糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞eNOS活性和表达的影响

目的　研究糖基化终产物 (AGEs)对内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)的活性及蛋白表达的影响。方法　用糖孵育法制备糖基化修饰的牛血清白蛋白 (AGE BSA) ,用胶原酶法分离培养人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)。将内皮细胞与不同浓度的AGE BSA在体外分别培养 3 ,6,12 ,2 4,48h ,用同位素二步色谱法检测基础状态下与组胺刺激后的eNOS活性 ,用蛋白免疫印迹法 (Western blotting)检测eNOS蛋白表达水平。结果　基础状态下 ,HUVECs的eNOS有部分激活 ,组胺刺激后eNOS活性明显增加 (P <0 .0 0 1)。AGE BSA明显抑制基础状态下的eNOS活性和组胺刺激后的eNOS活性增高(P <0 .0 0 1) ,这种抑制作用呈时间、浓度依赖性。AGE BSA与HUVECs共同孵育 2 4h后的eNOS表达水平明显降低 (P <0 .0 0 1) ,且随着孵育时间的延长 ,eNOS表达水平进一步降低 (P <0 .0 5 ,48hvs 2 4h) ,这种抑制作用与AGE BSA的浓度有关。结论　AGE BSA明显抑制eNOS基础状态和组胺刺激后的活性增高 ,AGE BSA明显抑制HUVECs的eNOS表达 ,AGE BSA对eNOS活性的抑制作用可能与降低eNOS表达有关。     

ox-LDL对PLGF作用内皮细胞释放NO和内皮细胞黏附分子的影响

目的：探讨氧化型低密度脂蛋白对胎盘生长因子-1作用人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮和内皮细胞黏附分子的影响。方法：在ox-LDL（25μg／mL）条件下,应用不同浓度的PLGF-1（20、40、80ng／mL）孵育ECV-304,对照组为内皮细胞未受损时,相同浓度梯度的PLGF-1孵育ECV-304,3h、6h、12h、24h后应用ELISA法检测内皮细胞黏附分子-可溶性细胞间黏附因子-1、可溶性血管内皮细胞黏附因子-1的表达,硝酸盐还原酶法检测NO的表达。结果：正常生理条件下,PLGF诱导NO和内皮细胞黏附分子的表达,且呈时间（当t=6h达到最理想的分泌量）、浓度依赖关系。在氧化损伤条件下,PLGF诱导NO的表达下降,而内皮细胞黏附分子的表达则增高,以VCAM-1表达增多更为明显。结论：氧化损伤是动脉粥样硬化的独立危险因素,而PLGF诱导内皮的活化,上调内皮黏附分子的表达,可进一步促使疾病的恶化。故认为抑制PLGF的生物活性可达到控制炎症反应的作用。     

不同浓度Hcy对培养的人脐静脉内皮细胞NO及eNOS转录水平的影响

目的 :通过培养的人脐静脉内皮细胞 (humanum blilicalveinendothelialcell,HUVEC) ,研究不同浓度的同型半胱氨酸 (homocysteine ,Hcy)对内皮细胞分泌一氧化氮 (NO)以及对内皮源性一氧化氮合酶 (eNOS)转录水平的影响 .方法 :收集HUVEC ,然后进行细胞培养 ,传至第 3代后 ,将其与不同浓度的Hcy(生理浓度 0 .0 1mmol·L -1、病理生理浓度 0 .5mmol·L -1、非毒性药理浓度 2 .0mmol·L -1、毒性药理浓度5 .0mmol·L-1)共同培养 2 4h ,分别在 4 ,6 ,8和 2 4h检测培养液中NO的含量 .2 4h后 ,收集HUVEC ,提取总的RNA ,利用eNOS特异性引物进行逆转录 ,从而探讨Hcy对eNOSmR NA水平的影响 .结果 :HUVEC与不同浓度的Hcy培养 2 4h后 ,其NO呈现剂量依赖性的下降 (2 4h时 ,各浓度Hcy的培养液中的NO的含量分别为 19.71± 3.88μmmol·L -1,14 .0 8± 4 .4 6 μmmol·L -1,8.71± 6 .6 3μmmol·L -1,7.0 1±3.6 3μmmol·L -1,2 .37± 0 .77μmmol·L -1,P <0 .0 1) ,但2 4h后 ,eNOS的RT PCR结果显示各组间的产物电泳带无明显的差异 .结论 :Hcy可以导致内皮细胞释放NO减少 ,但对eNOS的转录却没有明显的影响     

