CXCR4基因158沉默对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡及迁移能力的影响

目的 探讨CXCR4基因沉默后对人膀胱癌T24细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。 方法 将T24细胞分为3组,即干扰组、阴性对照组和空白对照组。采用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将靶向沉默CXCR4基因的小干扰RNA(siRNA)序列转染至膀胱癌T24细胞株中,Western-blot检测转染后T24细胞中CXCR4蛋白的表达水平,MTT比色法检测细胞凋亡,Transwell迁移试验观察T24细胞迁移能力。 结果 转染siRNA后,CXCR4蛋白表达量明显下调(P<0.05),与空白对照组及阴性对照组的T24细胞比较,沉默CXCR4基因后,显著抑制膀胱癌T24细胞的增殖活性(均为P<0.05),促进T24细胞凋亡(均为P<0.05); Transwell实验结果提示,RNAi干扰CXCR4表达后能显著抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力(P<0.05)。 结论 RNAi干扰CXCR4表达水平能够抑制T24细胞增殖、促进细胞凋亡及降低细胞的迁移能力,推测CXCR4基因可能是膀胱肿瘤细胞增殖及迁移的重要调控因子之一。     

自杀基因TK腺相关病毒载体的构建及其抑制肿瘤细胞的功能研究

目的 探讨腺相关病毒(rAAV)-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)(简称rAAV-TK)载体的构建及其生物学效应的初步鉴定.方法 用PCR扩增TK序列至pAAV-MCS载体,构建pAAV-TK;采用AAV-Helper Free System包装系统、"氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提"及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩,对病毒颗粒进行鉴定;用MB49-PSA细胞对rAAV-TK生物学效应进行初步鉴定.结果 成功构建pAAV-TK载体,并经酶切、PCR及测序验证其准确性;rAAV病毒颗粒滴度达2×1010v.p/mL,浓缩后可达到2 × 1011～2×1012v.p/mL;rAAV-TK可以分泌TK基因,加入药物更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)和吉地他滨(Gemcitabine,GVC),该基因能有效诱导膀胱肿瘤细胞MB49-PSA凋亡.结论 成功构建rAAV-TK腺相关病毒,体外实验表明rAAV-TK/GVC/GCV系统能高效诱导膀胱肿瘤细胞的凋亡.     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣;转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况,收集角膜,其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相,另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天,体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达;7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。     

端粒酶逆转录酶基因反义寡核苷酸抑制膀胱癌细胞生长的机制

目的 :探讨端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)反义寡核苷酸 (ASODN)对T2 4膀胱癌细胞生长的影响及作用机制 .方法 :采用脂质体介导技术 ,将hTERT基因ASODN转染入T2 4膀胱癌细胞中 ,应用端粒酶PCR ELISA法检测端粒酶活性变化 ,MTT法测定细胞生长变化 ,流式细胞术观察对细胞周期影响 .结果 :hTERT基因ASODN作用T2 4膀胱癌细胞后显著地抑制膀胱癌细胞端粒酶活性 ,吸光度A值降为 0 .4 5 .癌细胞生长增殖受限 ,抑制作用具有序列特异性和剂量依赖性 ,并出现细胞凋亡现象 ,凋亡率为 14 .8%,与SODN转染组及空白对照组进行比较 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 ) .结论 :hTERT基因ASODN能特异性抑制T2 4膀胱癌细胞生长 ,下调端粒酶活性 ,促进细胞凋亡 .为膀胱肿瘤基因治疗的临床应用提供新靶点     

