小鼠Reelin 基因启动子克隆鉴定及生物信息学分析

目的克隆小鼠Reelin基因启动子区并分析其潜在DNA甲基化位点和转录因子结合位点。方法根据NCBI上小鼠Reelin 5’非翻译区序列设计引物,利用高保真PCR方法克隆昆明小鼠Reelin启动子区序列,并进行TA克隆,测序鉴定。利用亚硫酸氢钠处理基因组DNA,通过PCR技术和测序技术对Reelin启动子-636 bp至-135bp序列甲基化情况分析。应用Methyl Primer Express software V1.0和TFSEARCH软件分析该区域甲基化位点和转录因子结合位点。结果成功克隆了小鼠Reelin基因启动子区0至-450片段。甲基化测序分析小鼠Reelin启动子区-636 bp至-135 bp序列没有CpG二核苷酸被甲基化。小鼠Reelin翻译起始点0至-450片段利用CpG岛序列分析软件分析显示,该区域C+G含量高达78.71%,CpG含量为14.44%。该区域有120多个潜在转录因子结合位点。结论在小鼠Reelin基因启动子区0～-450发现有一个CpG岛和多个转录因子结合位点,该区域可能在小鼠Reelin基因表达调控起重要作用。     

甲基化CpG结合域蛋白1和VIMENTIN在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)和VIMENTIN蛋白在胰腺癌组织中的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测40例经手术切除的胰腺癌组织和10例良性肿瘤患者的正常胰腺组织中MBDI和VIMENTIN蛋白的表达.结果 在40例胰腺癌标本中有28例(70.0%)MBD1呈阳性表达,16例(40.0%)VIMENTIN蛋白呈阳性表达,显著高于正常胰腺组织标本的1例(1/10)和0例(P值均<0.05).MBD1与VIMENTIN蛋白的阳性表达呈正相关(r=0.423,P=0.012).在有淋巴结转移的胰腺癌中的MBD1表达阳性率显著高于无淋巴结转移的胰腺癌(P=0.023).在病理分化较差和有淋巴结转移的胰腺癌中的VIMENTIN表达阳性率显著高于病理分化较好及无淋巴结转移的胰腺癌(P值分别=0.027、0.003).结论 胰腺癌组织中存在MBD1和VIMENTIN的过表达,并与病理分级和淋巴结转移有关,MBD1可能通过调控甲基化过程,干预VIMENTIN的表达,在胰腺癌的发生、发展中起到重要作用.     

TFF1在肺癌中的表达及作用研究

目的 研究三叶因子1（TFF1）在肺癌组织及肺癌细胞株中的表达、甲基化状态及其功能。方法 选取98 例非小细胞肺癌患者手术切除的肺癌组织,采用RT-PCR、MSP 检测TFF1 在肺癌组织中的表达与甲基化状态,分析其与患者临床特点的相关性,以及检测肺癌细胞株H23、H1299、L78、H446、H157 及95D 中TFF1 的表达和甲基化状态以及5-aza-2''-deoxycytidine（DAC）处理后细胞株中TFF1 表达的变化。TFF1 转染H23 细胞株,MTT 法及克隆形成实验检测其增殖能力和克隆能力的变化,细胞凋亡实验及Western blot 检测凋亡相关蛋白Caspase3 表达水平。结果 TFF1 在肺癌组织中的甲基化率为56.1%（55/98）。TFF1 甲基化与肺癌患者的TNM 分期和淋巴结转移显著相关（P＜0.001）。TFF1 在H23 和H157 中无表达,在H1299、H446 及95D 中表达较低,在L78 中表达较高。DAC 处理后,细胞株TFF1 表达的变化分别为表达恢复（H23、H157）,表达增强（H1299,H446,95D）和无明显改变（L78）。恢复表达TFF1 后,H23 细胞株的增殖及克隆形成能力明显减弱（P＜0.05）,细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Caspase3 活性片段的表达明显增加。结论 TFF1 在肺癌组织中的甲基化状态与肺癌的TNM 分期和转移密切相关。TFF1 在肺癌细胞中的表达受DNA 甲基化的调控。肺癌细胞株H23 中恢复表达TFF1 可以抑制其增殖和克隆能力,促进其凋亡。     

