)的1．97倍和4．38倍。原位杂交显示,当HUVEC暴露于浓度为1μg／,ml脂多糖后,其MIP-1α mRNA表达与对照组相比有明显增加,方差分析表明,差异有非常显著性(F=142．83,P＜0．01)。但当其暴露于10μg／ml脂多糖后,其MIP-1α mRNA表达则较低。RT-PCR显示,暴露于浓度为1、5和10μg／ml脂多糖时HUVEC的MIP-1α mRNA表达分别为对照组的1．65倍、2．86倍和1．26倍。细胞ELISA显示,各组HUVEC暴露于脂多糖后,其MIP-1α蛋白表达均明显增加,尤以5μg／ml脂多糖组最为显著。方差分析表明,差异有显著性(F=15．36,P＜0．05)。结论内毒素脂多糖可诱导培养的HUVEC表达高水平的MIP-1αmRNA和蛋白,从而在动脉内膜的单核／巨噬细胞的募集起重要作用。     

致死剂量微波辐照后小鼠肝超微结构及HSP70表达的变化

目的观察致死剂量微波辐照后小鼠肝超微结构及热休克蛋白70(HSP70)表达的变化,探讨其在法医学鉴定中的意义。方法将昆明种小鼠分为正常对照组和辐照组,辐照组小鼠采用峰值功率密度为129 W/cm~2的微波全身一次辐照30 min致小鼠死亡后,立即用透射电镜观察小鼠肝的超微结构变化;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小鼠肝HSP70 mRNA表达变化,免疫印迹法检测小鼠肝HSP70蛋白表达变化。结果致死剂量微波辐照后小鼠肝细胞胞浆点片状溶解,线粒体嵴和膜溶解消失;HSP70 mRNA和蛋白水平表达显著上调,与正常组对照比较,差异具有极显著统计学意义(P0.01)。结论微波辐照致死可导致小鼠肝细胞胞浆溶解、线粒体损伤、HSP70 mRNA和蛋白水平表达明显上调,可作为微波辐照致死鉴定的重要参考指标。     

RNAscope原位杂交技术在胃癌PD-1、PD-L1表达分析中的应用

目的 探讨RNAscope原位杂交技术在检测胃癌程序性死亡受体-1(programmed death 1, PD-1)及程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)表达中的应用价值。方法 利用RNAscope原位杂交技术检测255例胃癌中PD-1、PD-L1 mRNA表达水平;应用免疫组化EnVision法检测255例胃癌中PD-1、PD-L1蛋白表达水平。结果 RNAscope检测结果显示：PD-1、PD-L1 mRNA阳性为细胞质或细胞核中有棕黄色颗粒状物。PD-1 mRNA阳性定位于肿瘤间质免疫细胞,PD-L1 mRNA阳性定位于肿瘤细胞或肿瘤间质免疫细胞。PD-1 mRNA阳性率为20.39%(52/255),PD-L1 mRNA阳性率为14.12%(36/255)。免疫组化检测显示：PD-1阳性定位于细胞质,PD-1主要表达于肿瘤间质免疫细胞;PD-L1可表达于肿瘤细胞或肿瘤间质免疫细胞,肿瘤细胞PD-L1阳性定位于细胞膜(部分或完全膜染色),免疫细胞PD-L1阳性定位于细胞质或细胞膜。PD-1蛋白阳性率为14.12%(36/255)...     

蛋白激酶C对缺血预处理家兔心肌热休克蛋白70 mRNA的影响

目的:探讨心肌缺血预处理(IPC)过程中蛋白激酶(PKC)对热休克蛋白(HSP)70mRNA表达的影响。方法:在原位及离体家兔心脏缺血再灌注(I/R)、缺血预处理模型上分别应用PKC抑制剂和激动剂,观察对心肌的作用和对心肌HSP70mRNA的表达的影响。结果:缺血预处理和使用佛波酯(PMA)使心肌HSP70mRNA的表达、左心功能明显高于I/R组,磷脂酶A₂(PLA₂)活性及心律失常发生率明显低于该组;而使用多粘菌素B(PMB)则阻断了缺血预处理对心脏的保护作用,同时HSP70mRNA表达也明显低于IPC及PMA组。结论:PKC参与了缺血预处理过程中HSP70表达的调控。     

