人乳头瘤病毒16型L1基因真核表达载体的构建及表达

目的从感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长，构建表达载体，并验证目的蛋白的表达。方法根据基因全长设计一对特异引物，用PCR的方法从宫颈癌组织DNA，中获得L1基因，以pMD18T为克隆载体，构建重组质粒进行亚克隆，再以pcDNA3．1（＋）为载体构建表达质粒，转染至人肝细胞系H7702，提取蛋白，采用Western Blot方法检测HPV16-L1蛋白的表达。结果从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV16型L1蛋白编码序列与Genebank报道序列高度同源，其真核表达产物与特异性抗体能够特异性结合。结论成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-HPV16-L1，为进一步研制HPV预防性疫苗创造基础条件。     

人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架的克隆和鉴定

目的从尖锐湿疣病变组织中克隆人乳头瘤病毒6型(HPV6)E7基因,为HPV感染的检测及基因工程疫苗的研制奠定基础。方法以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术,从尖锐湿疣病变组织中扩增出人乳头瘤病毒6型E7基因完整开放阅读框架,并插入载体PMD-18T中构建重组质粒,转化JM109中扩增,进行酶切及测序分析。结果测序结果证实克隆成功。结论该实验为研究人乳头瘤病毒E7蛋白的免疫学和流行病学特点创造了条件,也为下一步制备HPV6型疫苗奠定了基础。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

深圳市妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

目的 检测深圳市宫颈癌患者癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的序列.方法 采用PCR技术扩增1例在深圳生活17年宫颈癌HPV16型阳性患者组织中HPV16 E6、E7基因,对其进行克隆、构建重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析.结果 成功地克隆了HPV16 E6、E7基因,测序分析表明克隆的HPV16 E6、E7基因与GenBank收录的德国标准株相比完全一致.结论 深圳市妇女宫颈癌组织中HPV16型E6、E7致癌基因的序列与德国标准株相同.     

人WAF1基因的克隆及其生物调控作用

目的 克隆人WAF1基因,构建成WAF1－pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能。方法 采用RT－PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因,cyclinD1基因的调控作用。结果 从Hela细胞扩增的从WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1－pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1／CIP1的Hcl-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb,抑制cyclinD1蛋白表达的调控作用。结论 成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1－pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的 构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3，制备肿瘤DNA疫苗，为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法 从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA，进行RT-PCR扩增出全长cDNA，并克隆入PUCl9载体，经DNA测序证实序列无误后，将MAGE-3基因克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体。结果 经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段，成功克隆人PUCl9载体，经DNA测序证实为MAGE-3，编码MAGE-3基因全部947bp序列，读框正确，进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3．1／MAGE-3。结论 成功构建了MAGE-3真核表达质粒，为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础，对提供有效治疗方案，提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

人肝细胞生长因子与肝再生增强因子融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建人肝细胞生长因子(hHGF)与肝再生增强因子(hALR)融合基因的真核表达质粒并进行鉴定,为促肝细胞再生研究奠定实验基础.方法:首先分别以重组质粒pUC18-hHGF和Puc18-hALR为模板,进行PCR扩增,获得hHGF和hALR的基因序列,然后利用重叠延伸PCR方法将获得的基因序列通过一个连接序列进行连接,构建融合基因hHGF/hALR.最后将融合基因定向插入到真核表达质粒pcDNA3.1的Nhe I和Xba I酶切住点之间,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-hHGF/hALR,并进行双酶切及测序鉴定.结果:hHGF和hALR的PCR扩增产物电泳后分别观察到2.2 kb和0.4kb的单一DNA条带,与理论值相符.重叠延伸PCR扩增后的融合基因产物电泳后观察到2.6kb的单一DNA条带,与预期值一致.重组真核表达质粒pcDNA3.1-hHGF/hALR经双酶切,电泳后观察到2.6 kb和5.4kb的两条DNA条带,与预期值相符,测序鉴定结果表明序列正确.结论:成功构建了hHGF与hALR融合基因的真核表达质粒,为促肝细胞再生研究奠定实验基础.     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

弓形体RH株抗原基因SAG1的扩增克隆及鉴定

目的：体外扩增弓形体主要表面抗原SAG1基因,构建pcDNA3-SAG1真核表达质粒,为研制弓形体疫苗奠定基础。方法：采用PCR技术,自行设计一对寡核酸引物（P1,P2）,从弓形体RH株基因组DNA中特异扩增出编码SAG1抗原的基因片段,扩增的目的片段经纯化后用EcoR1和HindⅢ双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨苄青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子分别用Sac1单酶切、EcoR1和HindⅢ双酶切鉴定,结果成功地构建真核型表达质粒pcDNA3-SAG1,从而为进一步SAG1重组抗原的体外表达创造有利条件。结果：从RH株基因组DNA中特异扩增出编码SAG1的全基因序列,扩增目的基因片段大小与预期长度（1025bp),相符;将分离、纯化的目的基因片段SAG1任入pcDNA3质粒HindⅢt和EcoR1位点,构建重组质粒pcDNA3-SAG1。结论：成功构建重组质粒pcDNA3-SAG1。     

