肝癌细胞中IL-18表达及其调控机制的研究

目的探讨肝癌细胞调节IL-18生物学功能的主要分子机制。方法体外培养正常人类肝细胞株QSG-7701和原发性肝癌细胞株（MHCC97-L和HCCLM3）,采用RT-PCR法,分别检测这3种细胞株中IL-18及其相关正负调节基因mRNA的表达变化。结果与2种原发性肝癌细胞株比较,正常人类肝细胞株中IL-18及其正调节基因粒细胞蛋白水解酶3（proteinase-3）mRNA表达量较高,但正调节基因caspase-1和负调节基因caspase-3 mRNA表达水平无统计学差异。结论原发性肝癌细胞中IL-18 mRNA表达减弱,可能与proteinase-3表达失衡有关。     

人肝癌细胞BEL-7402非常规照射模式生物效应探讨

目的 探讨不同照射模式对人肝癌细胞株BEL-7402生物效应变化影响及其与人肝细胞株QSG-7701放射敏感度差异。方法 6MV X线两种模式照射BEL-7402细胞(包括0、1、2、3、5、7、9、10Gy共8个吸收剂量点,剂量率3Gy/min)：(1)急速照射组,照射完成时间0~4min;(2)模拟三维适形照射组：照射完成时间：12~15min。成克隆分析法计算存活分数,多靶单击数学模型拟合曲线,求出SF2、D0、Dq等参数值;6MV X线单次5Gy照射体外培养的BEL-7402、QSG-7701 细胞, 采用MTT 比色法、流式细胞术测定细胞受照后不同时间存活率、凋亡率、细胞周期。结果 BEL-7402细胞模拟急速照射组和三维适形照射组D0、Dq、SF2值分别为1.78和1.69、1.45和1.54、0.625和0.654;QSG-7701 细胞照后24 h 凋亡率最高(18 %),而BEL-7402细胞照后12h凋亡率最高(32 %),存活率最低(65%),两株细胞照后12 h 凋亡率和存活率差异最大（P<0.01）。结论 三维适形照射模式下分次照射时间延长,生物效应下降;BEL-7402及QSG-7701两株细胞在照后存在放射敏感度差异。     

PDGF-D及其受体在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨血小板衍生生长因子-D（PDGF-D）及其受体PDGFRβmRNA在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法用RT-PCR方法检测58例胃癌及相对应的癌旁标本中PDGF-D及PDGFRβ mRNA的表达,分析其与临床病理特征的关系。结果PDGF-D及PDGFRβ在胃癌组织中的阳性表达率（98.28%,72.41%）均高于癌旁组织（87.93%,53.45%）,P均＜0.05。PDGFRβ与PDGF-D的表达呈正相关（r=0.40,P＜0.05）。PDGF-D mRNA的表达水平与胃癌的淋巴结及远处转移和复发有关（P＜0.05）,与其他临床病理特征无关（P＞0.05）。结论PDGF-D在胃癌的发生、发展和转移、复发中可能起着重要的作用,可作为预测胃癌转移和复发的有意义指标。     

乙肝病毒x蛋白对肝癌细胞中PUMA表达的影响

目的:探讨乙肝病毒x蛋白（hepatitis B virus x protein,HBx）对肝癌细胞中PUMA表达的影响及其机制。方法:利用质粒转染技术对p53基因不同状态的肝癌细胞转染野生型HBx基因,用RT-PCR检测转染后肝癌细胞中HBx mRNA表达和荧光定量PCR检测NFκB mRNA表达,Western blot检测HBx、p53、NFκB、PUMA蛋白表达。结果:转染后随着HBx的表达,在p53野生型肝癌细胞BEL-7402和p53突变型肝癌细胞Huh-7中NFκB mRNA和蛋白上调而p53蛋白表达下降,BEL-7402细胞PUMA蛋白表达下降而Huh-7细胞中PUMA蛋白表达略有下降。加入NFκB抑制剂PDTC后并随着PDTC浓度逐渐增加,BEL-7402细胞NFκB蛋白表达逐渐下降而p53蛋白和PUMA蛋白表达逐渐上升;但在Huh-7细胞中随着NFκB蛋白表达的抑制,p53蛋白逐渐上升而PUMA蛋白上升不明显。结论:结果提示转染HBx基因可以抑制肝癌细胞中PUMA蛋白表达,在p53野生型肝癌细胞这种抑制可能与HBx通过NFκB 的激活有关。     