TLR4-TRPC6在LPS致16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位的作用

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)和瞬时受体电位通道蛋白6(TRPC6)信号通路在细菌脂多糖(LPS)诱导气道上皮细胞16HBE内NF-κB P65表达和核转位的作用,为气道炎症的发生机制提供实验依据。方法:用LPS(1mg/L)作用16HBE细胞0、0.5、2、6、12和24 h后,分别使用RT-PCR和Western blot法检测核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB) P65的mRNA和蛋白表达情况,并用免疫细胞化学染色法检测NF-κB P65的核转位。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测TLR4抑制剂CLI-095(5μmol/L)对LPS(1mg/L)诱导16HBE细胞NF-κB P65表达以及核转位的影响。用RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测TRPC6激动剂Hyp9(10μmol/L)对LPS(1mg/L)诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达以及核转位的影响。结果:LPS上调16HBE细胞NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。TLR4抑制剂CLI-095抑制LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。TRPC6激动剂Hyp9加重LPS诱导的16HBE细胞内NF-κB P65的mRNA和蛋白表达及核转位。结论:LPS通过TLR4-TRPC6信号通路诱导16HBE细胞内NF-κB P65表达和核转位。     

登革病毒感染对人血管内皮细胞PGIS表达及PGI2分泌的影响

目的：研究登革病毒感染对人血管内皮细胞分泌血管活性物质前列环素（PGI2）的影响,以了解登革出血热/登革休克综合征（DHF/DSS）的发病机制。方法：用登革病毒Ⅱ型感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,于感染后6、12、24、48、72、96h,分别收集病毒感染的HUVEC,用RT-PCR检测细胞内前列环素合酶（PGIS） mRNA的水平;分别收集病毒感染的上清液,用放射免疫检测法测定PGI2的含量。结果：登革病毒感染可使PGIS mRNA的水平增高,导致HUVEC分泌PGI2的量明显升高。在病毒感染后48、72、96h,与对照组比较HUVEC表达PGISmRNA的水平和HUVEC分泌PGI2的量明显升高（P〈0.05）。结论：DV2感染可显著上调HUVEC中PGIS mRNA转录及PGI2的分泌,导致登革病毒所致血管内皮细胞的功能障碍,可能与DHF/DSS的发病机制有关。     

丙型肝炎患者血清HSP70水平的检测及HSP70-HCV肽诱导CTL作用

目的 :检测丙型肝炎患者及正常人血清中HSP70的水平 ,探讨HSP70 HCV肽体外诱导特异性CTL的作用。方法 :先用ELISA法筛选出丙型肝炎患者及正常人血清 ,再用双夹心ELISA法检测血清HSP70 ,并分析抗HCV抗体和HSP70之间的关系。用HSP70 HCV肽激活外周血单个核细胞后 ,通过51Cr释放试验测定CTL的杀伤活性。结果 :76份血清 (抗HCV抗体阳性 2 8例 ,正常人血清 4 8例 )中 ,抗HCV抗体阳性患者HSP70的检出率为 82 .1% ,正常人血清中HSP70的检出率为18.8%。HSP70的检出率与HCV感染呈显著相关 ( χ2 =2 8.77,P <0 .0 1)。HCV感染者血清HSP70的含量显著高于正常人。HSP70与HCVC区肽 (DLMGYIPAV)的混合物 ,可诱导 1例患者的CTL对自体HCV肽致敏靶细胞的杀伤率达 37.8% ,而用HCV肽单独作用则不显著。结论 :HCV感染可刺激机体过表达HSP70 ,同时HSP70可能有增强HCV表位肽递呈促进CTL特异性杀伤HCV感染细胞的作用     

热休克蛋白70与汉坦病毒持续性感染乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞

目的 探讨热休克蛋白70（HSP70）过表达可能有助于汉坦病毒（HTNV）持续感染。 方法 在HTNV持续性感染过程中,通过Westen blotting及RT-PCR检测大脑皮层星形胶质细胞中HSP70的表达情况,并通过免疫荧光显微技术、AnnexinV 及RT-PCR检测细胞凋亡。 结果 与对照组相比,感染HTNV 76-118或 SEOV L99 的星形胶质细胞HSP70蛋白的表达增加,且在HTNV 76-118感染后3d或SEOV L99感染后2d HSP70蛋白表达达到峰值（n=15,P＜0.01,P＜0.05）;感染HTNV 76-118及SEOV L99上调星形胶质细胞HSP70基因的表达,且在HTNV 76-118感染后2~5d或SEOV L99感染后2~4d HSP70基因表达达到峰值（n=15,P＜0.01,P＜0.05）。HTNV76-118或SEOV L99感染过程中,星形胶质细胞无细胞病变效应,并且病毒复制未诱导细胞凋亡。 结论 HTNV感染星形胶质细胞激活了HSP70,这种改变可能抑制细胞凋亡,促进病毒持续性感染。     