OPRM1基因DNA甲基化在物质依赖中的研究进展

物质依赖是指个体强烈地或不可自制地反复渴求滥用某种药物.尽管心理上知道经常、多次服用这种物质会给自己带来不良后果, 但仍然无法控制自己的行为.常使用的物质包括酒、海洛因、摇头丸、K粉、冰毒、大麻等.物质成瘾的调控模式由社会、环境、生物学等因素相互交织构成.其中生物学因素主要通过药物作用于中枢神经系统, 产生强大的奖赏效应.OPRM1是大多数物质依赖产生躯体依赖、戒断症状等成瘾行为的物质基础之一.研究表明OPRM1启动子高甲基化可以增加酒精依赖综合征和其他物质依赖的患病风险.就OPRM1基因的DNA甲基化与物质依赖的关联性作一综述.     

乙醇脱氢酶含铁1在恶性肿瘤中的研究进展

乙醇脱氢酶含铁1(alcohol dehydrogenase iron containing 1, ADHFE1)属于乙醛脱氢酶家族成员,该基因编码羟基酸-氧酸转氢酶,负责哺乳动物4-羟基丁酸的氧化。ADHFE1具有促进肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和上皮细胞间充质转化的作用,并且与肿瘤发生、发展密切相关。研究表明,ADHFE1在多种癌症中均异常表达,其在恶性肿瘤组织中的mRNA表达和DNA启动子甲基化水平与患者的预后不良相关。因此,本文就ADHFE1在肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌和食管癌等恶性肿瘤方面追踪了国内外基础与临床研究进展,并系统分析了ADHFE1通过c-Myc、cyclin D1/p21/p27/p53信号通路调控肿瘤发生和发展的机制,为有效制定临床治疗策略、进一步提高临床早期诊断与治疗提供借鉴和参考。     

喉鳞状细胞癌中RASSF1A基因启动子区甲基化及蛋白表达

目的：探讨RASSF1A基因启动子区甲基化与喉癌的关系。方法：运用甲基化特异性PCR,检测RASSF1A基因在48例喉癌组织、相对应癌旁组织及48例正常人外周血中的启动子区甲基化情况。用Western blotting方法检测喉癌组织、癌旁组织及正常人外周血中RASSF1A表达情况。结果：在48例喉癌组织、相对应的癌旁组织和48份正常人外周血中,RASSF1A基因启动子区分别有34例（70.83%）、11例（22.92%）和6例（12.50%）发生了甲基化, 喉癌组织甲基化程度明显高于癌旁组织和正常人外周血（P<0.05）。在48例喉癌组织中27例（56.25%）不能正常表达RASSF1A蛋白,而相对应癌旁组织中仅有8例（16.67%）,喉癌组织中RASSF1A蛋白的表达程度明显低于癌旁组织(P<0.01)。启动子区发生甲基化的34例喉癌组织中共有25例（73.53%）呈弱阳性,而7例未发生甲基化的喉癌组织中为1例（14.29%）,两组间比较差异具有显著性(P<0.05)。结论：RASSF1A基因启动子区甲基化与喉癌的发生有关,有望成为喉癌诊断的分子标志。     

p16甲基化在宫颈癌癌变中的作用研究

p16基因又称多肿瘤抑制基因,是人们发现的第一个直接作用于细胞周期,抑制细胞分裂的基因。DNA甲基化是抑癌基因失活的机制,p16基因甲基化及其在子宫颈癌癌变中的作用机制还不清楚。本文对宫颈癌中p16基因甲基化的相关研究内容进行综述。     

乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

目的：检测乳腺癌雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）基因启动子区CpG岛甲基化状态,探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达,同时运用甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高（P〈0.05）;ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高（P〈0.05）。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关,后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。     

PTPRO基因启动子甲基化在大肠癌中的表达及作用

目的 :研究大肠癌组织及癌旁正常组织PTPRO基因启动子甲基化状态及m RNA表达情况,并探讨其在大肠癌发生中的关系。方法 :应用甲基化特异性PCR(MSP)和RT-PCR分别检测30例大肠癌组织及癌旁正常组织中PTPRO基因启动子甲基化状态及m RNA表达状态。结果 :大肠癌组织中PTPRO基因启动子甲基化率高于癌旁正常组织,其甲基化样本中PTPRO基因m RNA表达明显受抑。结论 :PTPRO基因启动子甲基化在大肠癌发生中起着重要作用,可能与大肠癌的发生、发展及预后有关。     

c—Ha—ras癌基因低甲基化在胃癌形成中的作用

应用ｃ－Ｈａ－ｒａｓ（６．６Ｋｂ）探针检测人类胃癌组织中ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因序列中５＇－ＣＣＧＧ－３＇甲基化状态，根据胃组织ＤＮＡ用ＨｐａⅡ酶切、杂交后所显示的杂交带的位置和出现的频率不同，并且与ＭｓｐＩ酶切、杂交带型比较来判定ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因甲基化程度的差异。本组胃癌ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因低甲基化发生率是４５％，癌旁组织中发生率是１５％，ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因低甲基化是胃癌发生的重要早期事件。     

