CYP3A4和CYP286药物诱导剂体外筛选体系的建立

目的构建CYP酶药物诱导剂的体外筛选技术平台。方法利用双荧光素酶报告基因系统，将包含hPXR蛋白识别和结合调控元件的CYP3A4和286启动子序列插入报告基因上游，将表达载体和报告载体共转染HepG2细胞，用含有利福平或DMSO培养基培养48h后裂解进行双荧光素酶活性检测。结果经利福平处理的细胞裂解物荧光素酶比活性值与阴性对照组和溶剂组差异显著。结论本研究构建的CYP3A4和286体外筛选平台，可以有效地用于体外诱导剂的筛选。     

CYP3A4内含子10对CYP3A4基因表达的增强子作用

目的 探讨CYP3A4内含子10及其内SNP CYP3A4*1G对CYP3A4基因表达的调控作用.方法构建CYP3A4启动子启动转录的CYP3A4真核表达质粒, 将CYP3A4内含子10 (CYP3A4*1G野生型/突变型) 正向或反向插入该质粒的启动子上游, 从而构建出不同基因型、不同方向的CYP3A4内含子10调控的CYP3A4真核表达质粒.将构建好的各质粒分别转染入Hep G2细胞, 应用实时荧光定量PCR方法检测CYP3A4 m RNA表达水平.结果 构建的重组质粒经酶切验证与测序鉴定, 插入片段的序列和方向与预期完全一致.无论CYP3A4*1G野生型还是突变型, 反向组CYP3A4 m RNA表达水平均高于正向组 (P<0.01) ;而CYP3A4内含子10无论是正向还是反向, CYP3A4*1G野生型组CYP3A4 m RNA表达水平均高于突变型组 (P<0.01) .此外, 正向突变组CYP3A4 m RNA表达水平低于阳性对照组, 不但没有增强CYP3A4启动子的转录作用反而有所减弱.结论CYP3A4内含子10有类似于增强子的功能, 能够影响CYP3A4启动子对CYP3A4基因的转录, 且具有方向性和CYP3A4*1G等位基因依赖性.     

糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用

目的 探讨糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用. 方法 采用DNA重组技术构建ptracer-hGR重组质粒,并用报告基因检测方法研究糖皮质激素受体对CYP3A5药物代谢酶转录、表达调控中的信号转导作用. 结果 菌落PCR及测序证实成功构建ptracer-hGR重组质粒.经阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物加药后共转染ptracer-hGR质粒的实验组荧光素酶相对活性显著高于单纯转染CYP3A5报告基因质粒的对照组,差异具有统计学意义(P=0.0362、0.0034和0.0164);而卡铂和米托蒽醌加药后,荧光素酶相对活性无明显增高趋势. 结论 阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物可能通过激活糖皮质激素受体这一信号途径而上调CYP3A5 mRNA的转录.     

糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用

目的 探讨糖皮质激素受体在白血病CYP3A5耐药中的信号转导作用. 方法 采用DNA重组技术构建ptracer-hGR重组质粒,并用报告基因检测方法研究糖皮质激素受体对CYP3A5药物代谢酶转录、表达调控中的信号转导作用. 结果 菌落PCR及测序证实成功构建ptracer-hGR重组质粒.经阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物加药后共转染ptracer-hGR质粒的实验组荧光素酶相对活性显著高于单纯转染CYP3A5报告基因质粒的对照组,差异具有统计学意义(P=0.0362、0.0034和0.0164);而卡铂和米托蒽醌加药后,荧光素酶相对活性无明显增高趋势. 结论 阿糖胞苷、甲氨蝶呤和长春新碱三种化疗药物可能通过激活糖皮质激素受体这一信号途径而上调CYP3A5 mRNA的转录.     