抗高迁移率族蛋白1中和抗体对肝癌细胞BEL-7402/ADM药物敏感性的影响

目的:探讨抗高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1,HMGB1）中和抗体对肝癌细胞药物敏感性的影响及可能机制。方法:采用阿霉素（adriamycin,ADM）小剂量持续诱导法建立肝癌细胞耐药细胞株BEL-7402/ADM。实验分为BEL-7402/ADM组、ADM组及ADM+抗HMGB1中和抗体组,MTT法检测细胞对ADM的敏感性及抗HMGB1中和抗体对细胞的低毒性,Annexin V-FITC流式细胞法检测细胞凋亡情况,酶标法检测Caspase-9、Caspase-3活性,Western-blot方法检测核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）亚单位p-p65、Bcl-2蛋白的表达。结果:ADM对亲本株的半数抑制浓度(IC50)为0.23 μg/mL,对肝癌细胞耐药株BEL-7402/ADM的IC50上升至4.07 μg/mL,耐药指数为17.7。联合抗HMGB1中和抗体能明显提升ADM对BEL-7402/ADM细胞增殖抑制率,IC50下降至0.91 μg/mL;加用逆转浓度（19 ng/mL）的抗HMGB1中和抗体组的BEL-7402/ADM细胞凋亡率较单用ADM组的凋亡率明显上升（P＜0.01）。与BEL-7402/ADM组相比,ADM组细胞的Caspase-9、Caspase-3活性有一定程度上升（P＜0.01）,联合抗HMGB1中和抗体作用后,Caspase-9、Caspase-3活性增强则更加明显（P＜0.01）。BEL-7402/ADM组及ADM组间p-p65、Bcl-2表达无显著差异（P＞0.05）,加用抗HMGB1中和抗体处理后,细胞p-p65、Bcl-2表达明显下降（P＜0.01)。结论:抗HMGB1中和抗体对BEL-7402/ADM细胞耐药性有逆转作用,其机制可能与下调NF-κB介导的Bcl-2表达,促进肝癌细胞凋亡有关。     

丙戊酸钠对人肝癌细胞株Bel-7402增殖及VEGF、bFGF表达的影响

目的 探讨丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对人肝癌Bel-7402细胞的增殖抑制作用及其机制.方法 采用MTr比色法检测VPA对Bel-7402细胞增殖的抑制作用;应用流式细胞术(FCM)检测药物作用细胞后细胞凋亡率的变化;通过RT-PCR技术和Western Blot方法检测药物作用细胞后血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)在mRNA和蛋白水平表达量的改变.结果 VPA对Bel-7402细胞的生长抑制作用呈现时间和剂量依赖性;经0、1、2和4 mmol/L VPA作用细胞72小时后,细胞的凋亡率由处理前的(2.78±0.32)％,上升为(8.79±0.53)％、(18.65±1.02)％和(36.41±1.93)％,RT-PCR和Weatem Blot技术发现VPA作用细胞72小时后,可明显降低VEGF和bFGF的表达,并呈浓度依赖性(P＜0.05).结论 VPA通过下调Bci-7402细胞VEGF和bFGF的表达,对Bel-7402细胞的增殖起抑制作用.     

