重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验分析

目的观察重组腺病毒Ad-GFP转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的情况。方法取新生1～5 d小鼠的耳蜗基底膜,离体培养1 d后,加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d,在荧光显微镜及Confocal显微镜下观察病毒对离体耳蜗基底膜的转染情况。结果耳蜗基底膜离体培养1 d后,在显微镜下观察,可见基底膜贴壁生长良好,外周有新生上皮细胞和成纤维细胞长出;高倍显微镜下可见耳蜗内外毛细胞和支持细胞等结构。离体耳蜗基底膜培养组织加入重组腺病毒Ad-GFP继续培养1 d后,可见重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜及其外周长出的新生上皮细胞和成纤维细胞;在新生小鼠离体耳蜗基底膜上,不仅大上皮嵴细胞区域、小上皮嵴细胞区域的细胞能被高效转染,毛细胞也能被高效转染。结论重组腺病毒Ad-GFP能高效转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。     

胆红素对离体培养大鼠耳蜗基底膜的药理效应观察

目的观察胆红素对离体培养的新生SD大鼠耳蜗器官的损伤效应。方法健康新生3日龄SD大鼠18只,雌雄不限,分离其双侧的内耳共得到耳蜗器官组织36个,体外培养,12h后换液。选择贴壁、存活良好的组织30个入选实验,并随机分为两组(15个/组):实验组于贴壁第二天开始进行胆红素处理,对照组加入相应体积的生理盐水。处理后24h,实验组和对照组同时终止培养,并对其进行固定、免疫组织化学染色,共聚焦显微镜观察毛细胞及螺旋神经节神经元的形态变化并计数,统计对比。结果胆红素组离体培养的耳蜗器官中螺旋神经节神经元胞体及其树突纤维与对照组相比有明显的减少,内外毛细胞形态完整,数量无明显变化。结论大鼠耳蜗器官螺旋神经节神经元对胆红素的毒性敏感,而内外毛细胞对其毒性相对不敏感。     

Ad-DsRed2-NT3转染小鼠离体耳蜗基底膜预防庆大霉素耳毒性的实验研究

目的将含有目的基因NT3的重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3转染新生小鼠的离体耳蜗基底膜培养组织,观察其在预防庆大霉素的耳毒性中的作用。方法取新生小鼠的耳蜗基底膜离体培养1d后,用含有目的基因NT3的重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3转染新生小鼠的离体耳蜗基底膜培养组织,转染成功1d后用终浓度为3mM的庆大霉素对离体耳蜗基底膜造模,造模3d后,行离体耳蜗基底膜的神经微丝免疫荧光染色,观察各组耳蜗基底膜神经微丝的密度,以观测NT3对离体耳蜗基底膜上的螺旋神经的保护作用。结果新生小鼠的离体耳蜗基底膜生长良好,重组腺病毒Ad-DsRed2-NT3能对其有效转染,庆大霉素造模后3d各组耳蜗基底膜神经微丝的密度(每100μm距离内的螺旋神经微丝数)分别为(±s):造模组16.67±1.63、Ad-DsRed2组16.17±2.31、Ad-DsRed2-NT3组40.33±1.63、空白组为43.17±0.75,其中,造模组与空白组、Ad-DsRed2-NT3组与造模组、Ad-DsRed2-NT3组与Ad-DsRed2组之间具有显著性统计学差异(P<0.05)。结论终浓度为3mM的庆大霉素对小鼠离体耳蜗基底膜上的螺旋神经有明显的损害作用,而NT3基因的过表达对这种损害具有保护作用。     

Lipofectamine TM2000介导pIRES2-EGFP-NT3转染新生小鼠离体耳蜗基底膜的实验研究

目的构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,检测其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况。方法构建含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3后,在阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导下将其转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织,转染后24 h,通过Confocal显微镜观察小鼠离体耳蜗基底膜的转染情况和转染效率。结果成功构建了真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3,通过阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导,该质粒在新生小鼠离体耳蜗基底膜转染的范围内转染进17个细胞,说明该质粒在阳离子脂质体介导下能转染新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织。结论含有目的基因NT3的真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-NT3的成功构建,及其在阳离子脂质体介导下对新生小鼠离体耳蜗基底膜培养组织的有效转染,为研究NT3基因转染对正常及致聋小鼠耳蜗效应的实验奠定了基础。     

