RNA干扰沉默NF-κBp65基因表达对喉癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:探讨靶向转录因子NF-κB p65的siRNA对人喉癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法:将人喉癌Hep-2细胞注射入裸鼠皮下建立裸鼠移植瘤模型。将15只裸鼠喉癌模型随机分为3组:实验组、阴性对照组与正常对照组,分别给予NF-κB p65siRNA、FAM-Control siRNA和PBS治疗3周。治疗过程中观察肿瘤体积的变化,治疗结束时处死裸鼠,肿瘤称取质量,取肿瘤组织切片进行TUNEL标记及免疫组织化学检测NF-κB p65及Bcl-xL蛋白的表达情况。结果:治疗后实验组平均瘤重(0.53±0.03)g,低于阴性对照组[(0.70±0.04)g]和正常对照组[(0.72±0.07)g],差异有统计学意义(P<0.05);实验组移植瘤体积(1 313.58±114.72)mm3,小于阴性对照组[(1 536.92±80.30)mm3]和正常对照组[(1 661.01±161.84)mm3],差异有统计学意义(P<0.05);实验组NF-κB p65、Bcl-xL蛋白表达水平明显下调,细胞凋亡率增高。结论:siRNA明显抑制了NF-κB p65表达,并抑制肿瘤生长,其机制可能与下调Bcl-xL蛋白表达而诱导细胞凋亡有关。     

三氧化二砷诱导喉癌Hep-2耐药细胞凋亡的研究

目的观察三氧化二砷(As2O3)对喉癌Hep-2细胞株和长春新碱诱导的多药耐药Hep-2r细胞的作用和对细胞周期的影响.方法用长春新碱(VCR)递增药物浓度法筛选耐药细胞Hep-2r,体外培养的细胞与不同浓度的As2O3作用24、48、72h,通过MTT还原法检测细胞的生长抑制率,用光学显微镜、流式细胞仪、荧光显微镜研究细胞凋亡的形态学改变,检测细胞凋亡率并进行细胞周期分析.结果As2O3可有效抑制Hep-2细胞和Hep-2r细胞的生长,呈时间和浓度依赖性特点.形态学观察发现,As2O3诱导Hep-2和Hep-2r细胞凋亡,Hep-2和Hep-2r细胞对As2O3的敏感性无显著差异.2μmol/L As2O3作用24h时,S期细胞比例增高,72h后,S期细胞明显下降,细胞大量凋亡.As2O3在作用早期,阻滞细胞通过S期,随着时间的延长,诱导S期细胞凋亡.结论As2O3可诱导Hep-2细胞和Hep-2r细胞凋亡,与细胞周期阻滞有关.     

拓扑替康对鼻咽癌放射增敏的体内实验

目的 研究拓扑替康(topotecan,TPT)对鼻咽癌裸鼠移植瘤的放射增敏作用.方法 ①首先行拓扑替康对裸鼠最大耐受剂量以及拓扑替康和放疗(radiotherapy,RT)有效率的研究;②放射增敏实验方案:53只移植瘤裸鼠随机分为5组,RT 20 Gy组,RT40 Gy组,TPT 12.5 mg/kg组,TPT 12.5 mg/kg RT20 Gy组,生理盐水对照组并给予相应处理,评价有效率(完全缓解 部分缓解)和再生长延缓时间(regrowth delay time,TGD),并绘制生长曲线,计算增敏比,抑瘤率等.结果 RT20 Gy TPT 12.5 mg/kg组与RT20 Gy组和TPT12.5 mg组比较差异有统计学意义;RT20 Gy TPT 12.5 mg/kg组RT40 Gy组比较差异没有统计学意义;增敏比=1.34.结论 本研究证明了TPT对鼻咽癌裸鼠移植瘤放射治疗有明显的增敏效果.     

靶向转录因子NF-κB p65的siRNA对Hep-2细胞增殖及表达的影响

目的:以喉鳞状细胞癌Hep-2细胞为研究对象,应用RNAi技术特异性的抑制NF-κBp65的表达,观察其对癌细胞增殖、蛋白和mRNA表达的影响.方法:用NF-κBp65siRNA转染喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,采用Western Blotting方法检测Hep-2细胞转染前、后NF-κBp65的蛋白表达;采用RT-PCR检测Hep-2细胞转染前、后NF-κBp65的mRNA表达水平;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况.结果:Western Blotting结果显示随着NF-κBp65siRNA作用时间的延长,蛋白表达水平逐渐降低.半定量RT-PCR结果表明,转染NF-κBp65siRNA 24、48和72 h后的Hep-2细胞,与未转染组的Hep-2细胞相比,NF-κBp65 mRNA的表达水平逐渐下调(P＜0.05);MTT法显示不同时间NF-κBp65siRNA转染Hep-2细胞后,细胞增殖活性受抑制情况与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:NF-κBp65siRNA对Hep-2细胞的增殖活性有明显的抑制作用,并且可以特异性地抑制目的基因NF-κB p65在mRNA和蛋白水平上的表达,其作用具有时间依赖性.     