hTERT启动子调控的野生型p53基因对膀胱癌细胞的靶向性抑制作用

目的:探讨人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的野生型p53基因的靶向性表达,观察对人膀胱癌细胞株T24的选择性杀伤效应及细胞凋亡的影响。方法:采用脂质体转染法,将构建的含hTERT启动子调控表达人野生型p53基因和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,分别转染膀胱癌细胞株T24和正常人胎肺成纤维细胞,应用荧光显微镜、电镜、台盼蓝拒染法及流式细胞仪等方法,观察基因的靶向性表达及对膀胱癌细胞株T24细胞形态学、生长抑制曲线及细胞周期变化的影响。结果:转染hTERT启动子调控的目的基因可在端粒酶阳性的膀胱肿瘤细胞中靶向性表达发出绿色荧光。靶向转染野生型p53基因能抑制膀胱癌细胞生长,72h后细胞生长抑制率分别为48.5%、高于常规培养组3.6%和阴性对照组2.5%,差异有显著性意义(P<0.05)。电镜可见典型的凋亡细胞。细胞周期分析G0和G1期细胞比例明显增高,并出现凋亡峰。结论:构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥靶向性抑制膀胱癌细胞生长作用。     

shRNA沉默基因DNMT1的表达对膀胱癌T24细胞增殖与凋亡的影响

目的 体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因DNMTl的表达对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨DNMT1在膀胱肿瘤形成过程中的作用机制.方法 实验分为空白对照组(给予脂质体)、HK组(含无效干扰序列的质粒)及pshRNA-DNMT1组;常规培养膀胱癌T24细胞株,用脂质体Lipofeetamine 2000将构建成功的重组质粒pshRNA-DNMT1转染进入T24细胞,然后进行RT-PCR、Western blot检测各组DNMT1 mRNA及蛋白质水平变化;进行MTT,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组T24细胞增殖和凋亡情况.结果 重组质粒pshR-NA-DNMT1成功转染进入膀胱癌T24细胞;经RT-PCR检测pshRNA-DNMT1组DNMT1 mRNA表达减少,24、48、72h的抑制率分别是28.44%、52.48%、70.91%;转染pshRNA-DNMT1后,T24细胞中DNMT1蛋白24、48和72 h的抑制率分别为24.27%、57.79%、69.74%;在MTT检测中,pshRNA-DNMT1组的细胞增殖抑制率在24、48、72 h分别为(4.34±0.76)%,(9.87±1.54)%和(13.78±1.93)%,与空白对照组比较各时间点差异均有极显著性意义(均P<0.01);转染24、48和72 h后,pshRNA-DNMT1组细胞凋亡率分别为(3.87±0.81)%、(8.69±1.23)%和(11.46±1.24)%,与空白对照组比较差异均有极显著性意义(均P<0.01).结论 重组质粒pshRNA-DNMT1能有效降低膀胱癌细胞中DNMT1基因mRNA及蛋白的表达,并在一定程度上抑制T24细胞的增殖和促进凋亡.     

腺病毒介导的ING4基因对人膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制

目的 探讨腺病毒介导的人生长抑制因子4(ING4)基因对人膀胱移行细胞癌T24细胞体外抑癌效应及其分子机制.方法 将含ING4的重组腺病毒(Ad-ING4)转染T24细胞,以空载体组、未转染组细胞作对照.应用半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测各组ING4基因及蛋白质在T24细胞中的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组T24细胞生长情况;流式细胞术(FCM)和Hochest 33258染色法检测各组T24细胞凋亡变化;半定量RT-PCR法检测各组细胞中凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)、p53、缺氧诱导因子(HIF)1α和半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达;Western印迹法检测各组细胞中caspase-3蛋白的表达.结果 腺病毒介导的ING4基因在T24细胞中成功表达,能明显诱导T24细胞凋亡,其凋亡率可达17.2%±4.1%,高于空载体组(4.7%±1.2%)和未转染组(4.8%±1.2%,P<0.05);外源性ING4基因可引起T24细胞中p53、Bax基因表达上凋(1.40±0.11比0.27±0.04,1.50±0.12比0.60±0.05)和Bcl-2、HIF-1α基因表达下凋(0.19±0.02比1.20±0.08,0.33±0.03比0.98±0.06,均P<0.05),并促进caspase-3活化.结论 腺病毒介导的ING4基因在体外可通过上凋p53、Bax/Bcl-2基因和下凋HIF-1α基因表达,导致caspase-3的活化而抑制人膀胱移行细胞癌T24细胞的生长,并诱导其凋亡.     