胆红素对离体小鼠耳蜗组织毒性作用的研究

目的观察不同浓度胆红素对离体培养小鼠耳蜗组织的损伤效应。方法取新生5天的C57BL/6J小鼠,解剖获得耳蜗基底膜组织离体培养48小时,将耳蜗基底膜组织随机分为四组:对照组、25μmol/L胆红素组、50μmol/L胆红素组、100μmol/L胆红素组。实验组培养基按照分组浓度,加入相应胆红素溶液,对照组加入相应容积的生理盐水。所有标本继续培养24小时后终止,进行组织固定和免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察,最后行统计学分析。结果不同浓度胆红素作用后,25μmol/L胆红素组中耳蜗神经纤维减少,50μmol/L胆红素组中神经纤维明显减少,100μmol/L胆红素组中神经纤维几乎完全消失,而各组内外毛细胞形态和数量无变化。各胆红素组的神经纤维数与对照组有统计学差异(P<0.05),且各胆红素组之间的神经纤维数有统计学差异(P<0.05)。结论胆红素对于离体培养的新生小鼠的耳蜗神经纤维的毒性作用呈浓度依赖性;在胆红素浓度不超过100μmol/L时,胆红素对于离体培养的新生小鼠的耳蜗组织的内毛细胞和外毛细胞不造成损害。     

新生大鼠耳蜗柯替器体外培养的初步报告

目的 建立稳定的新生大鼠耳蜗柯替器的培养方法，为内耳的研究提供新的条件和模型。方法采用显微解剖技术完整地分离出新生大鼠整个耳蜗基底膜组织，分别采用组织贴壁法及立体定向法进行培养。结果耳蜗柯替器组织块培养24小时后，组织外周即可见明显新生上皮及成纤维细胞，内、外毛细胞及支持细胞等结构清晰可见；经丫啶橙和碘化丙啶双重荧光染色进行细胞活性鉴定，毛细胞及组织活性良好。结论用组织贴壁法及立体定向法进行耳蜗柯替器体外培养是一种理想的耳科实验造模方法。     

大鼠耳蜗器官培养及其组织学检查技术

目的探讨大鼠耳蜗器官体外培养的方法和观察毛细胞、神经纤维及螺旋神经节细胞的组织学检查技术。方法将出生3天的SASCO Sprague Dawley大鼠耳蜗取出平铺培养。应用神经丝免疫组织化学方法对螺旋神经节细胞及神经纤维染色,同时应用鬼笔环肽染色特异性显示耳蜗毛细胞的静纤毛和表皮板。在共聚焦显微镜下应用不同的激发荧光分别显示耳蜗毛细胞、螺旋神经节和神经纤维。结果耳蜗器官经1～3天离体培养,内、外毛细胞生长良好,无衰亡和缺损;神经纤维排列有序;螺旋神经节细胞形态正常。结论本文介绍的耳蜗器官体外培养方法和组织学检查指标,将在常规评估耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞和神经纤维的离体培养损害实验模型中,有一定应用价值。     

顺铂对离体C57小鼠耳蜗毛细胞的损害作用

目的探讨离体培养条件下顺铂致C57小鼠耳蜗毛细胞损伤的特点。方法出生后3～4天的C57小鼠耳蜗基底膜离体培养6～8小时后,加入不同浓度的顺铂（0、10、50、100、400、1000μmol/L）无血清培养液继续培养48小时,其中0μmol/L为正常对照组,10～1000μmol/L组为实验组,0～100μmol/L4组,每组各7只耳蜗,400和1000μmol/L两组各6只耳蜗。采用TRITC-Phalloidin和DAPI染色,荧光显微镜下观察耳蜗毛细胞生长情况并拍照计数、绘制毛细胞缺失图,运用SARS8.0软件进行直线回归分析比较各组的毛细胞缺失率。结果对照组耳蜗基底膜毛细胞在离体培养条件下生长良好,偶见缺失。实验组中顺铂引起毛细胞的缺失程度从底回至顶回大致均匀。随着顺铂浓度从10μmol/L增加到100μmol/L,毛细胞的缺失率从14.5%上升到78.4%;顺铂浓度升高至400μmol/L及1000μmol/L时,毛细胞缺失率下降至48.8%和8.77%。细胞缺失区域可见DAPI着色的浓缩核。结论离体培养条件下,顺铂对耳蜗毛细胞的损伤在一定浓度范围内呈剂量依赖性,超过一定剂量后顺铂所致毛细胞损伤又逐渐减少;内外毛细胞的损伤从底回至顶回呈现均一性。     