Differential effects on nitric oxide synthase, heat shock proteins and glutathione in human endothelial cells exposed to heat stress and simulated diving

Decompression sickness (DCS) may result from damage to the endothelium caused by the gas bubbles formed during decompression and may be related to nitric oxide (NO) production by nitric oxide synthase (NOS). Heat stress prior to diving has been shown to protect animals from DCS, and by simulating this treatment in human endothelial cells (HUVEC) we have shown that a simulated dive performed subsequent to a heat stress potentiated the heat-induced expression of HSP70 and increased the level of the antioxidant glutathione (GSH). Since operational saturation diving is performed at an increased oxygen level, HUVEC have been exposed to heat stress and simulated diving at 40 kPa O(2), comparing the response on HSP70, HSP90 and GSH level to the effects previously observed at 20 kPa O(2). In addition, we wanted to investigate the effect on both endothelial NOS (eNOS) protein and enzymatic activity. The present results showed that a heat stress (45°C, 1 h) decreased the NOS activity and the protein markedly. Hyperoxia (40 kPa) alone or a dive either at 20 or 40 kPa O(2),had no effects on NOS activity or protein. At 40 kPa O(2) a simulated dive after heat stress potentiated the HS-induced HSP70 response, whereas the heat-induced HSP90 response decreased. GSH levels were found to be inversely related to NOS activity and protein expression, and might be explained by a possible post-translational regulation by glutathionylation of eNOS protein. The results add to the limited knowledge of these critical factors in cellular defence mechanisms that can prevent injury during decompression.     

咳宁方对流感病毒性肺炎小鼠肺组织HSP70表达的影响

目的:探讨咳宁方对实验性小鼠流感病毒性肺炎预防作用及其机制。方法:将NIH小鼠50只随机分为5组,即正常对照组、模型组、病毒唑组、咳宁I方组、咳宁Ⅱ方组。将冻存的流感病毒鼠肺适应株(FM₁)复苏,在鸡胚中繁殖,用乙醚将各组小鼠分别轻度麻醉后,以FM₁ 15个LD₅₀滴鼻感染小鼠,正常对照组给等量蒸馏水滴鼻。各组感染病毒前2 d,开始灌胃给药或等量生理盐水,每日2次,每次0.3 mL,直至感染后4 d共给药6 d。小鼠于感染后第4 d处死,取肺组织置－70 ℃冰箱保存。用Lowry法测定肺组织总蛋白,Western blot测定HSP70含量,并用光镜观察小鼠肺组织的病理变化。结果:模型组、3个用药组HSP70均显著高于正常对照组(P＜0.01), 咳宁I方组HSP70显著高于模型组(P＜0.05),且与病毒唑组亦有显著差异(P＜0.05)。咳宁I方组和病毒唑组小鼠肺组织病变程度明显轻于模型组(P＜0.05)。结论:流感病毒性肺炎小鼠的肺组织中HSP70表达显著增加,咳宁I方诱导流感病毒性肺炎小鼠肺组织HSP70表达增加,提示咳宁I方对流感病毒性肺炎小鼠的肺组织有保护作用。     

汉滩病毒感染血管内皮细胞引起TLR4表达上调

目的 探讨汉滩病毒感染血管内皮细胞后,Toll样受体(TRY)分子的表达变化,为抗感染免疫和致病机制研究提供重要资料.方法 分别用LPS,CL097,Poly I:C以及汉滩病毒76-118刺激血管内皮细胞,6 h后提取总RNA,进行反转录获得cDNA,再分别用各自的引物进行PCR反应,产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析,并用间接免疫荧光测定汉滩病毒感染血管内皮细胞后TLR4的表达.结果 汉滩病毒刺激感染后,血管内皮细胞TLR2、TLR4转录水平增高,TLR3转录水平降低,细胞膜表面的TLR4表达上调.结论汉滩病毒76-118感染血管内皮细胞后,可以引起TLRs分子转录水平发生改变,其中TLR4表达上调,固有免疫参与了汉滩病毒致病过程.     