清道夫受体B1基因启动子甲基化与冠心病的关联分析

目的 探讨清道夫受体B1(SCARB1)基因启动子区域甲基化与冠心病发病的关联性。方法 选取2018年12月至2020年5月在上海交通大学医学院附属仁济医院就诊的120例冠心病患者作为病例组，并随机选取同期健康体检人群中性别和年龄匹配的140名健康受试者作为对照组，进行病例对照研究。采用亚硫酸盐转化，扩增目标区域后采用高通量测序对基因组进行甲基化检测，分析两组SCARB1基因启动子区域CpG位点的甲基化差异。结果 病例组SCARB1+67基因的甲基化水平显著高于对照组(P<0.001),SCARB1+134基因的甲基化水平显著低于对照组(P<0.001),且在男性(P均<0.001)、女性(P均<0.001)冠心病患者中与对照组比较差异有统计学意义。病例组SCARB1基因的平均甲基化水平显著低于对照组[(80.27±2.14)%比(81.11±1.27)%;P=0.006],且只在男性冠心病患者中差异有统计学意义(P=0.002)。结论 SCARB1基因的甲基化水平与冠心病的发病存在关联，可能参与其发生发展过程。     

DNA甲基化在肿瘤发生中的作用

在肿瘤发生中，DNA异常甲基化表现为遗传和表遗传两种效应。遗传效应通过甲基化胞嘧啶的自发性脱氨和增加外来致癌物的亲和力等方式起作用，引起基因突变频率增加。而通过DNA CpG岛的甲基化使某些重要基因失去功能是肿瘤发病中的一个重要因素。     

DNA甲基化在常见自身免疫性疾病中的作用

自身免疫性疾病是指在某些因素刺激下,机体的免疫系统针对自身抗原发生免疫应答,形成自身抗体而导致机体受损所引起的疾病,如1型糖尿病、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病等。目前表观遗传学为当今医学研究一大热点,其中DNA甲基化作为重要组成部分,在自身免疫性疾病的发生中起到重要作用。本文以常见自身免疫性疾病为例,重点阐述DNA甲基化在自身免疫性疾病中的作用,从而加强对该类疾病的认识,为临床治疗提供新线索。     

谷氨酸受体与LTP的形成及其在学习记忆中的作用

脑的学习与记忆功能是一个相当复杂的生理过程,1973年,长时程增强(1ong-term potentiation,LTP)现象的发现,首次为人类展示了中枢神经系统内与记忆过程具有高度相似性的突触功能的改变[1].     