6种中药单体对人孕烷X受体介导细胞色素酶P450 3A4转录的调节作用

目的研究6种中药单体野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷、黄芪甲苷以及黄芩素是否可以通过诱导孕烷X受体(PXR)介导细胞色素酶P4503A4(CYP3A4)转录表达。方法采用脂质体瞬时转染的方法,将人PXR表达质粒、CYP3A4报告质粒以及内参质粒转入LS174T细胞中,建立报告基因体系,与不同浓度及不同给药时间的中药单体共同孵育,检测细胞中荧光素酶的活性。结果黄芩素(20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L)分别诱导PXR介导CYP3A4表达(1.49±0.23)倍(P<0.05)、(2.45±0.56)倍(P<0.01)和(5.27±0.40)倍(P<0.01),野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷和黄芪甲苷在实验的浓度范围内不能明显诱导LS174T细胞中PXR介导CYP3A4表达。在不同给药时间实验中,20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L的黄芩素在12～48h能诱导PXR介导CYP3A4表达,诱导能力随时间的延长而呈增强的趋势,各浓度的最大诱导倍数均在48h出现。结论黄芩素在LS174T细胞系中可以通过诱导PXR介导CYP3A4转录表达,而野黄芩苷、丹皮酚、芍药苷、甘草苷或黄芪甲苷无此作用。     

细胞色素氧化酶3A4启动子报告基因的构建及其活性检测

目的建立细胞色素氧化酶(cytochrome P-450,CYP)3A4启动子报告基因并在孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达阳性的肿瘤细胞中检测其转录活性。方法利用PCR扩增CYP 3A4的启动子区远端调控序列(-7836/-7208)和近端调控序列(-362/+52)序列;将上述序列克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测CYP 3A4报告基因的活性。结果在肝癌细胞系中,PXR的激动剂利福平能够剂量依赖性地诱导远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和近端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.95;P=0.011)的活性,EC50为(5.65±0.58)μmol/L和(8.91±1.12)μmol/L;PXR的拮抗剂酮康唑能够剂量依赖性地抑制利福平诱导的远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和PXRELuc(R2=0.92;P=0.003 4)活性,IC50为(0.55±0.08)μmol/L和(0.94±0.14)μmol/L。此外,多种化疗药物(PXR的潜在配体)能够在PXR阳性的肿瘤细胞系中诱导远端调控序列荧光素酶报告基因和近端调控序列荧光素酶报告基因的活性。结论成功构建了CYP 3A4启动子报告基因,在此基础上建立了在不同肿瘤细胞中检测PXR转录活性的方法。     

银杏叶及其化学成分对CYP3A4和CYP2C9影响的研究进展

银杏叶是临床上使用广泛的中草药之一,主要化学成分包括黄酮类和萜类内酯两大类。近年来,国内外大量的研究表明银杏叶及其化学成分能够影响细胞色素P450酶的表达,并通过细胞色素P450酶影响其他药物的代谢。现从银杏叶及其化学成分对CYP3A4和CYP2C9的影响,及其通过CYP3A4、CYP2C9影响其他药物代谢等方面进行综述。     

人肝脏组织CYP3A4酶活性的高效液相色谱法测定

目的:建立测定人体肝脏组织中CYP3A4酶活性的HPLC方法。方法:取21例肝癌、16例肝血管瘤、13例胆组织病变患者的肝组织,制作肝微粒体,体外孵育后以咪达唑仑(MDZ)为探针药物,用高效液相色谱法测定CYP3A4的Km值。HPLC色谱条件:色谱柱为AngelC-18柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为甲醇:乙腈:水(体积比53:13:34),流速1mL/min,检测波长220nm,柱温25℃,进样量40μL。结果:1’-OHMDZ与MDZ的出峰时间分别为10.05与15.02min,分离充分(R>1.5),1’-OHMDZ质量浓度的范围为200～6000μg/L,高、中、低浓度回收率均>90%,日内、日间精密度RSD均<5%,稳定性RSD均<5%。50例患者Km值1.75～30.17μmol/L;不同性别、年龄及肝胆病变患者的Km值差异无统计学意义(P>0.05)。结论:该法稳定、快速、重复性好,可用于人体肝组织中CYP3A4酶活性的测定;性别、年龄及肝胆病变情况对CYP3A4酶活性无影响。     