15D-PGJ_2对小鼠耳蜗基底膜螺旋神经节氧化损伤的防护作用

目的研究PPARγ激动剂15D-PGJ2对H2O2诱导的离体小鼠耳蜗螺旋神经节氧化损伤的防护作用。方法分离生后3-5 d的小鼠耳蜗基底膜,培养24 h后不同浓度PPARγ激动剂15D-PGJ2(10μM,30μM)预处理24h,再分别加入含有不同浓度H2O2(3mM,6mM)的培养基培养24小时。采用NF200免疫荧光染色方法行离体耳蜗基底膜螺旋神经纤维免疫荧光染色,在免疫荧光显微镜下观察各组螺旋神经纤维形态以及密度改变。结果 3m M H202单独作用于原代培养的基底膜螺旋神经节24h时,螺旋神经纤维呈节断状损失改变,神经纤维逐渐变细局部断裂,染色变淡,神经纤维数量明显降低。随着H202浓度的增加,受损伤的螺旋神经微丝数目呈明显增加趋势。10μM 15D-PGJ2预处理24小时能提高H202损伤后基底膜螺旋神经纤维的数量。30μM 15D-PGJ2预处理组螺旋神经纤维数量明显增加。随着15D-PGJ2浓度提高,其保护作用加强。结论 PPARγ激动剂15D-PGJ2可减轻H2O2诱导的离体小鼠耳蜗基底膜螺旋神经节氧化损伤。     

PET滤膜用于承载耳蜗基底膜培养的实验研究

目的探讨一种适宜耳蜗组织贴壁培养的方法。方法 PET滤膜预先置入层粘连蛋白、鸟氨酸、胎牛血清按2:2:1比例混合均匀的液体中在4℃预孵过夜,选取出生四天的C57BL/6J小鼠作为研究对象。剥取基底膜以PET滤膜作为承载介质培养在加入含青霉素的培液中,48小时后收取样本,进行免疫荧光(一抗goat anti-otoancorin、mouse anti-beta tubu-linⅢ及对应二抗采用cy3 donkey anti goat,647 donkey anti mouse,染核试剂DAPI,phalloidin)观察不同部位细胞,扫描电镜及制备原位超薄切片透射电镜观察体外培养新生小鼠基底膜内外毛细胞、螺旋缘内细胞、螺旋神经元细胞显微结构的改变。结果耳蜗基底膜在PET膜上贴附生长良好。各种细胞的微小结构和超微结构保持正常状态。结论 PET滤膜能作为一种新颖的承载基底膜培养的介质。     

葛根素对庆大霉素所致小鼠耳蜗毛细胞损伤的拮抗效应

目的观察葛根素对庆大霉素所致小鼠耳蜗毛细胞损伤的拮抗效应。方法完整分离小鼠耳蜗基底膜，无血清培养液常规培养24小时，然后同时加入0．3ml庆大霉素和不同浓度葛根素（1mg／ml，2mg／ml，4mg／m1），共同培养24h，并设立平行对照。标本置荧光显微镜下观察，行全耳蜗毛细胞计数，应用全耳蜗毛细胞定量分析软件自动分析，根据耳蜗毛细胞损失率的变化确定葛根素对庆大霉素所致耳蜗毛细胞损伤效应的影响。结果不同浓度组葛根素均表现小鼠耳蜗毛细胞损失率显著降低（P〈O．05-0．01），但以4mg／ml浓度效果最好，呈现剂量依赖性特点。结论葛根素对庆大霉素所致的小鼠耳蜗毛细胞损伤有明显拮抗效应。     

蛋氨酸对离体培养小鼠耳蜗毛细胞顺铂耳毒性的拮抗作用

目的 在培养基中加入顺铂,建立离体培养小鼠耳蜗毛细胞的顺铂损害模型,探讨蛋氨酸对毛细胞的保护作用.方法 32只出生后2 d昆明小鼠,取出耳蜗基底膜,分为4组,每组16个样本,分别用无血清培养液、含顺铂的无血清培养液、含顺铂+蛋氨酸的无血清培养液以及含蛋氨酸的无血清培养液进行离体培养.采用肌球蛋白Ⅵ(myosinⅥ)免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜、光镜、毛细胞计数等方法,观察蛋氨酸对顺铂引起的耳蜗毛细胞损伤的保护作用.结果 对照组和蛋氨酸组基底膜内、外毛细胞未见损伤缺失;顺铂组耳蜗基底膜内、外毛细胞均有不同程度的损伤,与对照组和蛋氨酸组比较,差异均具有统计学意义(P值均＜0.05);顺铂+蛋氨酸组基底膜内、外毛细胞的损伤程度与顺铂组相比明显减轻,差异具有有统计学意义(t内毛细胞=3.929、t外毛细胞=8.582,P值均＜0.05).结论 顺铂能损伤离体培养的小鼠耳蜗基底膜毛细胞,蛋氨酸可以在一定程度上拮抗顺铂对毛细胞的损伤.