康莱特抑制肝癌细胞侵袭能力及其对相关基因MMP-9表达的影响

目的探讨康莱特（Kanglaite,KLT）对肝癌细胞株BEL-7404侵袭能力的抑制作用及其对相关基因MMP-9mRNA和蛋白表达水平的影响。方法据前期MTT实验结果选用A组（含KLT80μL/mL）、B组（含DDP10 mg/L）和C组（DMEM空白对照）对BEL-7404细胞进行48小时处理,用细胞迁移实验及Transwell小室法检测细胞的侵袭能力的变化,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot法检测各组BEL-7404细胞中MMP-9mRNA及蛋白的表达水平。结果对BEL-7404细胞作用48小时后,A、B两组细胞的迁移速率及侵袭穿膜细胞数、MMP-9 mRNA及蛋白表达水平均较C组明显降低,差异均有统计学意义（P〈0.001）;而A、B两组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 KLT可通过下调MMP-9表达而抑制肝癌BEL-7404细胞株的侵袭能力;同时对BEL-7404细胞侵袭能力的抑制,80μL/mL KLT与10 mg/L DDP显示同样的抑制效果与机制。     

环氧合酶-2选择性抑制剂NS-398诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡及其机制探讨

目的:探讨环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)选择性抑制剂NS-398对人肝癌BEL-7402细胞凋亡及凋亡抑制蛋白survivin、XIAP和c-IAP1表达的调节作用.方法:用不同浓度的NS-398作用BEL-7402细胞后,MTT法测定细胞增殖抑制情况,FCM法和TUNEL法检测细胞凋亡情况,免疫细胞化学法检测COX-2、survivin、XIAP和c-IAP1蛋白的表达情况.结果:NS-398 可以显著抑制BEL-7402细胞的增殖,诱导其凋亡.免疫细胞化学法检测结果显示,与未处理组相比,NS-398作用可使BEL-7402细胞中COX-2、survivin、XIAP和c-IAP1蛋白的表达明显下调(P<0.01).结论:NS-398对人肝癌细胞株BEL-7402有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,其机制可能与通过下调survivin、XIAP和c-IAP1的表达有关.     

水蛭素对肝细胞癌HepG2细胞抑制作用机制探讨

目的 研究水蛭素对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌）HepG2细胞抑制作用及其抗肝癌的分子机制。方法 将含不同浓度（1 U/mL、2 U/mL、4 U/mL和8 U/mL）水蛭素的培养液作用于肝癌HepG2细胞,采用MTT法检测水蛭素对肝癌HepG2细胞增殖的影响,流式细胞仪检测水蛭素对肝癌HepG2细胞凋亡的影响,Transwell法检测水蛭素对肝癌HepG2细胞迁移、侵袭的影响,荧光定量PCR检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）基因的mRNA表达水平,Western blot检测VEGF基因的蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较,肝癌HepG2细胞增殖抑制率随水蛭素浓度（1 U/mL、2　U/mL、4 U/mL和8 U/mL）增加及作用时间（24　h、48　h、72　h）延长而增加,呈剂量-时间依赖效应（P<0.05）。不同浓度（2 U/mL、4 U/mL和8 U/mL）水蛭素作用48 h后,肝癌HepG2细胞凋亡率分别为（28.37±1.16）%、（40.27±0.97）%、（76.17±1.5）%,细胞侵袭个数分别为（204±9）个、（163±6）个、（94±4）个,细胞迁移个数分别为（86±5）个、（54±7）个、（20±5）个,细胞凋亡率、侵袭及迁移个数随水蛭素浓度增加而增加,呈浓度依赖性（P<0.05）。VEGF mRNA、蛋白的表达量随水蛭素浓度增加而明显下调（P<0.05）。结论 水蛭素能抑制肝癌HepG2细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭,其机制可能是通过下调VEGF表达。     