TNF-α对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的 讨论肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对内皮细胞一氧化氮（NO）产生及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性的影响。方法 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验材料，检测与不同浓度TNF—α作用不同时间后．细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化，以及细胞eNOS活性的改变。结果 （1）随着TNF—α浓度的升高，eNOS的活性减弱，而细胞和上清液中NO的含量增加；（2）随着干预时间的延长，eNOS的活性减弱；而细胞和上清液中NO的含量在作用24h后升高，且明显高于对照组；（3）L一单甲基精氨酸（L—NMMA）和地塞米松（DXM）均能阻断TNF-α引起的细胞和细胞上清中NO的表达增加。结论 TNF-α降低eNOS活性，却在高浓度和长时间作用后增加NO的合成，可能与激活诱导型一氧化氮合酶有关，因为NO的变化可以被L—NMMA和DXM阻断。     

镁对人脐静脉内皮细胞一氧化氮和一氧化氮合酶亚型的影响

目的：观察镁对人脐静脉内皮细胞一氧化氮（NO）和一氧化氮梧酶（NOS）不同亚型的影响。方法：镀铜镉还原法测定培养液中NO2^-/NO3^-含量，免疫组织化学法观察内皮细胞型NOS（eNOS)和诱导型NOS（iNOS)的表达。结果：与正常对照组相比，Mg^2 各剂量组NO2^-/NO2^-含量较高，差异具有显著性（P＜0．05）；H2O2＋Mg^2 各剂量组NO2^-/NO3^-含量高于H2O2组，差异具有显著性（P＜0．05）。与正常对照组相比，H2O2组iNOS和NF－κB P65平均灰度下降，eNOS平均灰度升高，且均具有显著性差异（P＜0．05），Mg^2 各剂量组eNOS平均灰度下降，具有显著性差异（P＜0．05）；与H2O2组相比，H2O2＋Mg^2 各剂量组iNOS和NF－κB P65平均灰度显著升高（P＜0．01），eNOS平均灰度下降（P＜0．05）；H2O2＋Mg^2 各剂量组eNOS和iNOS平均灰度低于相应的Mg^2 剂量组，且具有显著性差异（P＜0．05）。结论：镁的抗氧化作用机制可能涉及调控细胞转录因子和一氧化氮合酶不同亚型。     

苦参碱对脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

目的观察不同浓度苦参碱对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成及一氧化氮合酶活性的影响。方法采用体外培养第3代人脐静脉内皮细胞。实验分为6组,即对照组、不同浓度苦参碱组(50、100、200、500和1000μg/L)。各组细胞于培养24h后收集标本,用Griess法检测培养上清中一氧化氮水平,并测定人脐静脉内皮细胞的一氧化氮合酶活性及用内参半定量法分析iNOS mRNA的变化。结果不同浓度苦参碱组一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性、RNA的表达水平较对照组明显升高(P<0.05)。结论苦参碱可增加人脐静脉内皮细胞的一氧化氮合酶活性和一氧化氮产生及RNA的表达水平。     

不同水平糖浓度对人脐静脉内皮细胞SOD、NOS及NO的影响

目的:观察体外培养条件下,不同水平的糖浓度对血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,分对照组、高糖组和糖浓度递增组,使用分光光度比色法检测NOS、NO和SOD的吸光度,计算出活力或含量.结果:与对照组比较,高糖组NOS活力和NO含量增加,SOD活力下降;递增组NOS活力、NO含量增加及SOD活力下降幅度均较高糖组更加明显.结论:递增性高糖较持续的高糖对内皮细胞SOD的抑制作用和NOS、NO的诱导作用明显增强.     

