不同诱导条件对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 :比较小鼠胚胎干细胞 （ESC）在不同诱导条件下分化为心肌细胞的分化比率。方法 :用鼠胚成纤维细胞（MEF）作为饲养层促进 ESC增殖并抑制其分化 ,用维甲酸 （RA ）、二甲基亚砜 （DMSO）、转化生长因子β1 （TGF-β1 ）、激活素 - A（activin- A）为分化诱导剂 ,采用三步法诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,并比较各组分化比率。结果 :各组实验用的各种诱导剂均能诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,尤以 TGF- β1 （2 ng/m l）、activin- A（2 0 ng/ml）及 2 0 %胎牛血清 （FCS）组成的分化培养基可以使其分化比率高达 88% ,显著高于其它各组 （P<0 .0 1）。结论 :以 MEF饲养层培养 ,TGF- β1 、activin- A作分化诱导剂可作为一种比较简便、稳定、高效的 ESC分化条件。     

小鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化的研究

目的：小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）体外定向心肌细胞分化模型的建立。方法：通过悬滴培养技术定向诱导ES细胞分化为拟胚体,进而分化为心肌细胞,并用RT－PCR对四种肌肉肌动蛋白在EBs中的表达进行了鉴定。结果：在拟胚体和进一步分化的ES细胞中观察到自发节律性收缩的心肌细胞,α－平滑肌肌动蛋白（血管和胃肠道平滑肌）以及纹状肌肉肌动蛋白（心肌和骨骼肌）在这些心肌细胞样的细胞中均能表达。结论：小鼠胚胎干细胞体外定向心肌细胞分化模型的建立,可用于研究相关基因在心肌发育过程中的直接或间接作用,有助于胚胎干细胞衍生的心肌细胞用于临床治疗作用的研究。     

胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞具有多向分化潜能,在器官移植及组织修复治疗方面具有广阔的应用前景.近来研究表明,胚胎干细胞在相关基因、转录因子调控以及体内外细胞因子、激素、微环境等作用下能够诱导分化为心肌细胞.但临床应用胚胎干细胞进行心脏修复治疗还有许多问题需要研究和解决.     

胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞具有多向分化潜能,在器官移植及组织修复治疗方面具有广阔的应用前景。近来研究表明,胚胎干细胞在相关基因、转录因子调控以及体内外细胞因子、激素、微环境等作用下能够诱导分化为心肌细胞。但临床应用胚胎干细胞进行心脏修复治疗还有许多问题需要研究和解决。     

维生素C明显提高小鼠诱导多能干细胞分化为心肌细胞的诱导效率

目的:将维生素C作为诱导剂,观察其对小鼠诱导多能干细胞(miPSC)分化为心肌细胞效率的影响,寻找一种更安全、更高效的诱导方法。方法:复苏miPSC,传代培养后,利用悬滴培养法使miPSC形成拟胚体(EBs),用含维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,对照组不添加诱导剂,记录两组拟胚体出现搏动的时间、数量,计算分化率,观察维生素C作为诱导剂,对miPSC分化为心肌细胞效率的影响。结果:在用含10~(-4)mmol/m L维生素C的分化培养基时,大概有62.5%的拟胚体出现搏动,而不加任何诱导剂组约有8.3%的拟胚体出现搏动。各组搏动拟胚体cTnT,a-actinin免疫染色阳性。结论:维生素C作为一种诱导剂,能显著提高miPSC分化为心肌细胞的效率,并且心肌特异性蛋白cTnT,a-actinin染色阳性,应用维生素C作为诱导剂,诱导miPSC向心肌细胞分化是一种非常理想的诱导方法。     

维生素C联合内皮素-1促进胚胎干细胞向心肌细胞分化及机制

目的探讨维生素(Vit)-C联合内皮素(ET)-1对胚胎干细胞(ESC)向心肌细胞分化的影响及其可能机制。方法体外培养ESC并给予Vit-C,摸索Vit-C作用于ESC的最佳浓度和干预时间;然后给予ET-1(100 nmol/L)或Vit-C(100μmol/L)+ET-1(100 nmol/L),观察两组对拟胚体搏动、Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达的影响。同时,以RNA干扰方法沉默Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达,观察沉默相应启动子表达水平后对Vit-C联合ET-1介导的拟胚体搏动增加的影响。结果 Vit-C最佳作用浓度为100μmol/L,最佳干预时间为分化的第4~9天,可使拟胚体搏动增加11.19%,同时上调拟胚体中心肌细胞标志物c Tn T以及心肌发育启动子Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达。在Vit-C基础上进一步给予ET-1,可进一步使拟胚体搏动增加11.07%,同时进一步上调c Tn T、Nkx 2.5、GATA-4及Shox2表达水平。沉默Shox2基因表达使拟胚体搏动幅度减少最明显,达12.94%。结论 Vit-C联合ET-1可获得进一步纯化的心肌细胞,上调Shox2是其促进ESC分化的最重要机制。     