5-脂氧合酶抑制剂对人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响

目的：研究5-脂氧合酶（5-lipoxygenase,5-Lox）在人肝癌细胞株HepG2中的表达,以及5-Lox抑制剂对人肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡的影响。方法：应用免疫细胞化学染色及RT-PCR分别检测5-Lox的蛋白和mRNA在人肝癌细胞株HepG2中的表达,采用MTT法及流式细胞术检测5-Lox抑制剂齐留通（Zileuton）对人肝癌细胞株HepG2增殖、凋亡的影响。结果：5-Lox蛋白表达于肝癌细胞浆,局灶细胞核膜亦见阳性染色,RT-PCR可检测到肝癌细胞5-Lox的mRNA的表达。人肝癌细胞株HepG2给予不同浓度的齐留通处理24小时后,细胞存活率呈剂量依赖性下降;流式细胞术检测可见细胞凋亡率呈剂量依赖性升高。结论：人肝癌细胞株HepG2存在5-Lox的表达,5-Lox抑制剂齐留通可抑制人肝癌细胞株HepG2的增殖,诱导细胞凋亡。     

血小板衍生生长因子-D在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义

目的研究血小板衍生生长因子(PDGF) D在肝细胞肝癌(HCC)中的表达及其与临床病理指标的关系。方法用RT-PCR方法检测PDGF-A、B、C、D及其受体PDGFRα和PDGFRβ基因在40例肝癌组织及对应的30例癌旁组织和10例正常肝组织标本中mRNA的表达。结果HCC组织中PDGF-A、B、C、D及其受体PDGFRα和PDGFRβ阳性表达分别为37.5%(15/40)、70%(28/40)、52.5%(21/40)、92.5％(37/40)、22.5％(9/40)、42.5%(17/40);与其相对应的癌旁组织的阳性表达率分别为23.3％(7/30)、16.7%(5/30)、16.7%(5/30)、26.7%(8/30)、13.3%(4/30)、16.7%(5/30);而正常肝组织中未见表达。在HCC组织中PDGF家族的表达均显著高于癌旁组织和正常组织,三组比较差异有统计学意义(P＜0.01),且PDGF-D的阳性表达显著高于PDGFs其他亚型(P＜0.05)。在HCC、癌旁、正常肝脏组织中PDGF-D平均光密度值为0.5900±0.0364、0.3954±0.0654、0,三者比较差异有统计学意义(P＜0.01)。HCC组织中PDGF-D的阳性表达与肿瘤的分化程度、淋巴及转移有关（P＜0.05）;与年龄、性别、肿瘤大小、血清AFP的值及门静脉癌栓无关(P＞0.05)。结论PDGF家族中以PDGF-D表达率最高且与肿瘤的分化程度和转移相关,提示PDGF家族,尤其是PDGF-D在HCC的发生、发展和转移中可能发挥着重要的作用,可作为肝癌辅助诊断指标和治疗靶点。     

Sorafenib联合紫杉醇不同给药顺序作用于人肝癌细胞BEL-7402的效应

背景与目的：Sorafenib是一种多靶点的抗肿瘤药物,其治疗原发性肝癌的疗效已经初步得到证实。本研究应用Sorafenib与紫杉醇（paclitaxel,TAX）联合．观察两药不同的给药顺序作用于人肝癌细胞BEL-7402的不同效应,初步探讨产生这种差异的机制。方法：采用MTY法检测Sorafenib与紫杉醇单药作用于BEL-7402细胞的IC50流式细胞术检测Sorafenib与紫杉醇不同给药顺序作用后,BEL-7402细胞周期和凋亡率的变化。Western blot检测不同给药顺序作用后的BEL-7402细胞Bcl-2的表达情况。结果：Sorafenib和紫杉醇单药作用于BEL．7402细胞48h的IC50分别为（2.43±0.32） μg/mL、（1.89±0.72） μg/mL。分析Sorafenib、紫杉醇单药,先用紫杉醇再加入Sorafenib,先用Sorafenib再加入紫杉醇及紫杉醇与Sorafenib同时作用后BEL-7402细胞周期及凋亡率的变化,结果显示：①Sorafenib主要将细胞阻滞在S期,而紫杉醇主要将细胞阻滞在G2-M期。②先用紫杉醇再给予Sorafenib组细胞S期及G2-M期均有延长,且较其他组获得较高的凋亡率（36.43±2.29）％（P〈0．01）。Western blot显示先用紫杉醇再给予Sorafenib组BEL-7402细胞的Bcl-2表达的水平最低。结论：Sorafenib联合紫杉醇不同给药顺序作用于BEL-7402细胞,先应用紫杉醇诱导再序贯给予Sorafenib时细胞凋亡率更高：产生这种不同效应的可能机制为两种药物作用于不同的细胞周期,以及不同给药方法后的Bcl-2的表达水平不同。     

