人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白.从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp).重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽.插入表达载体pPIC9K中a交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF.电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子.甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性.结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础.     

重组人血清白蛋白-hGCSF突变体在毕赤酵母中的表达

目的通过定点突变,提高融合蛋白HSA-hGCSF的生物活性。方法结构模拟显示,对hG-CSF中5个氨基酸残基加以突变可以提高其生物活性。通过限制性酶切方法将该突变基因与HSA基因的3′连接,融合基因插入到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,置于启动子AOX1之后,重组质粒pPIC9K-HSA-hG-CSFm经SalⅠ线性化,电击转化毕赤酵母GS115,摇瓶中进行分泌表达。用MTT比色法测定发酵液上清中融合蛋白的hG-CSF活性。结果PCR鉴定得到约为2300bp的融合基因,测序结果正确。SDS-PAGE和Western blot分析表达的融合蛋白HSA-hGCSFm,表明该蛋白相对分子质量约为85000,且具有HSA的抗原性,生物活性为1.5×106IU/mL。结论分子设计实现了突变体融合蛋白生物活性的提高。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

人源抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体的构建

目的构建以人HBsAg单链抗体(HBScFv)为导向作用、α干扰素为治疗作用的融合蛋白酵母表达载体pPICZ-αB/ScFv-IFN-α。方法通过重叠PCR构建目的蛋白质基因,再亚克隆到酵母表达载体pPICZαB中,DNA测序后,转化巴氏毕赤酵母宿主菌GS115 ,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定重组酵母,重组酵母经甲醇诱导后,通过SDS PAGE分析鉴定表达产物。结果DNA测序结果显示构建的目的基因片段(HBScFv IFN-α)的序列与原设计序列相符合;菌落PCR结果显示目的基因已整合到酵母菌中;诱导表达后,SDS PAGE结果显示在相对分子质量约4 4 0 0 0处可见目的蛋白质表达带。结论成功构建了抗HBsAg单链抗体与α干扰素融合蛋白酵母表达载体     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

重组人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达的研究

目的构建含有人组织因子(h TF)基因的毕赤酵母高效表达系统,实现胞外高效分泌表达。方法全基因合成h TF胞外区序列,PCR扩增该基因片段,经Xho I和Xba I双酶切后,和表达载体p GAPZa A相连,并电转化毕赤酵母SMD1168H。在YPD培养基中进行表达,取培养基上清进行SDS-PAGE检测,并利用Western进行确证,通过BCA法检测胞外蛋白表达量。结果在毕赤酵母中成功表达人组织因子,通过Western确证目的蛋白分子量大小正确,BCA法检测摇瓶表达胞外总蛋白达1 g/L,Bandscan软件分析目的蛋白占胞外总蛋白80%以上。结论本研究实现了截短型人组织因子在毕赤酵母中的高效分泌表达,获得了具有与完整因子相同凝血活性的截短型组织因子。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

幽门螺杆菌多表位肽在毕赤酵母中的分泌表达

构建分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE的毕赤酵母。以原核表达载体pET-22b-CTB-UE为模板,通过PCR扩增得到融合His-tag的ctb-ue基因序列,将其插入酵母表达载体pPIC9K,得到重组表达载体pPIC9K-CTB-UE。重组表达载体pPIC9K-CTB-UE经内切酶Sal I线性化后,电击转化进毕赤酵母GS115,通过组氨酸缺陷性MD平板筛选重组菌株,G418抗性筛选多拷贝转化子,阳性转化子经PCR鉴定,摇瓶发酵表达,取上清经过超滤浓缩,Ni-NTP亲和层析纯化,透析脱盐,SDS-PAGE检测,Western blot验证。结果获得了整合有ctb-ue基因的毕赤酵母,诱导后分泌表达的CTB-UE蛋白能够与His-tag抗体发生特异性反应。成功构建了分泌型毕赤酵母GS115(pPIC9K-CTB-UE),能分泌表达幽门螺杆菌多表位肽CTB-UE。     

新型甘露聚糖酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

构建土壤基因组文库,通过功能筛选得到一水解底物魔芋粉的阳性克隆,测序后,序列分析表明:该基因全长为1 530 bp,包含一个糖基水解家族26结构域,编码510个氨基酸,相对分子质量为56 438。此基因推导的氨基酸序列与Cellulomonas fimi的Man26A和Cellvibrio japonicus的mannanase A氨基酸序列同源性分别为64.3%、38%。将此基因的成熟肽的编码序列克隆到表达载体pHBM905上,得到重组质粒pHBM730,将pHBM730经SalI酶切线性化后转化3株毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168,该甘露聚糖酶基因在这3种毕赤酵母中均实现分泌表达。将此3种重组毕赤酵母GS115(pHBM730)、KM71(pHBM730)、SMD1168(pHBM730)诱导产酶,对这3种重组酶进行相关的酶学性质研究。分析表明,在KM71中表达量最高,其最适反应pH值均约为6.6,最适反应温度均约为45℃。在最适反应条件下测得其酶活力为19.64 U。此结果为瓜尔豆胶降解产物的工业化应用提供了参考。     

