人OX40-Fc分子的构建、真核表达及活性研究

目的构建人OX40-Fc基因的真核表达质粒，并表达有生物学活性的纯化人OX40-Fc融合蛋白。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增OX40膜外区cDNA编码基因，并导入真核表达载体pcDNA3中。测序证实后，进行酶切并与人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，采用脂质体法稳定转染COS-7细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE与Western blotting进行鉴定。检测其对活化后Jurkat细胞增殖的抑制活性。结果测序证实构建的OX40膜外区与OX40-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA证实OX40-Fc蛋白的表达；SDS-PAGE与Western blotting证实其为OX40-Fc蛋白。增殖实验证明其对活化后的Jurkat细胞有抑制增殖作用。结论成功构建了人OX40-Fc真核表达载体，并使有生物学活性的OX40-Fc融合蛋白在COS-7细胞上获得了稳定表达。为进一步研究该蛋白在自身免疫性疾病治疗中的作用及调节免疫自稳机制中的地位奠定了基础。     

人补体受体2-Fc融合蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人补体受体2(CR2)-Fc融合蛋白基因表达载体,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人CR2-Fc蛋白。方法将人CR2片段和IgG1 Fc片段进行连接,克隆入PCI-neo表达载体。脂质体法将测序正确的重组真核表达载体转染CHO K1细胞进行蛋白表达,采用SDS-PAGE、Western blot法对蛋白表达进行检测和鉴定。结果利用双酶切及基因测序结果证实CR2-Fc基因序列正确,重组真核表达载体构建成功;SDS-PAGE检测纯化产物的相对分子质量(M r)与预期结果一致,Western blot法在同样位置检出条带。结论成功构建了CR2-Fc重组真核表达载体,获得了有活性的融合蛋白。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

人ICOSIg的真核表达及其对MLR反应的影响

目的构建人ICOSIg基因的真核表达载体,表达并鉴定ICOSIg蛋白,初步研究其对MLR中细胞增殖以及对IL-10分泌的影响。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增ICOS胞外区cDNA编码基因,并和人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNAB中,采用脂质体转染COS-7细胞,G418筛选,用ELISA检测其表达情况,经蛋白A亲和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。进一步通过^3H-TdR掺入法和夹心ELSIA法探讨其对双向MLR反应中细胞增殖以及对IL-10分泌的影响。结果酶切和测序证实构建的ICOS膜外区和人IgG1Fc段基因序列正确、阅读框完整;ELISA、SDS-PAGE、Western blot验证ICOSIg的正确表达;功能实验提示ICOSIg能抑制MLR中的细胞增殖和IL-10的分泌。结论成功构建并表达了ICOSIg,而获得的ICOSIg能抑制MLR。     

重组人平足蛋白基因在中国仓鼠卵巢细胞的稳定表达

目的构建平足蛋白(PDPN)真核表达质粒PDPN-pEGFP-N1,建立稳定高表达重组人PDPN的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株并对其进行生物学活性研究。方法通过反转录PCR和DNA重组技术从HEK293细胞中克隆PDPN cDNA,插入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的真核表达载体pEGFP-N1中。通过PCR、酶切及测序等方法鉴定重组载体;进而将该重组载体转染至CHO细胞中,通过荧光显微镜检测EGFP的表达,Western blot法检测PDPN在CHO细胞中的表达,流式细胞术分选高表达PDPN的CHO细胞,运用血小板聚集实验检测分选后细胞株的生物学活性。结果 DNA测序和酶切鉴定证明PDPN基因正确克隆至pEGFP-N1载体中,重组载体稳定转染CHO细胞后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光,流式细胞术分选后的细胞高表达PDPN;Western blot结果显示转染后CHO细胞膜表面表达PDPN蛋白;过表达PDPN的CHO细胞可以诱导人血小板聚集。结论成功构建了稳定高表达PDPN蛋白的CHO细胞株,该细胞株可表达PDPN,并诱导血小板聚集。     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达

目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSeetag2/seFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达.方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体psectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况.结果:将750 bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv.将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34 000.结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据.     

人重组LIGHT-Fc分子的真核表达及其抗肿瘤活性研究

目的：构建人LIGHT-Fc基因的真核表达质粒，并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT-Fc融合蛋白。方法：从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因，并导入克隆载体。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，用重叠延伸技术(SOE)引入cD137信号肽基因。将SOE产物与hlgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，瞬时转染293T细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE检测其纯度与Mr，并以肿瘤细胞为靶细胞，检测其生物学活性。结果：测序证实构建的LIGHT与LIGHT-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA和SDS-PACE证实LICHT-Fc融合蛋白的表达与纯度；MTT证明人LIGHT-Fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用。结论：获得了有抗肿瘤活性的纯化hLIGHT-Fc融合蛋白，为探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制，以及探索LIGHT的其他生物学功能奠定了坚实的实验基础。     

小鼠pEGFP-Hoxa11真核表达载体的构建及表达

目的 构建和鉴定Hoxa11和EGFP双基因共表达真核载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因Hoxa11克隆至含有报告基因EGFP的pEGFP-N1真核表达载体中,构建的真核表达载体pEGFP-Hoxa11经PCR,双酶切及基因测序鉴定;转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察重组质粒的表达,提取细胞蛋白Western...     