miR-223-3p 通过靶向RAC1 调控肝细胞癌SMMC-7721 细胞的增殖和凋亡

目的：探讨miR-223-3p 通过调控Ras 相关C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1）对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法：选用2016 年8 月至2018 年8 月吉林市中心医院手术切除的30 例HCC 组织及其癌旁组织标本和人HCC 细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2 及人正常肝细胞QSG-7701，用qPCR检测HCC组织和细胞系中miR-223-3p的表达水平。分别将miR-223-3p mimics、miR-223-3p inhibitor 和siRAC1转染至SMMC-7721 细胞，通过CCK-8、克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术检测SMMC-7721 细胞的增殖、克隆形成和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因实验检测miR-223-3p 与RAC1 的靶向关系，Western blotting 检测细胞中RAC1 蛋白的表达水平。结果：miR-223-3p 在HCC组织的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.01），其表达水平与肿瘤大小、TNM分期及肿瘤分化病理特征相关（P<0.05 或P<0.01）；miR-223-3p 在HCC细胞系表达水平显著低于QSG-7701 细胞（均P<0.01），以在SMMC-7721细胞中表达水平最低。双荧光素酶报告基因实验证实RAC1 是miR-223-3p 靶基因，miR-223-3p 靶向负调控RAC1 的表达。转染miR-223-3p mimics 显著抑制SMMC-7721 细胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05 或P<0.01），并促进细胞凋亡（P<0.01）；转染miR-223-3p inhibtor 则逆转miR-223-3p mimics 对细胞的抑制作用。结论：过表达miR-223-3p 抑制HCC细胞增殖和克隆形成能力并促进细胞凋亡，其机制可能与靶向下调RAC1表达有关。     

肝癌多药耐药细胞株的建立及其多药耐药机理的研究

 为建立人肝癌多药耐药细胞株并研究其多药耐药的机理，本文应用BEL－7402细胞株，通过不断提高培养液中阿霉素（Doxorubicin）的浓度，长期筛选培养，得到肝癌多药耐药株BEL7402/DoX。经MTT法检测BEL－7402对长春新碱（VCR）等8种抗癌药的抗性提高了27－1100倍不等。以流式细胞技术检测了此细胞株表面MDR1蛋白P－gp、多药耐药相关蛋白MRP及谷胱甘肽硫转移系统（GSH/GST）的表达；用RT－PCR方法检测了MDR及MRP基因表达水平。发现BEL7402/Dox细胞表面P－gp表达为93.5～97.4％；MRP的表达为84.7～90.2％；RT－PCR证实此细胞株中有MDR及MRPmRNA的高表达；未发现GSH/GST的表达升高。     

家蝇抗菌肽Cecropin对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响及其机制

目的探讨家蝇抗菌肽Cecropin对人肝癌BEL-7402细胞周期的影响及其机制。方法人肝癌细胞BEL-7402经家蝇抗菌肽Cecropin作用后,光学显微镜观察细胞生长情况,PI单染流式细胞术检测各组细胞周期分布情况,并采用间接免疫荧光标记技术通过流式细胞仪检测细胞周期检测点激酶1(CHK1) 和细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)。结果光学显微镜下,对照组细胞形态规则,呈梭形贴壁生长,抗菌肽组细胞部分变圆,贴壁不佳,数量减少;细胞增殖周期发生改变, G₀/G₁与G₂/M期细胞比例降低,S期细胞比例增高,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05) ,并且细胞周期调控关键蛋白分子CHK1和CDK2的表达增高。结论家蝇抗菌肽Cecropin可通过调节CHK1和CDK2的表达影响BEL-7402细胞增殖周期。     