罗格列酮对人脐静脉内皮细胞NO和P13K／PKB／eNOS信号通路的影响

目的：观察罗格列酮对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）一氧化氮（nitric oxide，NO）浓度和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，P13K）和蛋白激酶B（protein kinaseB，PKB）表达的影响，探讨罗格列酮改善内皮功能的信号转导机制。方法：首先观察罗格列酮对内皮细胞NO影响的时效和量效关系，然后加用eNOS和PKB信号阻断剂进行干预。用Griess重氮化反应法检测NO浓度，RT-PCR方法检测P13K，PKB及eNOSmRNA的表达，Western免疫印迹方法检测PKB，eNOS总蛋白和PKB丝氨酸473（PKB-Ser473），eNOS丝氨酸1177（eNOS-Ser1177）的磷酸化表达。结果：罗格列酮呈剂量和时间依赖性地升高内皮细胞NO浓度，不同浓度的罗格列酮培养内皮细胞均能升高P13K mRNA表达和PKB-Ser473，eNOS-Ser1177磷酸化，但对PKB和eNOS表达均无影响；eNOS阻断剂L-NAME能完全阻断罗格列酮培养的内皮细胞NO浓度的升高，P13K阻断剂LY294002能阻断罗格列酮诱导的NO产生和PKB，eNOS的磷酸化。结论：罗格列酮能通过激活P13K／PKB／eNOS信号通路而增强内皮细胞NO的浓度，改善内皮功能。     

高游离脂肪酸致内皮细胞eNOS活性降低与PKC通路的关系

目的 研究游离脂肪酸(FFA)水平升高导致的内皮一氧化氮合酶(eNOS)活性降低是否与蛋白激酶C(PKC)通路激活有关.方法 传代培养的人脐静脉内皮细胞分为4组:对照组,油酸组(10、50、100、150、200 μmol/L),PKC抑制剂(GFX)组,油酸+GFX组.分别检测各组eNOS活性,检测对照组和油酸组PKC的表达和活性,以及各组eNOS磷酸化(p-eNOS)的表达.结果 与对照组相比,油酸组eNOS活性呈剂量依赖性降低,p-eNOS(1177)的表达降低(0.0854±0.017 vs. 0.0134±0.023, P<0.05);PKC的表达出现转位,由胞浆转向胞膜,胞浆表达活性降低,胞膜表达活性增高,总活性增加.加入GFX后对正常内皮细胞eNOS活性无明显影响,但能部分改善油酸所致的内皮细胞eNOS活性的降低.结论 油酸可损害内皮细胞eNOS的表达及磷酸化,其机理与PKC通路的激活有关.     

性激素对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮的影响

目的 :探讨性激素单独应用或联合应用对人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮 (NitricOxide ,NO)的影响。方法 :取健康产妇分娩后 6h内的脐带内皮细胞进行培养 ,以Griess测定培养液中NO2 含量间接反映NO生成量 ,分别测定加入 0 .0 0 1μmol/L ,0 .1μmol/L和 10 μmol/L的 17β E2 ,P、T刺激细胞 10min、30min、6 0min时NO2 含量 ,以 1ml无钙镁盐液作对照。结果 :与对照组相比 ,17β 雌二醇浓度为 0 .0 0 1μmol/L、0 .1μmol/L、10 μmol /L单独作用于内皮细胞 10min和 30min时 ,培养液中NO含量明显增加 (P <0 .0 5 ) ,但刺激 6 0min时无明显作用 (P >0 .0 5 ) ;与孕激素 (0 .0 0 1μmol/L、0 .10 μmol/L、10 μmol /L)分别联合应用 ,作用于内皮细胞 10min、30min和 6 0min ,都能显著抑制雌激素刺激内皮细胞释放NO(P <0 .0 5 )。不同浓度和作用时间下 ,孕激素和雄激素对内皮细胞释放NO的作用不同。结论 :雌激素能够通过NO途径产生血管舒张作用 ,孕激素可能通过抑制NO的释放而抑制雌激素舒张血管的作用。     

茶色素对人血管内皮细胞一氧化氮合酶表达的影响

目的：研究茶色素对人血管内皮细胞一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因表达的影响。方法：应用ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＲＴ－ＰＣＲ等分子生物学方法分别从ｅＮＯＳ蛋白水平和ＲＮＡ水平研究茶色素对ｅＮＯＳ表达的影响。结果：８０、４０、ｍｇ／Ｌ的茶色素明显诱导人血管内皮细胞ｅＮＯＳ表达，并有剂量反应关系。结论：茶色素诱导人血管内皮细胞ｅＮＯＳ表达是其抗动脉粥样硬化的机制之一。     