Abstract：

Objective To establish an in vitro model of mouse cochlear basilar membrane impairment using cisplatin, and observe the protective effect of methionine on the hair cells. Methods The cochlear basilar membrane samples of thirty two Kunming mice were harvested on the 2nd day after birth and randomly divided into four groups. Each group had 16 samples. Overnight preincubation the cochlear organ followed by appropriate treatment respectively as follows: the serum-free culture medium, the serum-free culture medium with methionine and cisplatin, the cisplatinum-containing serum-free culture medium, and the methionine-containing serum-free culture medium. The protective effect of methionine for injury of cochlea hair cells induced by cisplatin was observed by myosin-Ⅵ immunofluorescence, lightmicroscop,laser confocal scanning microscope and hair cells counting. Results The outer hair cells(OHC) and inner hair cells(IHC) of control group and methionine group were not damaged. The outer and inner hair cells of cisplatin group were damaged in various degree, and had remarkable difference compared with control group and methionine group(P ＜ 0. 05). The outer hair cells and inner hair cells of cisplatin + methionine group were damaged less than the cisplatin group with remarkable difference (tIHC = 3. 929, tOHC = 8. 582, P ＜0. 05). Conclusions Cisplatinum could damage the cochlear hair cells of the basal membrane in Kunming mice. Methionine might protect against cisplatin's damage on the cochlear hair cells.     

螺旋神经节细胞无血清培养方法的研究

目的：通过对比不同培养条件下螺旋神经节细胞（SGCs）的生长特性,从而确定一种可以获得足够数量和纯度的SGCs体外培养的最佳方法。方法：采用出生3d内的SD大鼠,取螺旋神经节组织,观察有血清培养基及无血清培养基,加或不加阿糖胞苷（Ara—c）对体外培养SGCs纯度及活性的影响。免疫组织化学鉴定培养的螺旋神经节细胞。结果：使用DMEM／F12培养基及B27添加剂,联合5μmol／L Ara-c作用48h,能有效抑制非神经细胞增殖,得到比较纯的SGCs。通过hochest33258及PI双标,发现Ara-C对SGCs毒性较小。得到的细胞经免疫组织化学抗神经丝蛋白抗体证实为SGCs。结论：本实验建立的方法,所获得的SGCs纯度较高,细胞活性保持良好,为体外研究外周听觉系统疾病提供了重要方法。     

活性氧诱导离体大鼠耳蜗Corti器毛细胞凋亡的观察

目的探讨氧自由基中毒后耳蜗毛细胞有无凋亡及其变化规律。方法选用新生1～5d龄SD大鼠24只,随机分为4组。每组6只（12耳）：①无血清培养液组（H2O2浓度为零）;②0．05mmol／LH2O2组;③0．1mmol／LH2O2组;①0．5mmol／LH2O2组。分离Cord器,并用尖刀按顶回、中回、底回将其分为3段,分别放人相应浓度的H2O2培养液中培养．培养结束后用丫啶橙／碘化丙啶双重染色技术检测并计数凋亡的毛细胞。结果不同浓度H2O2组均检测到凋亡毛细胞,外毛细胞（OHC）是H2O2攻击的主要靶细胞,而支持细胞无凋亡。底回毛细胞损伤明显重于顶回和中回,各回外毛细胞损伤明显高于内毛细胞;随H2O2浓度增加,各回凋亡细胞增加。结论本实验条件下,外源性H2O2可直接诱导离体培养大鼠耳蜗Corti器毛细胞凋亡。支持细胞无凋亡。     

Synaptophysin immunohistochemistry in the human cochlea

Light microscopy and immunohistochemical analyses of a freshly prepared human cochlea, removed at meningioma skull base surgery, were performed with particular emphasis on synaptophysin (SY) reactivity. Synaptophysin, a 38-kDa glycoprotein, is one of the most abundant integral membrane proteins of small presynaptic vesicles and is a useful marker for sites of synaptic transmission of the efferent olivocochlear system in the cochlea. Following fixation and decalcification, cryosections of 30 microm were prepared. To introduce immunostaining, free-floating sections were exposed to monoclonal SY antibody. Positive SY immunostaining was solely restricted to the neural and sensory structures and did not include supporting cells of the organ of Corti. Dense reaction products were noted around the hair cells, especially at the basal portion of the inner and outer hair cells and their neural poles, as well as around the inner spiral bundle, tunnel spiral bundle, outer spiral bundle and upper tunnel crossing fibers. The majority of spiral ganglion cells stained positively. An intermingling network of thin unmyelinated nerve fibers stained densely, especially at the basal portions of the cochlea. The spiral limbus, inner and outer sulcus cells, basilar membrane, myelinated nerve fibers, spiral ligament and the stria vascularis were unstained. Human cochlea obtained during surgery offers excellent conditions for immunohistochemical analysis. In the basal cochlea in the organ of Corti, outer hair cell area, there may be alterations due to noise trauma from the drilling procedure.     