人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela细胞中的表达

目的构建并鉴定p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体,并转染Hela细胞后,检测其在Hela细胞中的表达。方法用RT-PCR法从Hela细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段连接到pMD-18T载体上,通过限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ酶切,T4连接酶连接到含有上述酶切位点的p3×flag-myc-CMV-24真核表达载体上,通过脂质体将p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6转染入Hela细胞48h后,Western-blot检测HPV18E6及3×flag表达情况。结果p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体构建成功,构建的真核表达载体可以被限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致,转染到Hela细胞48h后经Western-blot检测可见HPV18E6的高表达及flag的表达。结论p3×flag-myc-CMV-24HPV18E6真核表达载体的成功构建为进一步研究HPV18E6的致癌机制奠定了基础。     

负载HPV16E6基因树突状细胞疫苗的构建

目的以阳离子脂质体为载体,构建载入人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16E6)基因树突状细胞(DC)疫苗,研究其安全性及转染效率。方法将pcDNA3.1-HPV16E6质粒与阳离子脂质体混合形成复合物后转染树突状细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪及免疫细胞化学检测基因表达效率。结果转染后的DC可见胞浆内颗粒增多,胞质突起增加,细胞生长良好。免疫细胞化学、流式细胞仪结果DC转染率49.8%。结论阳离子脂质体可用于DC疫苗构建,具有高效性及安全性。     

HBV preS2真核载体的构建及其表达

【目的】扩增乙型肝炎病毒（HBV）前S2基因（preS2）,并构建其真核表达载体,为研究HBV树突状细胞疫苗奠定实验基础。【方法】从慢性乙型肝炎患者血清中提取HBVDNA,用聚合酶链反应技术扩增全长preS2基因,将其克隆到真核载体pcDNA3．1（＋）上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定筛选阳性克隆,构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）preS2,并将其转染巨噬细胞48h后,ELISA检测细胞裂解液中preS2的表达。【结果】从慢性乙型肝炎患者血清抽提的DNA中扩增得到约860bp大小的目的片段,preS2基因片段正确插入pcDNA3．1（＋）载体,得到HBVpreS2真核表达载体pcDNA3．1（＋）-pre2。【结论】成功地构建了舍preS2基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-preS2,并能在巨噬细胞中表达目的蛋白HBVpreS2。     

pcDNA3.1-bFGF真核表达载体的构建及其在犬骨髓基质干细胞中的表达

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染犬骨髓基质干细胞(BMSCs)后的表达情况,并进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程学中的应用。方法:提取国人脑胶质瘤细胞BT325总RNA,RT-PCR法扩增bFGF cDNA片段,构建重组载体pcDNA3.1-bFGF,重组载体经脂质体介导转染犬BMSCs,半定量RT-PCR及Western blot检测表达。结果:重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。bFGF在犬BMSCs中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-bFGF,此重组载体在犬BMSCs中能够表达。     

真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）的构建及其在体内外细胞中的表达

目的构建真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）并了解其在体内外真核细胞中的表达。方法将带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）的逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）产物克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析证明构建成功后,以脂质体介导法转染体外培养的真核293T细胞及注射入鼠骨骼肌细胞中,了解其在体内外真核细胞中的表达情况。结果我们获取了包含带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）成熟肽及HA抗原在内的一段cDNA片段,并成功地与真核表达载体PcDNA3.1（＋）连接,经测序表明,其中含有的带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）成熟肽的序列与Genebank上报道的序列完全一致。即我们成功构建了真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-带有白蛋白信号肽的Vasostatin（120-180aa）。之后,在转染了该质粒的体外真核293T细胞的上清液中及骨骼肌注射了该质粒的鼠血液中,利用Western-blot法检测到了目的基因的蛋白质。结论带有白蛋白信号肽的真核表达质粒PcDNA3.1（＋）-Vasostatin（120-180aa）增强了蛋白分泌表达能力,这为进一步应用该质粒治疗全身新生血管类病奠定了一定基础.     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

LIF真核表达载体的构建及其在MSCs中的稳定表达

目的在人骨髓间充质干细胞内大量稳定的表达人白血病抑制因子（human Leukemia Inhibitory Factor,hLIF）。方法应用RT-PCR方法从人蜕膜组织中扩增出白血病抑制因子,并将其构建于pcDNA3．1真核表达载体上。利用脂质体进行基因骨髓间充质干细胞的转染。利用G418进行基因的稳定表达筛选。通过RT-PCR和Westernblot方法进行基因表达的检测。结果成功扩增出人白血病抑制因子基因,成功构建hLIF-pcDNA3．1真核表达载体。转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞经G418筛选,存活十代以上。经RT-PCR及Westernblot方法检测发现转染LIF-pcDNA3．1的骨髓间充质干细胞表达白血病抑制因子明显高于未转染的骨髓间充质干细胞。结论成功构建LIF-pcDNA3．1的真核表达载体并使其在骨髓间充质干细胞得到稳定表达。