RUNX3抑癌基因真核表达载体的构建以及在膀胱癌T24细胞中的表达

[目的]构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并在膀胱癌T24细胞株中表达.[方法]RT-PCR从人正常膀胱组织中获取RUNX3基因并测序,将RUNX3基因克隆进pIRES2-EGFP载体,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并进行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证.脂质体介导下转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.[结果]成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,用脂质体转染人膀胱癌T24细胞后,在荧光显微镜下观察到带绿色荧光的人膀胱癌T24细胞.[结论]成功构建RUNX3基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3并在膀胱癌T24细胞中表达,为进一步研究RUNX3与膀胱癌的关系奠定基础.     

1型重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染人脐静脉内皮细胞的体外研究

目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90％(MOI=5×103),58.56％(MOI=5×104),68.31％(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.     

超声辐照与丁酸钠对腺相关病毒转染大鼠视网膜色素上皮细胞的影响

目的 探讨超声辐照与丁酸钠在携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中的应用价值.方法 大鼠RPE细胞接种于24孔板中,分别以rAAV2-EGFP(对照组)、rAAV2-EGFP+超声辐照(超声辐照组,辐照时间60 s,声强0.5、1 W/cm2)、rAAV2-EGFP+不同终浓度丁酸钠(丁酸钠组)转染大鼠RPE细胞.转染后48 h,倒置荧光显微镜观察转染细胞EGFP表达情况,流式细胞仪检测细胞转染效率(EGFP阳性细胞百分率);转染后24 h,MTS法检测细胞增殖.结果 流式细胞仪检测结果显示:超声辐照组和丁酸钠组EGFP阳性细胞百分率显著高于对照组(P＜0.05),丁酸钠组转染效率提高的百分率显著高于超声辐照组(P＜0.05).细胞增殖检测结果显示,超声辐照组转染细胞的吸光度值显著高于丁酸钠组(P＜0.05).结论 丁酸钠和超声辐照均能提高rAAV2-EGFP对大鼠RPE细胞的转染效率,其中丁酸钠的效果显著,而超声辐照对细胞增殖的抑制程度较轻.     

靶向sKDR对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察靶向可溶性血管内皮生长因子受体（sKDR）对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨KDR基因作为膀胱癌基因治疗靶点的可行性和有效性。方法：将人膀胱癌细胞T24分为sKDR转染组、未转染组和对照组,构建靶向sKDR真核分泌型表达质粒PCI-KDR,经Lipofctamine^TM2000转染T24细胞,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测能否与VEGF结合,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测稳定表达sKDR的T24细胞KDR基因表达水平,噻唑蓝比色法（MTT）检测sKDR对T24细胞增殖的作用,转移酶末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡率,裸鼠皮下移植稳定表达sKDR的T24细胞,观察其成瘤性的改变。结果：与未转染组比较,转染组稳定表达sKDR的T24细胞其KDR mRNA表达水平升高了4.16倍,细胞增殖抑制率增加了55.1%（P<0.01）,细胞增殖速度明显缓慢并出现显著的凋亡峰。在裸鼠体内转染组与未转染组上述各项指标比较差异有显著性（P<0.01）,转染组肿瘤生长明显缓慢,成瘤能力受抑。结论：靶向sKDR能够在很大程度上抑制膀胱癌T24细胞增殖并促进其凋亡。     

转染Livin基因对膀胱癌细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡抑制基因Livin对膀胱癌细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+及仅转染载体的T24/pcDNA3.1(+).用丝裂霉素C(MMC)分别作用于转染前后的膀胱癌细胞系,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染前后细胞生长抑制率,应用流式细胞仪(FCM)及吖啶橙(AO)染色检测细胞凋亡.结果 成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+;经MMC作用24 h后,T24/pcDNA3.1(+)细胞与T24的细胞凋亡率分别为(21.4±2.3)%和(19.6±2.3)%,而T24/Livin+的细胞凋亡率则为(8.7±1.5)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Livin基因提高了T24膀胱癌细胞的抗凋亡能力,特别是在膀胱癌化疗中显示出更强的抗凋亡能力.     