体外培养小鼠耳蜗Corti器对庆大霉素的吸收

目的 观察庆大霉素-德州红耦联物在体外培养小鼠耳蜗Corti器的分布情况,比较不同时间庆大霉素吸收的差异.方法 分离小鼠耳蜗Corti器,体外培养,培养液中加有庆大霉素-德州红耦联物,分别于培养后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、3 d.4 d和7 d收集标本,荧光染色后行激光扫描共聚焦显微镜观察基底膜庆大霉素的分布情况.结果 小鼠耳蜗Corti器在培养3 h后即可见外毛细胞的纤毛和胞体两侧的胞膜有庆大霉素分布;随着培养时间的延长,庆大霉素在Corti器中的所有细胞均见分布,尤以外毛细胞明显,主要聚集在毛细胞顶端纤毛的下方;培养24 h后庆大霉素在外毛细胞的聚集达到最高峰,而在支持细胞未见明显的聚集;体外培养7 d后在毛细胞胞质中仍可见庆大霉素分布.结论 小鼠Corti器体外培养可用来动态检测庆大霉素在耳蜗细胞的吸收和聚集情况.     

N-乙酰半胱氨酸对活性氧诱导耳蜗毛细胞凋亡的抑制作用的观察

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)对活性氧诱导耳蜗毛细胞凋亡的抑制作用。方法选用新生1～5天SD大鼠24只,随机分为4组,每组6只12耳:①无血清培养基组;②0.1mmol/L H2O2组(H2O2组);③10mmol/L N-乙酰半胱氨酸组(NAC组);④10mmol/L NAC+0.1mmol/L H2O2组(NAC+H2O2组)。分离各组动物Corti器,分别放入相应培养液中培养,培养结束后用丫啶橙(YO)/碘化丙啶(PI)双重染色技术检测并计数凋亡毛细胞。结果 NAC组耳蜗基底膜的形态结构与无血清培养基组无明显差异,未见凋亡细胞;H2O2组可见大量凋亡细胞,细胞形态发生改变,出现水肿及碎裂,还有部分细胞缺失;NAC+H2O2组细胞仍保持完好形态,只见少许凋亡细胞。结论抗氧化剂NAC对外源性H2O2诱导的耳蜗毛细胞凋亡有抑制作用。     

Ultrastructure and immunohistochemical identification of the extracellular matrix of the chinchilla cochlea

The molecular composition and three-dimensional organization of the extracellular matrix (ECM) was studied by immunofluorescent microscopy, transmission and scanning electron microscopy in three connective tissue structures of the cochlea: the spiral limbus, basilar membrane and spiral ligament. Type II collagen, fibronectin, tenascin, chondroitin sulfate proteoglycans, alphav and beta1 integrins were immunolocalized in the ECM of these connective tissue structures. Electron micrographs showed a continuum of cross-striated collagen fibrils having a similar diameter and axial periodicity that spread from the spiral limbus via the basilar membrane and into the spiral ligament. Some of collagen fibrils were aggregated laterally into bundles. Bundle images, and their digital Fourier transformations, showed a major 67-nm axial D-repeat characteristic for collagen fibrils. Transmission electron microscopy showed numerous proteoglycans associated with the collagen fibrils. The spiral limbus, basilar membrane and spiral ligament demonstrated regional differences in molecular composition and structural organization of their ECM. The glycoproteins fibronectin, tenascin and alphav integrin were immunolocalized mainly in the basilar membrane. Collagen fibrils of the spiral limbus and spiral ligament did not appear to be strongly oriented. However, most of the collagen fibrils in the basilar membrane were arranged into radially directed bundles. Collagen fibrils in the basilar membrane were also surrounded by a homogeneous matrix, which was immunoreactive to fibronectin and tenascin antibodies. A more complete understanding of the composition and structural organization of the ECM in these connective tissue structures in the cochlea provides a foundation upon which micromechanical models of cochlear function can be constructed.