悬浮培养诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的研究

目的:利用不加任何诱导剂的悬浮培养法,体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞并检测其分化效率。方法:人胚胎干细胞克隆用200U/mL胶原酶Ⅳ,370C处理10min后,挑起克隆碎片转移到低黏附性培养皿中悬浮培养以形成EB(拟胚体),4d后将EB转移到基质胶处理过的6孔板中贴壁培养(1-3EBs/cm2),显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;免疫荧光染色检测心肌细胞特异标志物cTnT;膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果:在悬浮培养14d左右开始出现大量的自发跳动心肌细胞,分化出现自发跳动心肌细胞的平均时间(13.9±0.9)d,百分比为20.8%,平均跳动频率为(63.8±5.6)次/min;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24h的凋亡比例为(8.1±0.4)%。结论:不加诱导剂的悬浮培养可以诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到20.8%,分化时间14d左右。为进一步的干细胞移植治疗动物心肌梗死模型提供种子细胞。     

胚胎干细胞及其心肌细胞定向分化研究进展

近年来 ,胚胎干细胞已成为生命科学研究的热点之一。作者在回顾胚胎干细胞的生物学特性、获取和培养方法的基础上 ,着重综述在胚胎干细胞分化为心肌细胞后 ,心肌细胞特异性基因表达的变化、电生理特征、离子通道出现、形态学特征和治疗心肌梗死实验的初步结果     

Ghrelin以非经典受体依赖性方式促进人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的研究

目的 探讨Ghrelin对人胚胎干（hES）细胞定向分化为心肌细胞的影响. 方法 以不同浓度Ghrelin诱导hES细胞定向分化为心肌细胞,显微镜下计数搏动细胞团的比例,应用实时PCR检测心肌特异性标志物的表达.应用RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测分化细胞中生长激素促分泌物受体1α（GHSR1α）的表达,添加GHS-R1α拮抗剂[D-lys3]-GHRP-6,观察其对Ghrelin促分化作用的影响. 结果 与对照组比较,10-10、10-9及10-8 mol/L Ghrelin均可增加搏动细胞团的比例[搏动比例分别为（12.9±1.4）％％,（19.5±2.2）％及（13.5±3.1）％vs（10.3±2.2）％,P＜0.05].RT-PCR分析显示,Ghrelin可上调α-肌球蛋白重链（α-MHC）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的表达[α-MHC：100％ vs （40.1±13.2）％,P＜0.001;cTnI：100％ vs （52.6±9.8）％,P＜0.001].RT-PCR、Western blot及免疫荧光染色均显示GHS-R1α在不同阶段的分化细胞中表达,但酰基化和非酰基化Ghrelin的促分化作用相似,且添加GHS-R1α拮抗剂不能阻断Ghrelin的促分化作用. 结论 Ghrelin可促进hES细胞定向分化为心肌细胞,该作用可能由GHS-R1α以外的信号途径所介导.     

体外定向诱导E14小鼠胚胎干细胞为肝细胞

目的探索体外定向诱导胚胎干细胞分化为肝细胞。方法常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后，进行悬滴-悬浮培养，形成胚胎体，再进行分阶段定向诱导，在培养第9～12天、第12～18人以及第15～18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析持异性基因mRNA的表达，并用吲哚氰绿(ICG)摄取和过碘酸雪夫反应(PAS)分析细胞的分化及功能。结果在诱导培养的第13天，细胞出现肝细胞样改变。RTPCR分析可见，在诱导的第6天和第12天分别可以榆测到内胚层或卵黄囊分化标志基因-甲状腺素运载蛋白和α1抗胰蛋白酶的mRNA表达，第6天出现末成熟肝细胞标志基因-甲胎蛋白mRNA表达，第9天、第15天和第18天分别开始出现成熟肝细胞的特异性标志基因-白蛋白、葡萄糖6磷酸酶、酪氨酸氨基转移酶mRNA表达。同时，ESC源性肝细胞表现为ICG摄取和PAS反应阳性，经过诱导，ICG阳性细胞数约占85．1％。结论ESC源性肝细胞具备肝细胞特性，FSC有可能成为肝细胞治疗的替代供体细胞。     

Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes

Embryonic stem (ES) cells have been established as permanent lines of undifferentiated pluripotent cells from early mouse embryos. ES cells provide a unique system for the genetic manipulation and the creation of knockout strains of mice through gene targeting. By cultivation in vitro as 3D aggregates called embryoid bodies, ES cells can differentiate into derivatives of all 3 primary germ layers, including cardiomyocytes. Protocols for the in vitro differentiation of ES cells into cardiomyocytes representing all specialized cell types of the heart, such as atrial-like, ventricular-like, sinus nodal-like, and Purkinje-like cells, have been established. During differentiation, cardiac-specific genes as well as proteins, receptors, and ion channels are expressed in a developmental continuum, which closely recapitulates the developmental pattern of early cardiogenesis. Exploitation of ES cell-derived cardiomyocytes has facilitated the analysis of early cardiac development and has permitted in vitro "gain-of-function" or "loss-of-function" genetic studies. Recently, human ES cell lines have been established that can be used to investigate cardiac development and the function of human heart cells and to determine the basic strategies of regenerative cell therapy. This review summarizes the current state of ES cell-derived cardiogenesis and provides an overview of how genomic strategies coupled with this in vitro differentiation system can be applied to cardiac research.     

