慢性髓系白血病不同bcr/abl融合基因转录子与临床关系的研究

目的研究慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因转录子类型与临床的关系.方法采用RT-PCR技术检测537例临床怀疑CML的患者新鲜骨髓标本三种bcr/abl(M、m及μ型)融合基因的表达.结果 479例CML患者 M-bcr/abl阳性,其中慢性期(CP)370例,加速/急变期(AP/BC)109例,CP期和AP/BC期患者表达b2a2型融合基因转录子的百分率分别为32.4%(370例中120例)及36.7%(109例中40例)(P>0.05),急淋变及急髓变患者b2a2型百分率分别为52.6%(19例中10例)及33.3%(90例中30例) (P>0.05);b3a2型患者初诊时外周血血小板数明显高于b2a2型患者[(485.9±333.8)×109/L] vs [(380.5±321.9)ⅹ109/L](P<0.05);66.0%CP及64.4%AP/BC患者同时表达M-bcr/abl及m-bcr/abl;1例单纯m-bcr/abl(+)患者表现为急性髓系白血病(AML);2例μ-bcr/abl(+)患者均具有典型CML表现.结论典型CML患者几乎均为M-bcr/abl融合基因阳性,大部分患者同时伴有m-bcr/abl表达,个别CML患者可以为μ型;除了急性淋巴细胞白血病(ALL)外,单纯m-bcr/abl(+)也可见于AML或CML急粒变的患者; b3a2型患者初诊时更易有血小板数增高表现.     

bcr/abl融合基因和慢性粒细胞白血病

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.     

RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域（PTD）与慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因片段的质粒，并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CML bcr/abl基因片段，经DNA测序后，与合成编码PTD的DNA片段一起手稿质粒pET-16b，构建表达载体pEPb，转化大肠杆菌并进行了PTD－bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的523bp的目的片段被有效地扩增，DNA序列分析表明所构建的含PTD－bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD－bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD－bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物，为进一步研究CML的免疫治疗奠定了基础。     

联合应用FISH和巢式RT-PCR技术检测慢性髓系白血病bcr/abl融合基因

目的 检测慢性髓系白血病(CML)bcr／abl融合基因，协助临床诊断。方法 联合应用荧光原位杂交(FISH)、Northem杂交和巢式RT—PCR技术。结果 在16例被检测的CML患中，有3例两种方法的结果不一致，经Northem杂交验证发现，RT—PCR较FISH更敏感，但存在假阳性；另外，FISH较容易检测到bcr／abl融合的少见类型，而巢式RT—PCR需要同时设计多对特殊引物，否则极易漏诊。结论 联合应用FISH和巢式RT—PCR技术检测CML bcr／abl融合基因可以优势互补，使结果更加准确、可靠，更适合于临床诊断、疗效判定以及对微量残留病的监测。     

RT—PCR一步法检测慢性粒细胞白血病bcr／abl融合基因

应用ＲＴ－ＰＣＲ一步法检测了４２例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，均显示ｂｃｒ／ａｂｌ基因阳性，其中２１例为１６８ｂｐ扩增带，１８例为９３ｂｐ扩增带，３例同时具有１６８ｂｐ和９３ｂｐ二条扩增带。ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因检测，对ＣＭＬ的诊断、治疗及预后判断均有重要意义。ＲＴ－ＰＣＲ一步法特异性好，敏感性高，简单快速，可节省试剂，值得推广应用。     

三例变异型Ph染色体的bcr/abl融合基因荧光原位杂交

大约 8 %的慢性粒细胞白血病 (ＣＭＬ)患者有变异型Ｐｈ染色体 (变异Ｐｈ易位 ) ,形态上可将其分为简单型和复杂型。国外有作者用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和染色体原位杂交技术研究发现 ,变异Ｐｈ易位的ＣＭＬ患者具有ｂｃｒ/ａｂｌ融合基因[1,2 ] 。我们应用双色荧光原位杂交技术 (ｄｕａｌ ｃｏｌｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ,Ｄ ＦＩＳＨ) ,检测 3例变异Ｐｈ易位ＣＭＬ患者的ｂｃｒ/ａｂｌ融合基因。对象和方法1　病例　变异型Ｐｈ染色体的ＣＭＬ患者 3例 ,男 1例 ,女 2例 ,发病年龄为 2 5～ 3…     

bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断及残留病灶监测中的应用

目的探讨bcr/abl融合基因检测在诊断慢性粒细胞性白血病(CML)和监测CML残留病灶中的意义。方法采用巢式逆转录PCR(RT-PCR)检测337例CML患者bcr/abl融合基因的表达,并对所有患者进行残留病灶的动态监测,共检测632人次。其中移植(包括外周血干细胞移植、骨髓移植和脐血移植)患者26例;服用格列卫的患者22例;其它治疗方案患者289例。结果在337例CML初诊患者中bcr/abl基因表达阳性者325例,阳性率为96.4%;其中b3a2型转录本占58.5%(190/325),b2a2型转录本占41.2%(134/325),b3a3型转录本占0.3%(1/325)。未发现b2a3型转录本。移植患者bcr/abl融合基因转阴率为88.5%(23/26),时间在30~201 d之间,中位数为55 d;服用格列卫患者融合基因总转阴率59.1%(13/22),转阴时间在用药后90~365d之间,中位数为210 d;其它治疗组患者转阴12例,转阴率为4.1%(12/289)。结论bcr/abl融合基因的检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效及预后判断具有重要意义。     

慢性髓性白血病bcr／abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

伴有bcr/abl融合基因表达的儿童急性淋巴细胞白血病特点分析

在儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中bcr／abl融合基因的检出率约占2％～6%、我们在2001年至2003年应用RT—PCR法从263例ALL患儿中共检测出15例bcr／abl^ ALL病例，并对MIC分型和远期疗效等方面进行分析，探讨bcr／abl^ ALL患儿的临床、免疫学、生物学及预后等特点。     

格列卫治疗后bcr/abl融合基因变异的研究

目的:应用荧光原位杂交法检测格列卫治疗后白血病bcr/abl融合基因的改变。方法:应用双色双融合法荧光原位杂交技术检测42例接受格列卫治疗的急慢性白血病患者骨髓细胞bcr/abl融合基因,对比治疗前后bcr/abl融合基因的改变。结果:所有患者治疗后均出现融合基因变异,与患者肿瘤负荷、分型和分期无关。结论:格列卫治疗可诱导bcr/abl基因发生融合变异。     

格列卫对慢性粒细胞白血病病人Ph染色体和bcr／abl融合基因表达影响

目的探讨格列卫治疗Ph染色体阳性慢性粒细胞白血病病人后骨髓Ph染色体及bcr／abl融合基因表达的变化。方法采用R显带和半定量RTPCR分别检测11例慢性粒细胞白血病病人服用格列卫前后骨髓标本中Ph染色体和bcr／abl基因的表达。结果用药后9例慢性期慢性粒细胞白血病病人,7例分别在用药3～24个月后染色体检查为Ph染色体阴性,1例用药1个月后其Ph染色体仍为阳性,后失访;1例用药2个月后Ph染色体阳性率为30％;1例急变期慢性粒细胞白血病病人用药6个月后其Ph染色体阳性率为70％;1例加速期慢性粒细胞白血病病人用药12个月后Ph染色体阳性率为60％。服用格列卫的CML病人Ph染色体转阴后仍能检测到bcr／abl基因的表达,但其表达水平较用药前明显降低,差异有显著性（t=3．77、5．13,P〈0．01）,随着用药时间的延长bcr／abl基因表达逐渐降低。结论格列卫能有效治疗Ph染色体阳性的慢性粒细胞白血病病人,并且对其预后具有重要的意义。     

bcr/abl融合基因在白血病中的表达及临床意义

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.bcr/abl融合基因阳性也可能存在于其他类型的疾病中,有关这方面的问题是目前血液学研究的热点之一.     

慢性髓性白血病异基因造血干细胞移植后M-bcr/abl及m-bcr/abl融合转录子追踪观察

为研究慢性髓性白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (SCT)后M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子表达特征 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术测定 72例CML患者SCT后不同时间骨髓M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子的表达。结果显示 ,CML患者移植后 <6个月M bcr/abl阳性率 (79.2 % ,4 2 /5 3)显著高于 6 - 12个月(34.3% ,11/32 )及≥ 12个月 (35 .1% ,13/37) (P <0 .0 0 1) ,各时间段M bcr/abl阳性患者的临床复发率分别为1 9% (1/5 3) ,0 (0 /32 )及 16 .2 % (6 /37) ;6例临床复发患者中有 5例复发时M bcr/abl与m bcr/abl同时阳性。 14例遗传学缓解患者移植 6个月后M bcr/abl阳性的 17份标本无 1例m bcr/abl阳性。结论 :多数CML患者移植后M bcr/abl仍为阳性 ,一般在 6个月内转阴 ,移植后M bcr/abl阳性的患者不一定复发 ,同时追踪观察M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子可能会有助于监测残存白血病。     

