重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y1受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y1受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a- Y1重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y1融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y1受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y1在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y1受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

重组人神经肽Y受体Y2融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y2受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y2转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western 印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni~(2+)-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y2受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-Y2重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y2融合蛋白.重组蛋白经Ni~(2+)-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y2受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y2在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y2受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

重组人神经肽Y融合蛋白的表达、纯化及生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-NPY转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析NPY蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a-NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了NPY的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-NPY在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对NPY蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.     

重组人神经肽Y融合蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备与鉴定

目的：构建人神经肽Y（NPY）基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备兔抗人NPY抗血清。方法：取已构建好且经测序确认无误的再组质粒pET28a—NPY转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS—PAGE检测和Western印迹鉴定,表达产物包涵体经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化,以纯化后的融合蛋白pET28a—NPY为抗原免疫家兔,获得抗血清,Western blotting、ELISA法鉴定获得的抗血清。结果经IPTG诱导含有pET28a—NPY重组质粒的DE3菌,表达出重组人NPY融合蛋白。重组蛋白经Ni^2＋-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白,用纯化的融合蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体,Western blotting、ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论：成功表达了人NPY蛋白并获得了其多克隆抗体,为进一步研究人NPY蛋白的功能奠定了基础。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

结核杆菌H37Rv株重组KatG蛋白的表达纯化研究

目的表达纯化结核杆菌H37Rv株重组KatG（简称rKatG）蛋白，为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法重组质粒pET23b—KatG转化大肠埃希菌表达菌株BL21（DE3）plysE,IPTG诱导rkatG蛋白表达。经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后，优化表达条件，用镍离子鳌合亲和层析柱纯化rKatG蛋白，对纯化产物进行过氧化氢酶活性测定。结果成功构建了重组质粒pET、23b-KatG,rKatG蛋白以可溶性蛋白形式表达，经亲和层析后的rKatG蛋白纯度为95．6％，过氧化氢酶试验阳性。结论构建的pET23b-KatG重组质粒能高效表达有酶活性的可溶性rKatG蛋白，经亲和层析后可得到高纯度的纯化蛋白。     

肝螺杆菌甲基基团接受趋化信号转导蛋白的克隆表达及纯化

目的克隆肝螺杆菌（H.hepaticus）甲基基团接受趋化信号转导蛋白（MCP）基因,制备MCP重组蛋白,为以后检测我国人群肝螺杆菌感染率提供实验基础。方法利用PCR方法扩增目的基因片段,连接至原核表达载体pET22b（＋）,构建MCP的原核表达质粒pET22b＋/MCP。将质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析系统纯化重组蛋白。结果构建了原核表达质粒pET22b＋/MCP,含有该质粒的大肠杆菌经1 mmol/L IPTG诱导4 h后表达一相对分子质量约14 kD的重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析系统纯化获得了MCP的纯化重组蛋白rhMCP。结论获得了肝螺杆菌MCP的纯化重组蛋白,为进一步利用血清学方法调查我国人群肝螺杆菌感染率提供可能。     

鼠抗人肥大细胞羧肽酶截短体抗体的制备与鉴定

目的 建立检测人肥大细胞羧肽酶(hMCCP)的双抗体夹心ELISA法,以hMCCP截短体免疫小鼠,制备鼠源性多克隆抗体.方法 PCR法扩增hMCCP-N118基因片段,克隆至pET28原核表达载体,转化大肠杆菌Rosseta(DE3).用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用Ni2 -NTA凝胶亲和层析纯化目的 蛋白.用纯化重组蛋白免疫小鼠,制备抗hMCCP-N118抗体.间接ELISA测定抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性.结果 hMCCP截短体在大肠杆菌中高效表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了鼠抗hMCCP-N118抗体,效价达1∶6 400,该抗体能特异结合hMCCP.结论 成功地制备了效价高、特异性好的鼠抗hMCCP截短体抗体.     

梅毒螺旋体蛋氨酸亚砜还原酶的原核表达、纯化及其抗氧化功能研究

目的原核表达、纯化梅毒螺旋体(Treponema pallidum)蛋氨酸亚砜还原酶(Methionine sulfoxide reductase,Msr)并测定其抗氧化功能。方法将TpMsr基因连接到表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-TpMsr,热激法将其转化大肠埃希菌BL21(DE3)得到重组菌BL/pET28a-TpMsr,IPTG诱导重组TpMsr蛋白表达。利用镍柱亲和层析纯化目的蛋白,采用比色法测定Tp Msr蛋白的酶活性。采用菌落计数法测定重组大肠埃希菌在H2O2胁迫下的存活率。结果成功构建重组质粒pET28a-TpMsr,转化大肠埃希菌BL21(DE3)后高效表达分子质量单位(Mr)约34.8×103的TpMsr,经Ni 2+柱亲和层析纯化得到高纯度的重组TpMsr蛋白。该蛋白能将蛋氨酸亚枫还原为蛋氨酸,且能赋予大肠埃希菌抵抗氧化应激的能力。结论构建的重组质粒pET28a-TpMsr能表达TpMsr蛋白。该蛋白具有抗氧化功能,为研究梅毒螺旋体的抗氧化机制提供了实验依据。