紫杉醇对人喉鳞状细胞癌Hep-2放射增敏作用的实验研究

目的 在体外用细胞生物学实验技术了解紫杉醇联合直线加速器X射线照射对Hep-2细胞株的作用，以及紫杉醇对Hep-2细胞株细胞周期的影响，并探讨其作用机制。方法 ①用MTT法计算Hep-2细胞经直线加速器照射组；先紫杉醇作用12、18、24、30h后再直线加速器照射组；先直线加速器照射再联合紫杉醇作用12、18、24、30h组各组细胞生长抑制率。②应用流式细胞仪检测Hep-2细胞经紫杉醇作用12、18、24、30h后各组细胞周期分布。结果 ①先紫杉醇作用再直线加速器照射组细胞生长抑制率较高（各组均值达到87．51％～89．64％），与先照射再联合紫杉醇组细胞生长抑制率（各组均值为57．84％～64．34％）及单纯照射组细胞生长抑制率（均值为41．90％）相比有统计学意义（P〈0．01）。②用紫杉醇后Hep-2细胞株细胞周期停滞于G2／M期，G2／M期停滞于24-30h达到峰值（24．65％～25．15％），并在用药后30h观察到凋亡峰。结论 紫杉醇有放射增敏作用，其可能机制是使细胞生长停滞于射线敏感期G2／M期，从而加强射线对肿瘤细胞的杀伤效应。     

金丝桃素联合放射线照射对喉癌细胞Hep-2的影响

目的：探讨金丝桃素（HY）联合放射线照射对喉癌细胞Hep-2的影响。方法：体外培养的喉癌细胞Hep-2分别给予0、1、2、3Mg／ml终浓度的HY,加药1h后,给予5Gy的放射线照射（HY加放射组）;另取喉癌细胞Hep-2分别给予5、10、20、25μg／ml终浓度的HY,不给予放射线照射（单纯HY组）;各实验组均设空白对照。继续培养48h后,应用显微镜、MTT法和流式细胞仪（FCM）分析HY加放射组和单纯HY组对喉癌细胞Hep-2的影响。结果：光镜下可见喉癌细胞生长密集,细胞呈梭型或多角型,细胞彼此之间相接触,放射后的喉癌细胞主要改变为部分细胞肿胀,HY和喉癌细胞共同经放射线作用后,在HY低剂量时即可见细胞数量明显减少,肿胀细胞比例明显增多,高剂量时可见细胞坏死。MTT结果显示放射后HY可显著抑制喉癌细胞的生长;FCM分析表明放射后HY可将喉癌细胞阻滞在G0／C1期,并诱导喉癌细胞凋亡。HY单独应用,对喉癌细胞的抑制作用相对较弱。结论：HY联合放射线照射可有效地抑制喉癌细胞的增殖,并可诱导喉癌细胞凋亡。     

EGCG对鼻咽癌细胞增殖抑制和凋亡诱导时NF-κB和caspase-3的表达变化

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）作用于鼻咽癌CNE-2细胞后,对转录因子NF-κB和凋亡效应酶caspase-3表达的影响,以及这两个基因的表达与鼻咽癌细胞凋亡和增殖的关联性。方法体外培养鼻咽癌细胞CNE-2,MTT法检测细胞增殖的抑制作用;Hoechst染色检测细胞凋亡;流式细胞仪分析细胞周期的改变。RT-PCR检测NF-κB和caspase-3的表达。结果EGCG能明显的抑制鼻咽癌细胞增殖,诱导其凋亡,并表现为浓度依赖性：流式分析显示,EGCG干预鼻咽癌细胞CNE-2在48小时后,细胞被阻滞于G1期。80mg/L EGCG处理鼻咽癌细胞24小时和48小时后,均能下调NF-κB表达,上调caspase-3表达。结论EGCG可能通过抑制NF-κB和诱导caspase-3的表达来发挥其抗鼻咽癌细胞的生物学作用。     

冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的放射增敏作用

目的：观察冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的放射增敏作用,并探讨其可能机制。方法：用克隆形成实验计算药物的放射增敏比,流式细胞仪法分别检测、比较单纯药物组、单纯照射组、联合治疗组各组的细胞周期变化。结果：冬凌草甲素的放射增敏比为1.227,流式细胞仪法分析显示,联合治疗组的细胞周期变化以G2/M期阻滞为主（45.2%）,与单纯药物组、单纯照射组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞具有一定的放射增敏作用,其机制可能与改变细胞周期有关。     

塞来昔布诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的 探讨环氧化酶-2特异抑制剂--塞来昔布对喉癌Hep-2细胞增殖抑制和凋亡诱导作用及可能机制。方法 以不同浓度的塞来昔布处理喉癌Hep-2细胞,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测对细胞增殖的影响, Hoechst33342染色荧光显微镜下观察细胞核的形态改变,以Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率,Western blot检测Bcl-2、Bax及COX-2的表达, Western blot分析Caspase-3裂解激活。结果 MTT结果表明塞来昔布抑制Hep-2细胞的增殖呈时间和浓度依赖;Hoechst33342 荧光染色见随塞来昔布处理时间延长,细胞核逐渐出现凝集、碎裂等凋亡表现;流式细胞术检测细胞凋亡率见塞来昔布处理细胞24h, 70、100μmol/L组凋亡率分别为(28.9±2.74)%、(32.7±3.96)%;Western blot分析蛋白表达,见随药物处理浓度增加,COX-2、Bcl-2表达降低,Bax表达增加,随药物处理时间延长Caspase-3出现裂解片段。结论 塞来昔布能够有效地抑制Hep-2细胞增殖和诱导Hep-2细胞凋亡,其诱导凋亡作用机制可能与Bax／Bcl-2比值升高,Caspase-3蛋白裂解激活有关。     

Inhibiting XIAP expression by RNAi to inhibit proliferation and enhance radiosensitivity in laryngeal cancer cell line

Objectives

X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) is a novel member of the inhibitors of apoptosis (IAPs) family. The overexpression of XIAP is asscociated with radioresistance of human malignancies. The purpose of the present study was to investigate the effect of shRNA-targeted XIAP on the proliferation, apoptosis and radiosensitivity of human laryngeal carcinoma cells (Hep-2).

Methods

A siRNA expression vector (pSilencer4.1-XIAPshRNA) was constructed and stably transfected into human laryngeal carcinoma cells (Hep-2). The downregulation of XIAP expression was evaluated by RT-PCR and Western blot analyses. Then, we investigated the effect of XIAP-shRNA on the proliferation, cell cycle changes and apoptosis in vitro of Hep-2 cells. Finally, the radiosensitivity of Hep-2 cells was investigated by clonogenic cell survival assay.

Results

We established stably transfected cell line (Hep-2/XIAPshRNA) in which the expression of XIAP gene was downregulated. The cell viability of Hep-2/XIAP-RNA cells was obviously decreased compared with that of untransfected Hep-2 cells. Morever, XIAP-shRNA induced cell arrest in the G₀/G₁ phase of cell cycle by flow cytometry analysis. Results of TUNEL assay indicated that Hep-2 cells stably transfected pSilencer4.1-XIAP-shRNA showed obvious apoptosis characters. Furthermore, the downregulation of XIAP expression could lead to significant radiosensitivity enhancement in laryngeal carcinoma cells.

Conclusions

RNAi-mediated downregulation of XIAP expression can inhibit proliferation, induce apoptosis and diminish the radioresistance of laryngeal carcinoma cells, so combined therapy with XIAP inhibition and radiation may be a potential strategy for the treatment of laryngeal carcinoma.     

西妥昔单抗联合放化疗对喉鳞状细胞癌的协同杀伤效应

目的：观察西妥昔单抗诱导人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2凋亡的敏感性,并探讨西妥昔单抗与顺铂、放射线联合应用对Hep-2细胞的杀伤效应及机制。方法：采用CCK-8试剂盒分别检测西妥昔单抗、顺铂、放射线对Hep-2生长抑制率,流式细胞仪检测不同干预方案对Hep-2凋亡率及细胞周期分布情况。结果：不同浓度西妥昔单抗对Hep-2细胞均有抑制作用,并在一定浓度范围内呈时间一剂量依赖性,24h半数抑制浓度为1036．84μg／ml;顺铂,放射线分别与西妥昔单抗联合应用时,Hep-2凋亡率显著高于顺铂、放射线单独或联合应用（P〈0．01）,并产生Go／G1期阻滞。结论：Hep-2细胞对西妥昔单抗诱导的细胞凋亡敏感,顺铂和（或）放射线与西妥昔单抗联用对Hep-2细胞的增殖具有协同抑制效应;显著的凋亡诱导作用和对Hep-2细胞周期的影响为其机制之一,为临床喉鳞状细胞癌靶向EGFR并联合放化疗方案提供了理论依据。     