稳定表达人热休克蛋白22内皮细胞株的构建和鉴定

背景：热休克蛋白22的应激表达可能对缺氧复氧内皮具有一定的保护作用。 目的：建立稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。 方法：EcoRⅠ/kpnⅠ双酶切鉴定真核表达重组质粒pEGFP-N1-HSP22。脂质体法以重组质粒pEGFP-N1-HSP22转染人脐静脉内皮细胞,G418筛选,获得G418抗性单克隆细胞。用荧光显微镜、RT-PCR及Western-blot检测热休克蛋白22在人脐静脉内皮细胞中的表达。 结果与结论：经双酶切电泳检测重组质粒pEGFP-N1-HSP22符合预期大小片段。稳定转染的单克隆人脐静脉内皮细胞中,荧光显微镜观察到每个细胞均有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western-blot检测到热休克蛋白22mRNA和蛋白表达。说明成功获得稳定表达人热休克蛋白22基因的内皮细胞株。     

半枝莲黄酮对Aβ 25-35引起的大鼠皮层星形胶质细胞NOS、HSP70及apoE异常表达的影响

 目的:探讨半枝莲黄酮对Aβ 25-35引起大鼠皮层星形胶质细胞一氧化氮合酶（NOS）热休克蛋白70（HSP70）及载脂蛋白E（apoE）蛋白表达异常变化的影响。方法:培养第3代的大鼠星形胶质细胞随机分为空白对照组、模型组和3个剂量药物组,药物组细胞分别加入17.5、35和70 mg/L半枝莲黄酮作用24 h后,模型组和3个剂量药物组均加入Aβ 25-35 100 μmol/L作用24 h,免疫组化法测定星形胶质细胞中内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 和神经元型一氧化氮合酶 (nNOS)蛋白的表达;Western blotting检测星形胶质细胞中HSP70蛋白的表达; RT-PCR测定细胞中apoE mRNA的表达。结果:与空白组相比,模型组eNOS蛋白含量降低60.83%（P<0.01）,iNOS蛋白含量增加215.03%（P<0.01）,HSP70蛋白含量增加166.67%（P<001）,apoE mRNA含量增加150.00% (P<0.01);半枝莲黄酮17.5、35及70 mg/L能不同程度地提高eNOS蛋白含量73.66%～137.77% (P<0.05),降低iNOS蛋白含量19.40%～44.50%（P<0.01）,降低HSP70蛋白含量1852%～49.38%（P<0.01）,降低apoE mRNA的含量14.17%～41.67% (P<0.01)。结论:半枝莲黄酮对Aβ 25-35引起的大鼠皮层星形胶质细胞的损伤具有抑制作用。半枝莲黄酮可能通过影响星形胶质细胞发挥对阿尔茨海默病的治疗作用。     

pEGFP-HSP70重组质粒的构建及其在大鼠神经干细胞中的表达*

 目的：构建重组pEGFP-HSP70质粒并观察其在神经干细胞中的表达。方法：采用RT-PCR方法从SD胎鼠肝组织中获取总RNA,扩增出热休克蛋白70（HSP70）基因的全序列cDNA,并克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-C2上, 经EcoRⅠ、BamHⅠ酶切及测序分析对重组质粒pEGFP-HSP70进行鉴定。采用Nucleofector转染技术将重组质粒pEGFP-HSP70转染至胎鼠神经干细胞中。结果：(1) 胎鼠HSP70 cDNA序列被正确地克隆到真核表达载体pEGFP-C2中, 成功构建重组大鼠pEGFP-HSP70质粒。荧光强度检测空质粒转染组（pEGFP-C2组）、pEGFP-HSP70组与对照组相比显著升高（P<0.01）;pEGFP-HSP70组内24 h的荧光强度与7 d（P<0.05）、14 d（P<0.05）和21 d（P<0.01）相比降低明显。(2) 转染后HSP70的表达在1 d（P<0.05）、7 d（P<0.01）和14 d（P<0.01）与对照组相比均明显升高。结论：神经干细胞可直接作为基因靶细胞, 能有效地表达重组质粒pEGFP-HSP70,且HSP70在神经干细胞中的表达与转染时间密切相关。