胰高血糖素样肽1诱导小鼠胚胎干细胞E14分化为胰岛素表达细胞

将小鼠胚胎干细胞株E14以高血糖素样肽 1(GLP 1)诱导 ,观察细胞形态 ,用原位杂交和RT PCR检测细胞内胰岛素mRNA的变化 ,免疫组化、流式细胞仪、放射免疫法验证细胞是否能分泌胰岛素样物质。发现E14细胞在GLP 1的作用下可以分化成表达胰岛素样物质的细胞     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的:观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)心肌细胞分化的影响。方法:用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体(embryoid bodies,EBs)。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk-1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT-PCR检测Nk同源异型盒5(Nkx2.5)、锌指转录因子-4(GATA-4)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)及心房钠尿肽(ANP)基因表达水平的变化。用Western blot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0~5天及5~10天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5-10组。加入Dkk-1的组命名为Dkk-1组。结果:通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0~5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2.5、GATA4、β-MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5~10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5~10天加入Dkk-1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0~5天分别加入Wnt3a及Dkk-1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论:Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

Wnt3a对小鼠胚胎干细胞心肌细胞分化的影响

目的：观察Wnt3a信号对小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,ESC）心肌细胞分化的影响。方法：用悬滴培养法促进ESCs形成拟胚体（embryoidbodies,EBs）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白cTnT的表达。在不同分化时间加入Wnt3a及Wnt信号通路抑制剂Dkk一1观察对搏动EBs百分率的影响。用RT—PCR检测Nk同源异型盒5（Nkx2．5）、锌指转录因子-4（GATA．4）、B．肌球蛋白重链（[~-MHC）及心房钠尿肽（ANP）基因表达水平的变化。用Westernblot检测cTnT表达水平的变化。将不加入Wnt3a,分化第0—5天及5～lO天加入Wnt3a的组分别命名为对照组,D0-5组及D5．10组。加入Dkk．1的组命名为Dkk．1组。结果：通过悬滴培养法形成的EBs能够出现自发性搏动并且有TnT表达。EBs形成过程中即分化第0—5天加入Wnt3a与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率,Nkx2．5、GATA4、B．MHC和ANP基因表达的水平,以及cTnT蛋白表达水平,而EBs形成后即分化第5—10天加入Wnt3a的结果相反。分化第5—10天加入Dkk．1与对照组相比具有更高的搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平,并且在分化第0—5天分别加入Wnt3a及Dkk．1与单独加入Wnt3a及Dkk-1相比,搏动EBs百分率及cTnT蛋白表达水平更高。结论：Wnt3a对ESCs向心肌细胞分化的调控呈时间依耐性,EBs形成过程中激活Wnt3a信号及EBs形成后阻断Wnt3a信号能够获得更多的心肌细胞。     

Differentiation of rat embryonic stem cells into functional cardiomyocytes

Rats(Rattus norvegicus) have many advantages over mice in scientific studies,for example, they are more relevant to human in physiological and pharmacological responses.Therefore,rats are broadly used in experimental studies.The recent breakthrough in the generation of rat embryonic stem cells(rESCs) opens the door to application of gene targeting to create models for the study of human diseases.In addition,the in vitro differentiation of rESCs into derivatives of three germ lines will serve as a powerful tool and resource for the investigation of mammalian development,cell function, tissue repair,and drug discovery.However, the distinct culture condition and signal inhibitor-depended maintenance of rESCs stand as a considerable challenge for its in vitro differentiation.To address it,we investigated whether rESCs are capable of forming terminal differentiated cardiomyocytes. We found that the embryoid bodies(EBs)-based method used in mouse ESC(mESC) differentiation failed to work in the cultivation of rESCs.We then modified the differentiation protocol and successfully developed an in vitro differentiation system to differentiate rESCs into three embryonic germ layers.By using this method,the rESCs form spontaneous beating cardiomyocytes with the properties similar to those derived from fetal rat hearts and mESCs.This unique cellular system will provide a new approach to study the early development and cardiac function as well as to perform pharmacological test and cell therapy study(Grants:the State Major Research Program of China(2009ZX09503-024,2010CB945603) and CAS(XDA01030000).