反义表皮生长因子受体纳米颗粒对小鼠头颈鳞状细胞癌放疗增敏的实验

目的应用反义表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）纳米颗粒,研究阻断EGFR表达,对小鼠头颈部鳞状细胞癌（简称头颈鳞癌）敏感性的作用。方法载反义EGFR寡核苷酸纳米颗粒转染SCC VII细胞株,通过Western—blot研究其蛋白抑制效应。放射治疗千预后,细胞克隆试验和MTT试验检测细胞的放射敏感性,流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡情况：构建小鼠头颈癌荷瘤模型,瘤体注射反义EGFR纳米颗粒,予以4Gy放射治疗,观察肿瘤生长抑制情况。结果反义EGFR纳米颗粒明显抑制EGFR蛋白的表达情况：反义EGFR纳米颗粒与放疗联合降低了肿瘤细胞克隆形成能力及生长能力（P〈0．05）：肿瘤细胞发生G1期阻滞,细胞凋亡率增加（P〈0．05）。体内实验发现反义EGFR纳米颗粒组肿瘤生长明显延缓。结论反义EGFR纳米颗粒通过下调EGFR的表达,使SCC VII细胞发生G1期阻滞,具有放疗增敏效应。     

金丝桃素光照对喉癌细胞Hep-2的影响

目的 探讨金丝桃素对喉癌细胞Hep-2的影响。方法 体外培养的喉癌细胞Hep-2分别加入终质量浓度为0．5、1．0、2．0、3．0、5．0μg／ml的金丝桃素，加药后1h给予照射能量为7．5J／cm^2的光照10min，另取喉癌细胞Hep-2分别加入终质量浓度为5．0、10．0、20．0、25．0μg／ml的金丝桃素，不给予光照。各实验组均设空白对照组。继续培养48h后，应用荧光显微镜、四甲基偶氮唑盐[3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H tetrazolium bromide，MTT]法和流式细胞仪检测观察金丝桃素在光照和非光照条件下对喉癌细胞Hep-2的影响。结果 光镜下可见对照组喉癌细胞生长密集，细胞呈梭型或多角型，细胞彼此之间相接触。光照后小剂量金丝桃素组可见细胞数量明显减少，随着金丝桃素剂量的增加，细胞数量明显减少，在高剂量组可见细胞坏死。MTT结果显示光活化金丝桃素呈剂量依赖性抑制喉癌细胞的生长。流式细胞仪分析表明金丝桃素经光照后，可将喉癌细胞阻滞在G0-G1期，并诱导喉癌细胞凋亡；吖啶橙染色可见细胞胞膜出芽、染色质凝集、核片段化及凋亡小体等典型的细胞凋亡特征。金丝桃素单独应用，对喉癌细胞的抑制作用相对较弱。结论 金丝桃素经光照后，可有效抑制体外培养的喉癌细胞的增殖，并可诱导喉癌细胞凋亡。     

靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响

目的观察赛来昔布靶向阻断COX-2信号通路对喉癌细胞生长的影响。方法用不同浓度的赛来昔布处理喉癌细胞Hep-2,通过MTT法检测赛来昔布对喉癌细胞的生长抑制率的影响。用浓度为15μmol/L的赛来昔布处理Hep-2细胞,通过流式细胞学检测药物处理前后细胞周期、凋亡率的差异,运用Western blot检测药物处理前后相关蛋白EGFR和COX-2表达的差异。结果赛来昔布处理后的Hep-2细胞与药物浓度成比例地出现生长抑制率增高;赛来昔布干预组细胞G1期比例大于对照组（P〈0.01）,凋亡率明显升高（P〈0.05）;与对照组相比,赛来昔布干预组出现明显的p-EGFR,COX-2表达降低（P〈0.05）。结论赛来昔布能抑制喉癌细胞株Hep-2生长,增加Hep-2细胞G1期阻滞,降低肿瘤细胞增殖能力和诱导细胞凋亡;赛来昔布可抑制喉癌细胞COX-2的表达和EGFR的磷酸化。提示COX-2抑制剂可能作为喉癌靶向治疗的新方法。     