受体相互作用蛋白3在大鼠皮质神经元坏死性凋亡信号通路中的作用

目的 探讨坏死性凋亡信号通路中受体相瓦作用蛋白3(RIP3)的胞内定位以及其在该信号通路中的作用,并进一步研究RIP3核移位是否与受体相互作用蛋白1(RIPI)存在相关性.方法 SD大鼠原代皮质神经元细胞培养12d,zVAD预处理30min.(1)肿瘤坏死因子(TNFα)处理小同时间点,western blot检测胞质、胞核中RIP3蛋白水平,结合免疫荧光观察RIP3的胞内定位.(2)应用Nec-1及慢病毒干扰RIP1,检测胞浆和胞核中RIP3的蛋白水平变化以及相应的RIP1表达水平的变化,并检测各组培养基中乳酸脱氢酶(LDH)含量变化.结果 (1)在坏死性凋亡信号通路中,随着TNF作用时间的延长,RIP3蛋白含量逐渐增加,胞质中蛋白含量在8h达高峰,随后下降,同时胞核中蛋白水平在12h出现核转位的高峰(胞浆分另0为0.45 ±0.03,0.41±0.02,0.73 ±0.03,0.90±0.01,1.15±0.04,1.30±0.02,0.99±0.03,0.63±0.03;胞核分别为0.07±0.02,0.26±0.02,0.57±0.02,0.68 ±0.02,0.80 ±0.01,0.92±0.02,1.28±0.03,0.87±0.02),差异有显著性(P<0.01).(2)应用Nec-1以及慢病毒干扰RIP1表达后,发生核转位的RIP3减少,且LDH水平较前降低(1.00±0.05,0.39±0.03,0.50±0.03),差异有显著性(P<0.01).结论 正常细胞中RIP3存在于胞质,坏死性凋亡时发生核移位,RIP1是RIP3发生核转位必不可少的相关蛋白,且阻断RIP3核移位可以对抗细胞凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the location of receptor interacting protein 3( RIP3) in Necroptosis and its function in this signal passage, and explore the relationship between receptor interacting protein 1 ( RIP1 ) and RIP3 in nuclear translocation. Methods Primary cerebrocortical neurons were cultured for 12 days,then pre-treated with zVAD-fmk(20μ,mol/L) for half an hour to block apoptosis. ①Extracting nuclear and cytoplasmic protein after neurons were exposed to TNF for different time ,then protein levels of RIP3 were analyzed by western blot and immunofluorescence for qualitative observation;②In the following research,the neurons were treated with Nec-1 and shRlPl ,then the protein level of RIP1 and RIP3 with western blot were analyzed, cell viability were determined by measuring LDH levels. Results ①In signaling pathways of necroptosis, the protein level of RIP3 in cytoplasmic decreased gradually with prolonged TNF exposure, to the corresponding it rolled up in nucleus and a-chieved the peak in 12 hours of TNF treatment ( Cytoplasmic 0. 45 ± 0. 03 ,0. 41 ± 0. 02,0. 73 ± 0. 03 ,0. 90 ± 0.01,1.15 ±0.04,1.30 ±0.02,0.99 ±0.03,0.63 ±0. 03;Nucleus 0. 07 ±0.02,0. 26 ±0.02,0. 57 ±0. 02,0. 68 ± 0.02,0. 80 ± 0.01,0.92 ± 0.02,1.28 ± 0.03,0. 87 ± 0.02) (P < 0.01). ②Blocking the relationship between RIP1 and RIP3 with necrostatin-1 and shRIPl , nuclear translocation of RIP3 decreased and caused a great increase in cell viability( 1.00 ±0.05,0.39 ±0.03,0.50 ±0. 03) (P<0. 01). Conclusion RIP3 mainly locates in cy-tolymph of normal cells,it translocates into nucelus as necroptosis takes place. RIP1 function with RIP3 in nuclear translocation. Block nuclear translocation of RIP3 is a potential way to protect cells.     

N-甲基-D-天门冬氨酸受体在学习记忆中的作用研究进展

~~N-甲基-D-天门冬氨酸受体在学习记忆中的作用研究进展@张彦文$第三军医大学预防医学系劳动卫生学教研室!重庆400038MD受体;;学习记忆;;LIP~~     

DNA甲基化在热休克诱导细胞周期素D1表达水平降低中的转录调控机制

目的研究DNA甲基化在热休克诱导的人细胞周期素D1基因启动子活性下降调控中的作用。方法 DNA甲基化通过甲基化特异性PCR方法检测。甲基化位点突变采用Stratagene公司定点突变试剂盒。甲基化位点的作用通过报告基因技术分析启动子活性确认。结果热休克处理可能造成细胞周期素D1基因启动子+65/67位点发生DNA甲基化,而突变该位点逆转了由报告基因活性分析研究的热休克效应。结论启动子+65/67位点的DNA甲基化可能调控细胞周期素D1的热休克效应。     

表观遗传机制在神经系统疾病中的作用

表观遗传是指DNA序列不发生变化,而基因表达发生可遗传改变的现象,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等4个主要调控机制。神经系统疾病是发生于中枢神经系统、周围神经系统、自主神经系统的以感觉、运动、意识、自主神经功能障碍为主要表现的疾病,病因复杂,是目前对人类危害最大的疾病之一。研究发现,神经系统疾病的发生、发展与表观遗传机制相关,这些研究为神经系统疾病的治疗提供了潜在靶点,具有积极意义。本文就有关表观遗传调控机制及其在神经系统疾病中作用的最新研究进展进行综述。