人sCR1酵母分泌型表达载体构建及其高拷贝转化子的快速筛选

目的采用酵母分泌型载体表达人可溶性补体受体1型(sCR1),研究人sCR1高拷贝重组阳性转化子的快速筛选及鉴定。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性。     

用酵母载体pPIC9k重组构建表达sCR1

目的采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9k-sCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定。结果获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCR1,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带,在Western Blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

重组可溶性补体1型受体在酵母SMD1168中表达纯化及鉴定

目的在酵母细胞SMD1168中表达人可溶性补体1型受体(sCR1),并对其重组蛋白进行纯化以探讨较为接近人体天然蛋白的表达方式,从而为临床诊断及治疗提供方便。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPIC9K,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9K-sCR1);经测序鉴定正确后,将重组质粒转化入毕赤酵母菌细胞SMD1168中,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定,并通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化。结果经甲醇诱导的含pPIC9K-sCR1的酵母细胞表达出重组人sCR1的融合蛋白,48-72hsCR1融合蛋白表达量最高。此蛋白在凝胶上表现为大于31kD的蛋白区带,在Western blot实验中可被sCR1的CD35单克隆抗体识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白。结论人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

N-糖基化IL-24的表达及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的构建IL-24基因的真核表达载体,在毕赤酵母GS115中高效表达,研究重组N-糖基化IL-24蛋白体外诱导肿瘤细胞凋亡的活性。方法借助过渡质粒α/pUC18,将IL-24基因插入到质粒pPIC9K的BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建重组质粒IL-24/pPIC9K,转化毕赤酵母GS115分泌表达,Tricine-SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白,ELISA检测蛋白表达量,糖苷酶PNGaseF分析IL-24糖基化形式和程度。MTT法和形态学分析重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡的活性。结果成功构建重组表达质粒IL-24/pPIC9K,IL-24在毕赤酵母最高表达量为(81.31±14.46)mg·L-1。约70%的IL-24发生了N-糖基化。重组IL-24诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡,对正常人肺成纤维细胞NHLF没有影响。N-糖基化IL-24对MCF-7抑制率约高于去糖基化IL-24。结论毕赤酵母分泌形式的表达和适度的糖基化修饰都有利于目的蛋白IL-24的生物学活性,为后续的研究提供基础。     

T4溶菌酶在毕赤酵母中的诱导表达及抑菌活性测定

目的利用毕赤酵母诱导表达T4溶菌酶蛋白并测定其抗菌活性。方法T4溶菌酶（T4lysozyme）基因以N端融合的方式被准确插入到质粒pPIC9K的EcoR I-Not I位点内,得到分泌型重组表达载体 pPIC9K-T4L。该载体首先经限制性内切酶Sal I酶切,进而采用电击方法将线性化的重组质粒DNA导入到毕赤酵母中。经过梯度筛选得到多个单拷贝和多拷贝转化重组子。随机挑取部分重组子PCR扩增阳性克隆,经菌体培养和甲醇诱导后获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清液中。结果表达蛋白经琼脂孔扩散抗菌实验显示抑菌圈明显;重组蛋白对金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌均具有显著抑制作用;多拷贝与单拷贝重组表达子没有抗菌活性差异与蛋白表达量的差异;加热煮沸对于T4溶菌酶蛋白的抗菌活性无明显影响。结论T4溶菌酶在毕赤酵母中得以成功诱导与表达;表达产物不受拷贝数影响并具热稳定性。     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

刀额新对虾精氨酸激酶基因的克隆与真核表达

目的克隆刀额新对虾精氨酸激酶的基因并进行真核表达。方法提取刀额新对虾总RNA,经逆转录获得精氨酸激酶的cDNA,插入质粒pPIC9K构建重组真核表达质粒,转化毕赤酵母进行诱导表达,用SDS-PAGE和斑点免疫分析鉴定重组表达产物。结果逆转录获得的精氨酸激酶cDNA全长1071bp,DNA序列分析结果与GenBank收录的序列(EU497674)比较,同源性为99.5%;重组表达质粒转化酵母的表达产物经SDS-PAGE分析,其相对分子质量约40kD;表达产物与虾过敏者血清呈较强反应性。结论克隆得到刀额新对虾的精氨酸激酶基因并获得其重组真核表达产物,为进一步研制虾类食物过敏症的相关检测试剂提供了试验依据。