Twist基因高表达诱导Hep-2细胞上皮间质转化并促进其侵袭能力的实验

目的探讨编码位于常染色体上的碱性螺旋-环-螺旋转录因子（Twist）,在Hep-2细胞中的高表达对上皮细胞标记物——上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、间充质细胞标记物——神经钙黏蛋白（N-cadherin）及Hep-2细胞的侵袭能力的影响。方法以人喉癌细胞系Hep-2为实验材料,将构建好的pcDNA3.1-Twist质粒利用脂质体2000转染于Hep-2细胞,利用Western-blotting方法检测转染pcDNA3.1-Twist的细胞中Twist、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达情况;采用倒置相差显微镜观察转染pcDNA3.1-Twist后细胞的形态学变化;利用细胞侵袭实验,检测Twist的高表达对Hep-2细胞侵袭能力的影响。结果Western-blotting检测发现转染pcDNA3.1-Twist的实验组细胞中Twist和N-cadherin的表达均上升,E-cadherin的表达下降,与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）;倒置相差显微镜发现细胞形态由转染前的多角型、椭圆型变为运动能力更强的细长、梭型;检测高表达TWIST的Hep-2细胞的侵袭能力,发现转染TWIST实验组的穿过膜的细胞数为85.33±6.66,明显高于pcDNA3.1组及对照组穿过膜的细胞数为29.33±10.70和32.00±3.61,差异具有统计学意义（F=52.32,P〈0.05）。结论Twist能诱导Hep-2细胞上皮间充质转化现象的产生,提高Hep-2细胞的侵袭能力,可能通过调控E-cadherin和N-cadherin发挥作用。     

紫杉醇联合直线加速器放射对喉癌细胞作用的研究

目的 :了解紫杉醇联合直线加速器X 线放射对人喉鳞状细胞癌细胞株Hep 2的作用 ,为两种方法的临床联合运用提供实验依据。方法 :运用体外肿瘤细胞培养技术 ,观察 1× 10 -8mol/L紫杉醇联合直线加速器产生的 2GyX 线对人喉鳞癌细胞株Hep 2的生长抑制作用及时间效应。计算细胞存活率。结果 :加紫杉醇后放射组细胞生长明显抑制 ,第 7天时细胞存活率为 11.11% ,较放射后加紫杉醇组低。加紫杉醇 12h后放射与加紫杉醇 2 4h后放射其结果无明显差异。单纯紫杉醇组细胞存活率较单纯放射组低。结论 :紫杉醇联合直线加速器X 线放射明显抑制人喉鳞癌细胞株Hep 2的生长 ,紫杉醇可起放疗增敏作用     

染料木黄酮增强喉癌Hep-2细胞放射敏感性的研究

目的　探讨染料木黄酮联合放疗对人喉表皮样癌细胞Hep-2放射敏感性的影响。方法　细胞分为对照组、放疗组、木黄酮组和放疗+木黄酮组。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU）检测放疗组、木黄酮组和放疗+木黄酮组对Hep-2细胞增殖的短期效应的影响。克隆形成实验检测0、2、4、6、8 Gy X线照射后放疗组和放疗+木黄酮组细胞存活率,Graphpad Prism拟合单击-多靶模型细胞存活曲线,分析比较放疗组和放疗+木黄酮组对细胞增殖性死亡的影响。结果　放疗+木黄酮组能明显抑制细胞的增殖活性;10 μmol/L木黄酮作用后,放射增敏比（sensitization enhancement ratio,SER）为1.412。结论　木黄酮通过抑制DNA合成抑制Hep-2细胞增殖,并且作为放疗辅助药物可以增强Hep-2细胞放射敏感性。     

喉癌干细胞在放化疗抵抗中的作用机制

目的：探讨喉癌干细胞的分选方法,分析顺铂、放射线联合应用对喉癌肿瘤干细胞的杀伤效应及机制。方法：应用流式细胞仪荧光活化细胞分选技术检测并分选出喉癌Hep-2细胞系中的CD133＋细胞和CD133-细胞,并检测CD133＋细胞亚群的干细胞特性;采用CCK-8试剂盒分别检测顺铂、放射线对两组细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测不同干预方案对2组细胞凋亡率及细胞周期分布情况的影响。结果：CD133＋细胞在喉癌Hep-2细胞系中占（2．43±0．77）％,在细胞增殖、分化及体内成瘤试验中CD133＋细胞均表现出肿瘤干细胞特性;不同浓度剂量的顺铂、放射线对Hep-2细胞均有抑制作用,并在一定浓度范围内呈剂量依赖性;顺铂、放射线单独或联合应用时,CD133-细胞凋亡率显著高于CD133＋细胞（P〈0．01）,并产生G0／G1期阻滞。结论：CD133＋细胞较CD133-细胞更具有明显的肿瘤干细胞特性,对放化疗具有明显的抵抗作用,对凋亡诱导作用不敏感和细胞周期改变为其机制之一。