受体介导甲胎蛋白对NIH3T3细胞增殖的促进作用

目的:探讨甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)促新生细胞增殖作用的分子机理。方法:从人脐带血中提取的AFP作用于体外培养的NIH3T3细胞;用3H-TdR参入法观察AFP对细胞DNA合成的影响以及放射受体分析法分析NIH3T3细胞膜表面AFP受体分布;观察在AFP作用下细胞内的第二信使物质环磷酸腺苷(cAMP)浓度及依赖cAMP激活的蛋白激酶A(PKA)活性的改变;Westernblot分析AFP对增殖相关的P21ras表达的影响。结果:10～80mg/L的AFP对NIH3T3细胞的DNA合成有明显的促进作用,与对照组比较最大增幅为121.9%;在NIH3T3细胞膜表面存在2种不同解离平衡常数(KD)的AFP受体,KD1=2.722nmol/L(12810位点/细胞);KD2=89.305nmol/L(119700位点/细胞);AFP能显著提高NIH3T3细胞内的cAMP浓度及PKA活性;对P21ras的表达也有明显的促进作用。结论:AFP促NIH3T3细胞增殖是通过细胞膜表面受体介导,经跨膜cAMP-PKA信号转导途径,影响基因表达来实现的。     

SiRNA表达载体介导的RNA干涉对人核受体的NR5A2的表达抑制研究

目的：探讨经载体介导的RNA干涉对人核受体NRSA2表达抑制的可行性。方法：设计并构建人nr5a2特异siRNA表达载体pSilencer1．0-U6-nrSa2。经脂质体介导转入肝癌细胞BEL-7402，RT—PCR分析nr5a2表达情况。结果：瞬时转染重组载体pSilencev1．0-U6-nr5a2的BEL-7402细胞其nrSa2的表达明显受抑。抑制效率可达70％。结论：siRNA表达载体介导的RNA干涉可在细胞水平有效抑制BEL-7402细胞nr5a2的表达。     

ROLE OF COXSACKIEVIRUS AND ADENOVIRUS RECEPTOR （CAR） IN CARDIOTOXICITY INFECTED BY COXSACKIEVIRUS B3

Objective To explore the role of coxsackievirus and adenovirus receptor（CAR） in cardiotoxicity infected by coxsackieviras B3. Methods A toxic cellular model was established in vitro by adding myocarditic coxsackievirus B3 （CVB3m） into the culture of neonatal mouse cardiomyocytes. 48 h later, the cardiomyocytes were divided into control, CVB3m, and CAR antibody ＋ CVB3m groups. CVB3m-mediated myocytopathic effect of above three groups was observed after further culturing for 48h. At the same time, the cardiomyocytes＇ viability of above three groups was assessed by MTT assay. Results The degree of cytopathic effect（CPE） of CAR antibody ＋ CVB3m group was significantly lower than CVB3m group （ P 〈 0. 01 ） and there was a significant increase in cell viability in CAR antibody ＋ CVB3m group compared with CVB3m group（ P 〈 0. 01 ）. No significant difference was found between CAR antibody ＋ CVB3m group and control group. Conclusion CAR antibody possesses a protective effect on CVB3m infected cardiomyoctyes, which indicates that CAR may play an important role in mediating cardiotoxicity infected by CVB3m.     

类固醇受体辅活化子-1在雄激素非依赖性前列腺癌中表达的研究

目的:探讨类固醇受体辅活化子-1(SRC-1)在雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)的表达和临床意义.方法:采用免疫组化法检测15例AIPC、20例雄激素依赖性前列腺癌(At)pc)、20例前列腺增生(BPH)标本SRC-1的表达.结果:SRC-1在AIPC、ADPC、BPH表达的阳性率分别为(73.16±9.02)、(55.50±4.32)、(49.00±2.83),AIPC与ADPC、BPH之间SILC-1表达的阳性率有显著的差异(P<0.01).根据前列腺癌的不同分级,SKC-1在高、中、低分化肿瘤表达的阳性率分别为(57.00±8.25)、(66.67±9.93)、(75.67±6.02),组间的差异具有显著统计学意义(P<0.01).对肿瘤的不同分期,SKC-1表达的阳性率分别为(71.67±11.20)(D)、(69.33±5.20)(C)、(59.67±6.06)(B)、(52.17±5.27)(A),相邻分期之间SKC-1表达的阳性率差异不显著(P0.05).结论:前列腺癌复发可能与SKC-1表达升高有关.     