切割MDR1 RNA的核酶(Ribozyme)对肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX化疗耐药性的逆转作用

为逆转肿瘤多药耐药基因(MDR1)产物P-gp蛋白所介导的肿瘤细胞对多种化疗药物的耐受性,设计合成了一种能切割MDR1 mRNA第196密码子GUC序列的锤头状核酶(Ribozlyme)并定向克隆于转录病毒载体pDOR-neo的BamH Ⅰ位点.经病毒包装细胞PA317包装后感染人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX细胞,经G418筛选得到稳定的转化细胞株.Northem Blot杂交证实包装细胞PA317及转化的BEL-7402/DOX细胞中均有病毒的高表达,RT-PCR证实转化细胞中MDR1 mRNA与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来,流式细胞技术检测转化细胞P-gp的表达与非转化细胞的93.4～97.5%相比下降至8.2～14.6%.MTT法检测证实转化细胞对多种化疗药物重新产生较高的敏感性.结果表明,表达Ribozyme的逆转录病毒载体转化肝癌多药耐药细胞BEL-7402/DOX后能有效抑制MDR1的表达和翻译,使已产生耐药的肿瘤细胞的多药耐药表型发生逆转.     

重组腺病毒介导反义c-myc基因对人肝癌细胞系的治疗作用

目的：探讨重组腺病毒介导反义ｃ－ｍｙｃ基因（Ａｄ－ＡＳｍｙｃ）治疗人肝癌细胞的作用。方法：观察Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系的转导效率,通过细胞生长曲线、克隆形成实验、ＤＮＡ片段化分析、ＲＴ－ＰＣＲ、裸鼠皮下移植瘤治疗实验,分析Ａｄ－ＡＳｍｙｃ对人肝癌细胞系Ｂｅｌ－７４０２、ＱＳＧ－７７０１、ＳＭＭＣ－７７２１和ＨＣＣ－９２０４细胞生长和ｃ－ｍｙｃ基因表达及裸鼠肿瘤生长的抑制作用。结果：Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可高效转导人肝癌细胞系,抑制细胞生长;转染细胞克隆形成能力降低,克隆成活率为对照组的５３．９％～６９．１％,ｃ－ｍｙｃ基因表达下降;Ａｄ－ＡＳｍｙｃ处理肝癌细胞,ＤＮＡ凝胶电泳出现明显的梯形条带,瘤内注射Ａｄ－ＡＳｍｙｃ可抑制裸鼠皮下移植瘤生长。结论：重组腺病毒介导的反义ｃ－ｍｙｃ基因转移,有可能成为肝癌基因治疗     

蜂毒素对人肝癌裸鼠移植瘤的抗血管生成作用

目的探讨蜂毒素对人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响及其抗血管生成作用。方法建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察蜂毒素对肿瘤生长的影响。采用免疫组织化学法,检测肿瘤组织微血管密度（microvessel density,MVD）及碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）和核转录因子κB（nuclear factorκB,NF-κB）的水平。结果蜂毒素低、中、高剂量组相对肿瘤增殖率分别为48.78%、38.33%和33.82%。与生理盐水组比较,蜂毒素处理组肿瘤体积明显缩小（P〈0.01）。免疫组化结果显示,蜂毒素可降低肿瘤组织MVD,且蜂毒素处理组bFGF、HIF-1α和NF-κB蛋白水平明显低于生理盐水组（P〈0.01）。结论蜂毒素可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,其作用机制可能是降低NF-κB活性,抑制HIF-1α转录,进而下调bFGF表达,最终阻碍肝癌血管生成。