DDX46基因慢病毒载体的构建及其在人膀胱癌细胞中的表达

目的 构建DDX46基因低表达慢病毒载体,并检测其在人膀胱癌细胞中的表达效果,为DDX46基因在人膀胱癌细胞中的研究奠定基础.方法 应用实时荧光定量检测5637细胞和T24细胞中DDX46 mRNA表达水平,以寻找合适的细胞系进行实验.分别以DDX46基因序列和普适型阴性序列为模板,设计合成靶点序列,并合成寡核苷酸双链,定向克隆到慢病毒质粒GV115,合成重组质粒shDDX46和shRNA,分别称之为实验组和对照组.将不同重组质粒与pHelper 1.0和pHelper 2.0分别转染293 T细胞以包装成慢病毒颗粒后感染5637细胞和T24细胞.应用实时荧光PCR定量检测重组慢病毒感染5637细胞和T24细胞后DDX46mRNA表达水平,判断其干扰效率.结果 5637细胞和T24细胞均高丰度表达DDX46mRNA,其结果(用ΔCt值表示)分别为(6.53±0.08)和(8.48±0.11);重组慢病毒感染膀胱癌细胞后,在5637细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.32±0.01),低于对照组(1.00±0.10),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为67.70％;在T24细胞中,实验组DDX46 mRNA的表达水平(用ΔCt值表示)为(0.11±0.01),低于对照组(1.00±0.03),差异有统计学意义(P<0.05),其敲减效率为89.00％.结论 成功构建DDX46基因低表达慢病毒载体,为研究DDX46基因在膀胱癌细胞中的作用奠定了基础.     

长链非编码RNA-scarna 4在膀胱尿路上皮癌的作用研究

目的 观察长链非编码RNA-scarna 4(LncRNA-scarna 4)在膀胱尿路上皮癌的表达,探讨抑制其表达对癌细胞的生长活力、凋亡和增殖活动的影响,明确其调控通路。方法 收集尿路上皮癌组织及癌旁组织标本(n=6)、T24和HT1376尿路上皮癌细胞及正常尿路上皮细胞SV-HUC-1,qRT-PCR检测其LncRNA-scarna 4表达。分别将T24及HT1376细胞分为3组:Lnc-S组转染LncRNA-scarna 4的siRNA,Lnc-C组转染随机序列siRNA,C组与单纯培养基培养。通过台盼蓝拒染法鉴定细胞生长活力、Hoechst33342凋亡染色及Western Blot检测凋亡蛋白Bcl2表达,观察细胞凋亡活动、软琼脂集落形成实验观察肿瘤细胞增殖活动;Western Blot观察PI3K/Akt通路蛋白表达。结果 LncRNA-scarna 4在膀胱癌组织、T24及HT1376细胞表达显著增高(P<0.05)。转染抑制LncRNA-scarna 4表达导致Lnc-S组活细胞率显著降低(T24:42.1%±11.2% vs. 87.3%±8.5%;HT1376:35.3%±8.2% vs. 81.4%±10.4%,P<0.05),凋亡细胞数(/10³细胞)显著增加(T24:88±11 vs. 41±9;HT1376:79±8 vs. 47±8,P<0.05),凋亡蛋白Bcl2表达亦显著增加(T24:181.4%±20.6% vs. 119.6%±11.3%;HT1376:213.3%±34.6% vs. 121.4%±24.4%,P<0.05),克隆形成数显著降低(T24:2.6±1.1 vs. 12.5±4.6;HT1376:3.6±2.0 vs. 12.1±2.0,P<0.05),增殖及迁移PI3K/Akt通路蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 LncRNA-scarna 4在膀胱尿路上皮癌表达异常增高,通过抑制其表达促进癌细胞凋亡、抑制其增殖能力,其作用通路是PI3K/Akt通路。     