OX-LDL对冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响

①目的　观察氧化修饰型低密度脂蛋白(OX LDL)对培养的猪冠状动脉平滑肌细胞增殖的影响。②方法　将稳定生长的2~3代猪冠状动脉平滑肌细胞分别加入25、50、100 mg/L OX LDL和体积分数为 0.03 的无脂血清培养液培养24 h后,相差显微镜下观察细胞形态学变化,四唑盐(MTT)比色法测定细胞增殖能力,流式细胞术测定细胞周期各期细胞数。③结果　培养猪冠状动脉平滑肌细胞在OX LDL的作用下胞体变大,由梭形变为不规则多变形,无典型的“谷”与“峰”生长。3 种不同浓度 OX LDL组细胞增殖能力均较对照组增高,差异有显著性(F=39.928,q=4.301~9.578,P<0.01);3种不同浓度OX LDL组间差异亦有显著性(q=3.389~10.418,P<0.01)。3种不同浓度 OX LDL组 S 期细胞百分比均显著高于对照组(χ2 = 10.22 ~ 17.96, P< 0. 01)。④结论OX LDL能直接促进体外培养的猪冠状动脉平滑肌细胞的增殖。     

齐墩果酸对oxLDL诱导人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用

目的探讨齐墩果酸对氧化性低密度脂蛋白（oxLDL）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）损伤的保护作用。方法体外培养HUVEC,以维生素E（200μmol/L）或齐墩果酸（5-40μmol/L）预处理细胞24h,再加入200mg/L oxLDL继续培养24h造成细胞损伤。采用MTT法检测各组细胞存活率,同时检测细胞丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、还原型谷胱甘肽（GSH）含量,采用DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧（ROS）含量。结果与正常组比较,200mg/L oxLDL组细胞存活率、SOD活性、GSH含量明显降低,MDA、ROS含量明显增加,差异均有统计学意义（F=67.72-173.25,q=11.46-30.86,P〈0.01）;与200mg/L oxLDL组比较,齐墩果酸在5-20μmol/L浓度范围内,可剂量依赖性提高细胞存活率、减少MDA含量及ROS形成、增加GSH含量及SOD活性（q=4.26-22.35,P〈0.05）。结论齐墩果酸能抑制ox-LDL诱导的HUVEC氧化损伤,其机制可能与维持SOD活性,减少ROS释放、MDA生成及GSH消耗有关。     

高血压病人血浆氧化低密度脂蛋白及细胞间黏附分子-1水平的变化

①目的　探讨高血压病人血浆氧化低密度脂蛋白 (OX LDL)和可溶性细胞间黏附分子 1(sICAM 1)水平的变化及其意义。②方法　采用酶联免疫吸附法 (ELISA) ,检测了 10 8例高血压病人和 48例健康人血浆OX LDL、sICAM 1水平的变化。③结果　高血压病人血浆sICAM 1和OX LDL水平明显增高 ,与对照组比较差异有极显著性 (t=11.3 60、12 .85 1,P <0 .0 0 1) ,且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期高血压病人OX LDL、sICAM 1比较差异亦有极显著意义 (F =19.75、2 2 .3 0 ,q =10 .62 5～ 14.3 3 1,P <0 .0 0 1) ,高血压病人OX LDL与sICAM 1含量呈正相关 (r=0 .668,P <0 .0 0 1)。④结论　高血压的发生与血浆sICAM 1和OX LDL水平异常有密切的关系     

氢过氧化亚油酸与硒对人内皮细胞的影响

以氢过氧化亚油酸作为脂质过氧化物,亚硒酸钠作为抗氧剂,作用于培养的人脐带静脉内皮细胞,探讨脂质过氧化与抗氧化作用对细胞结构和功能的影响。结果表明,氢过氧化亚油酸能引起细胞收缩、生物膜系统损伤及前列环素合成减少;硒可使细胞脂质过氧化损伤程度减轻。提示:硒可能通过阻止内皮细胞脂质过氧化反应,起抗动脉粥样硬化病变发生的作用。     