人CD226分子胞膜外区D1和D2真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的 构建含有人CD226分子胞膜外区结构域1(D1)和结构域2(D2)的真核表达载体,表达并纯化重组蛋白.方法用特异性引物分别扩增CD226 D1和D2的基因,定向插入真核表达载体pSecTag2B-Fc,进行酶切和DNA测序鉴定,重组质粒瞬时转染293T细胞,收集上清,纯化蛋白及SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物.结果利用PCR方法克隆出CD226胞膜外区D1和D2的基因,并正确插入pSecTag2B-Fc载体中,真核表达载体瞬时转染293T细胞,Western blot结果证实转染293T细胞的培养上清液中含有hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc融合蛋白,培养上清经亲和层析柱纯化,可获得较高纯度的重组蛋白.结论 成功的构建了分泌型融合蛋白hCD226D1-Fc和hCD226D2-Fc真核表达载体,获得纯度较高的融合蛋白,为进一步探讨其配受体的相互作用机制奠定了基础.     

肠道病毒71型多表位-mGITRL真核表达质粒的构建、表达及其免疫原性研究

目的:构建肠道病毒71型(EV71)多表位-mGITRL真核表达质粒并对其免疫原性进行研究。方法:串联已证实的VP1表位并合成(VP1’);PCR扩增获得mGITRL,克隆至真核共表达载体pIRES中。对重组质粒进行测序鉴定后,以脂质体介导法转染至COS7细胞,通过Western blot方法检测其在COS7细胞中的表达。将构建好的重组质粒免疫小鼠,应用ELISA法检测小鼠血清中抗VP1的抗体滴度。结果:PCR扩增出目的基因,测序证实真核共表达载体pIRES-VP1’-mGITRL构建成功,Western blot结果显示目的基因在COS7细胞和肌细胞中过表达。小鼠血清中检测出高滴度的抗VP1抗体。结论:成功扩增出目的基因并构建VP1表位的重组真核共表达载体pIRES-VP1’-mGITRL,在COS7细胞和肌细胞中过表达,并获得高滴度的抗VP1抗体。     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

人PSCA基因真核载体的构建与表达

目的 克隆人PSCA(prosaae stem cell antigen)分子的cDNA,构建PSCA基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定.方法 从PSCA阳性细胞系LNCaP中提取总RNA,逆转录为cDNA.根据编码人PSCA的基因序列设计引物,以cDNA为模板,采用PCR技术扩增PSCA基因,将该基因插入到pcDNA3.1(+)真核载体,构建pcDNA3.1(+)-PSCA表达质粒.经限制性酶切鉴定和DNA序列测定结果证实后,将重组质粒pcDNA3.1(+)-PSCA转染Hela细胞,检测其体外瞬时表达.结果 测序证实得到人PSCA基因序列,序列分析显示没有发生无义突变.RT-PCR和免疫细胞化学分析结果分别表明转染细胞有目的 基因和分子的表达.结论成功克隆人PSCA基因,并在真核细胞中获得表达,为进一步构建基于PSCA的肿瘤疫苗奠定了基础.     

人源抗-HAV Fab真核表达载体的构建及表达

目的 构建人源抗－ＨＡＶＦａｂ真核表达载体并进行表达。方法 采用ＤＮＡ重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体ｐＣｄｈｆｒｌ、ｐＣＤＮＡ３．１;以脂质体介导法转染ＣＨＯ细胞,经Ｇ４１８筛选细胞,ＥＬＩＳａｂ基因的表达。结果 成功地构建了Ｆａｂ表达载体。转染细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Ｆａｂ片段。结论Ｆａｂ真核表达载体的构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达     

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

人重组pEGFPC1-uPA ATF质粒的构建及表达的研究

目的构建含人uPA ATF基因的真核表达质粒，并研究其对小鼠细胞株Pam212细胞的影响。方法设计引物，利用PCR从原核表达质粒中扩增人uPAA1F基因片断，并导入真核表达载体的绿色荧光蛋白pEGFPCI中，利用电泳和测序检测构建状况，荧光显微镜观察和免疫细胞化学检测转染情况，通过MTT、体外迁移实验检测对小鼠Pam212细胞株的影响。结果电泳和测序表明构建的质粒准确，uPA ATF cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；质粒转染Pam 212细胞株成功，并且能抑制细胞的增殖和迁移。结论成功构建了真核表达载体pEGFPC1-uPA ATF质粒，明确了人uPA ATF基因片断能降低小鼠细胞的增殖和迁移，为进一步在体实验研究打下了基础。     

SOD1真核表达载体的构建及表达

目的:构建人铜锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因真核表达载体,并在HeLa细胞中进行表达。方法:应用RT-PCR从人外周血中扩增SOD1基因开放阅读框(ORF),采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-SOD1。随后,将SOD1进一步克隆到真核表达载体pTracer-CMV/Bsd中。用脂质体将经过测序、验证的重组pTracer-CMV/Bsd-SOD1质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,转染HeLa细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选4周,用RT-PCR、Western blot检测SOD1的表达。结果:成功构建了pTracer-CMV/Bsd-SOD1真核表达质粒,转染HeLa细胞,发现转染成功的细胞均发绿色荧光;RT-PCR及Western blot检测结果表明,所转染的SOD1在HeLa细胞中成功表达。结论:成功构建了能够同时表达绿色荧光蛋白和SOD1的真核表达质粒pTracer-CMV/Bsd-SOD1,为进一步研究SOD1在基因治疗中的作用奠定了基础。