慢性髓细胞白血病患者染色体分析及bcr/abl融合基因转录本定量的临床意义

目的探讨慢性髓细胞白血病(CML)患者染色体分析与bcr／abl融合基因定量的临床应用价值。方法17例CML患者采用骨髓细胞短期培养法制备染色体,应用G、R显带技术进行染色体分析,同时采用实时定量RT-PCR技术进行bcr／abl融合基因定量检测,并对其中的9例患者进行了跟踪观察。结果全部患者均检出Ph染色体及表达bcr／abl融合基因,阳性患者之间19cr／abl表达水平差异很大。常规药物治疗后稳定于慢性期的4例患者,bcr／bal表达水平轻度上升或下降,未发现新的染色体异常;进入急变期的3例患者bcr／abl表达平均上升了9．06倍,均出现新的附加染色体异常;2例异基因骨髓移植的患者bcr／abl表达水平随临床治疗而发生变化;bcr／abl变化趋势相同而细胞遗传学结果不同的患者,对药物治疗的反应不同,预后也不一样。结论染色体分析结合bcr／abl基因定量较为全面地反映了CML患者的生物学特性,与疾病进展密切相关,对CML的诊断、疗效评价、预后判断反映白血病细胞负荷有较大的临床价值。     

Ph染色体bcr/abl融合基因在诊断慢性粒细胞白血病中的意义

目的 慢性髓系白血痛(CML)的细胞遗传学特征是具有Ph染色体,即t(9;22)(q34;q11),其结果在分子水平上形成bcr/abl融合基因探讨慢性髓性白血病Ph染色体及bcr/abl融舍基因检测对CML早期诊断、分型诊断及指导治疗的临床意义.方法 用直接法或24h短期培养法常规G显带后分析,观察有无Ph染色体,PCR方法检测bcr/abl融合基因,结合形态学特征对51例CML进行分型诊断.结果 51例患者中Ph+/bcr/abl+或Ph-/bcr/abl+共48例诊断为典型慢性粒细胞白血病(CGL)占94%,其中1例为妊娠合并慢拉白血病;Ph-/bcr/abl-3例占6%,其中2例为非典型慢性粒细胞白血病(a-CML),1例为慢性粒单棱细胞白血病(CMML).结论 Ph染色体及ber/abl融合基因检测将CML患者进一步区分为三型:典型(Ph+/ bcr/abl+或Ph-/bcr/abl+)慢性粒细胞白血病(CGL)、非典型(Ph-/bcr/abl-)慢性粒细胞白血痛(a-CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML).对慢性髓系白血病的明确诊断、早期有效治疗具有重要的临床意义.     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。     

急性淋巴细胞白血病bcr/abl融合基因表达及其与免疫表型的关系

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了M-bcr/abl和m-bcr/abl两种类型融合基因在48例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的表达,并且绝大多数病例同时进行了免疫表型和DNA倍体的流式细胞术分析。结果表明,25%(12/48)的病例M-bcr/abl或m-bcr/abl融合基因阳性,m-bcr/abl阳性率略高。分析bcr/abl阳性病例的免疫表型,发现大多数病例为B系标志阳性,但部分T系标志阳性的病例也检测出M-bcr/abl或m-bcr/abl,说明bcr/abl阳性ALL病例以B系标志阳性者居多,T系标志阳性的ALL病例也可为bcr/abl阳性。     

检测bcr/abl融合基因在急性淋巴细胞白血病治疗中的意义

目的了解急性淋巴细胞白血病患者治疗中bcr／abl融合基因的情况,探讨检测bcr-abl融合基因的临床意义。方法应用反转录一巢式聚合酶链反应（nest—PCR）检测52例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者骨髓标本ber—abl融合基因。结果52例ALL患者bcr／abl融合基因阳性18例,其中ber—abl融合基因阳性者7例缓解,CR率为38．9％;阴性者27例缓解,CR率为79．4％。对34例缓解患者进行短期随访,共有13例复发。7倒诊断时ber／abl（＋）的缓解期患者,证实仍有6例存在bcr／abl残余克隆。此6例CR期有MRD存在的患者在随访时间内全部复发。而27例缓解期不存在MRD的患者有7例复发。MRD阴性者复发率为25．9％,MRD阳性者复发率为100％,复发率差异有统计学意义（P〈0．05）。结论急性淋巴细胞白血病患者治疗过程中检测bcr—abl融合基因有助于ALL病情观察;对于缓解期患者MRD的检测,增加了预后评估价值。