糖尿病性血管病变与血浆氧化低密度脂蛋白及细胞间黏附分子-1水平变化的关系

①目的 探讨糖尿病性血管病变与血浆低密度脂蛋白（ＯＸ－ＬＤＬ）及可溶性细胞间黏附分子－１（ｓＩＣＡＭ－１）水平变化的关系。②方法 采用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）,检测了６０例２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）病人和４８例健康人血浆ＯＸ－ＬＤＬ和ｓＩＣＡＭ－１水平变化。③结果 ＮＩＤＤＭ病人血浆ＯＸ－ＬＤＬ,ｓＩＣＡＭ－１水平明显增高,与对照组比较差异有极显著性（ｔ＝７．０２１,１１．２０３,Ｐ〈０．００１     

联胺对培养人内皮细胞的损伤及维生素E的保护作用

以联胺作用于培养人内皮细胞,激发和促进了脂质过氧化。随联胺浓度增加,内皮细胞过氧化脂质浓度增高,前列环素(PGI_2)合成减少,并出现细胞生物膜系统损伤。抗氧剂维生素E能显著降低联胺引起的过氧化脂质的升高,增加PGI_2的合成,并明显减轻内皮细胞的形态损伤。但在高浓度联胺时,维生素E无明显保护作用。这些结果提示脂质过氧化可能在动脉粥样硬化发生中起重要作用,而维生素E由于保护内皮细胞的氧化性损伤,可能有抗动脉粥样硬化的作用。     

氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

①目的　探讨氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。②方法　采用培养的人脐静脉血管内皮细胞 ,观察氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱所致培养人脐静脉内皮细胞产生和分泌一氧化氮 (NO)及其合酶 (eNOS)、组织型纤溶酶原激活物 (t PA)、纤溶酶原激活物抑制物 (PAI 1)及乳酸脱氢酶活性变化的影响。③结果　溶血磷脂酰胆碱明显增加上清液中乳酸脱氢酶活性 ,提高细胞死亡率 ,增强PAI 1的活性 ,抑制eNOS及t PA的活性 ,与对照组比较差异有显著意义 (F =17.93～ 88.6 8,q =4 .0 1～ 2 0 .88,P <0 .0 5 )。而氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用 (F =6 .34～ 11.2 2 ,q =5 .33～ 13.2 2 ,P <0 .0 5 )。④结论　氨氯地平对溶血磷脂酰胆碱致培养人脐静脉内皮细胞损伤具有保护作用     

LDL和HDL对培养的人血管内皮细胞的影响

本文以不同胆固醇浓度的低密度脂蛋白和高密度脂蛋白或将其混合,施加于培养呈融合状态的人脐带静脉血管内皮细胞。通过相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察,发现LDL对内皮细胞有损伤作用,并随所含胆固醇浓度的增高,其损伤程度加重,损伤机制可能与脂质过氧化物的增加有关。HDL对内皮细胞有保护作用,可使其免遭LDL的损伤,可能与HDL可阻止LDL所引起内皮细胞膜中胆固醇的过多或毒性堆积等有关。     

静脉曲张过程中血管内皮细胞NO合成酶表达变化

目的 探讨下肢静脉曲张过程中管壁血管内皮的变化及一氧化氮（NO）合成酶的改变与静脉曲张发生的关系。方法 选用17例曲张大隐静脉的内皮细胞作为观察组,选择3例正常静脉的内皮细胞作为对照组,应用苏木精-伊红染色观察内皮的一般形态学变化,采用免疫组织化学染色观察内皮细胞NO合成酶的表达情况。结果 正常静脉管壁厚度均匀一致,内弹力膜完整紧密,无断裂,内皮细胞分布均匀;而曲张静脉的管壁厚度不一,内膜不完整,内皮细胞大部分脱落。与正常静脉相比,代偿期曲张静脉内皮细胞NO合成酶表达增高（F=260.83,q=4.96,P〈0.05）,而失代偿期曲张静脉内皮细胞NO合成酶的表达则明显降低（q=11.83,P〈0.05）。结论 曲张静脉内皮组织损伤随病变进程逐渐加剧;曲张静脉内皮细胞NO合成酶的表达从最初的增高到逐渐减低,可作为曲张静脉由代偿到失代偿的标志。