外源性表达VEGF165b对顺铂诱导人膀胱癌T24细胞损伤的影响及其机制

目的:观察人膀胱癌T24细胞中外源性表达血管内皮生长因子(VEGF)变构体VEGF165b对顺铂(DDP)诱导人膀胱癌T24细胞损伤的作用,并探讨相关机制。方法:构建VEGF165b表达载体pcDNA-VEGF165b;T24细胞分为对照组、VEGF165b组(转染VEGF165b表达载体)、DDP组和VEGF165b+DDP组(DDP联合转染VEGF165b表达载体)。MTT法检测各组细胞存活率;Western blotting法检测各组T24细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase3表达;TUNEL法检测细胞凋亡数。结果:MTT法检测,与对照组比较, VEGF165b组24和48 h时T24细胞存活率无明显变化(P>0.05);与DDP组比较,VEGF165b+DDP组24和48 h时细胞存活率均明显降低(P<0.05)。Western blotting法检测,与对照组比较,DDP组细胞中cleaved-caspase3/pro-caspase3比值升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05);与DDP组比较,VEGF165b+DDP组细胞中cleaved-caspase3/pro-caspase3比值升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。TUNEL法检测,与对照组(5.1±2.7)和VEGF165b组(7.4±3.2)比较,DDP组的凋亡细胞数(26.3±8.2)的凋亡细胞数增加(P<0.05)。与DDP组比较,VEGF165b+DDP组的凋亡细胞数(41.3±6.9)增加(P<0.05)。结论:外源性表达VEGF165b能通过增加细胞凋亡促进DDP对T24细胞的损伤,其机制与VEGF信号通路受抑制有关联。     

hTERT启动子调控的p53基因膀胱癌细胞靶向性表达载体构建及意义

目的:构建人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子调控的含有治疗基因的质粒,探讨在膀胱癌细胞株中特异性靶向转录表达及其潜在的临床意义。方法:将hTERT起始转录区上游的启动子序列克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)基因及含野生型p53基因的质粒上,分别构建成质粒phTERT-GFP及phTERT-p53。脂质体转染法瞬时转染膀胱癌细胞株T24,应用荧光显微镜、噻唑蓝(MTT)法等方法观察在转染细胞中的差异性表达及膀胱癌细胞生长的靶向性抑制作用。结果:在端粒酶阳性的膀胱细胞中观察到hTERT启动子调控的绿色荧光蛋白的靶向性稳定表达,转染hTERT启动子调控的野生型p53基因靶向性抑制膀胱癌细胞生长,但对端粒酶阴性的正常细胞无明显影响(P<0.05)。结论:成功构建的hTERT启动子调控表达的野生型p53基因和GFP基因可在膀胱癌细胞T24中靶向性表达,hTERT启动子调控表达p53基因可靶向性抑制膀胱癌细胞生长。     

β-胡萝卜素对人膀胱癌T24细胞生物学行为的影响

目的:探讨β-胡萝卜素对人膀胱癌T24细胞细胞增殖和凋亡的影响。方法:不同浓度的β-胡萝卜素作用于T24细胞,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测T24细胞的凋亡指数。结果:MTT法检测结果显示10μmol/L和20μmol/L组β-胡萝卜素均能明显抑制T24细胞的生长,抑制率分别为28.83%和63.02%(P<0.05);流式细胞术检测显示β-胡萝卜素能诱导T24细胞调亡,5μmol/L组T24细胞的凋亡指数为(0.065±0.018)(P<0.05),10μmol/L和20μmol/L组凋亡指数分别为(0.126±0.022)和(0.190±0.024)(P<0.01),呈现剂量依赖效应,10μmol/L组及20μmol/L组Hochest染色可见凋亡小体形成。结论:β-胡萝卜素抑制T24细胞的生长,并且呈现剂量依赖效应,其机制可能为诱导细胞凋亡。