CD_3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用机制的研究

目的 :探讨 CD3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用的机制。方法 :将卵巢癌细胞株 (A2 780 )分成两组 ,实验组采用 CD3AK+ A2 780 ,对照组采用 L AK+ A2 780 ,分别共育 2 4h并于作用前和作用后每 4h收集一次上清液以检测 TNF- α和 IFN- γ分泌水平。结果 :实验组和对照组共育前、后上清液中均有 TNF- α和 IFN- γ分泌 ,但共育后 TNF- α和 IFN- γ分泌水平显著高于共育前 (P <0 .0 1) ,且同一效靶比的实验组 TNF- α和 IFN- γ分泌水平明显高于对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :CD3AK细胞可通过分泌细胞因子 TNF- α和 IFN- γ杀伤肿瘤细胞。     

大蒜阻断串珠镰刀菌促进二甲基亚硝胺合成的观察

大蒜可抑制致癌性霉菌-串珠镰刀菌的生长及阻断该菌还原NO_3~-产生N0_2~-和促进二甲基亚硝胺合成的作用,为食用大蒜作癌症的病因性预防提供了一定的科学依据。     

甲氰咪胍对垂体-性腺轴的调节作用

研究了组织胺H_2受体拮抗剂甲氰咪胍对垂体-性腺轴的影响。发现甲氰咪胍能显著减小LHRH刺激下LH、FSH和T反应曲线下绝对面积、降低峰值与基础值的比值和延缓峰值出现时间;而DHT分泌则无显著改变。研究结果表明组织胺H_2受体拮抗剂能抑制垂体LH和FSH的释放,由此使睾丸间质细胞T分泌减少。     

腺病毒介导AT2R基因转染表达抑制肾间质纤维母细胞增殖

目的 :探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)表达对人肾间质纤维母细胞 (hRIF)增殖的影响。方法 :构建携带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV -AT2R) ,转染体外培养hRIF并检测AT2RmRNA表达及细胞表达率 ,用细胞周期分析、分裂指数、MTT比色法和 5 -溴尿苷 (BrdU)掺入法检测hRIF增殖。结果 :构建的AdCMV -AT2R体外转染培养hRIF表达率为 90 .5 7%。AT2R峰值表达时 ,增殖期hRIF(S期和G2 -M期 )比率从 3 1.7%降低到 13 .9% (P <0 .0 5 ) ,分裂指数从 3 7.4%降低到 9.6% (P <0 .0 1) ,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低 60 .1%和 5 4.2 % (P <0 .0 1)。结论 :AT2R转染表达可显著抑制体外培养hRIF的增殖 ,这一作用对肾间质纤维化防治是有益的     

多甘醇单甲醚季铵盐结构式的核磁共振研究

多甘醇单甲醚季铵盐是一种同时含氧乙烯链及季铵盐的新型表面活性剂，它具有良好的相转移催化能力。本文着重从核磁共振光谱的角度（包括氢核磁共振谱和碳核磁共振谱）来研究多甘醇单甲醚季铵盐的结构。结果表明，新型季铵盐的化学结构式正确。     

CD3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用机制的研究

目的：探讨CD3AK细胞介导细胞因子抗肿瘤作用的机制。方法：将卵巢癌细胞株（A2780)分成两组,实验组采用CD3AK＋A2780,对照组采用LAK＋A2780,分别共育24h并于作用前和作用后每4h收集一次上清液以检测TNF－α和IFN－γ分泌水平。结果：实验组和对照组共育前,后上清液中均有TNF－α和IFN－γ分泌,但共育后TNF－α和IFN－γ分泌水平显著高于共育前（P＜0．01）,且同一效靶比的实验组TNF－α和IFN－γ分泌水平明显高于对照组（P＜0．05）。结论：CD3AK细胞可通过分泌细胞因子TNF－α和IFN－γ杀伤肿瘤细胞。