大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法骨髓穿刺法抽取新西兰白兔髂骨骨髓5ml，应用密度梯度离心法分离纯化MSC并进行体外扩增，倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况，计数细胞数目，绘制细胞乍长曲线。HE染色光镜观察细胞形态，采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。结果成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法。生长动力学分析发现，传代细胞随传代次数的增加其增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强，生长旺盛。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞，第3～5代细胞增殖能力强，可用于进一步的研究工作。     

脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

目的：分离培养人脐血间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC）,体外观察其生长特性,并在特定条件下诱导分化,探讨其成脂成骨分化能力.方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态及生长情况;流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物;用茜素红染色和油红0染色分别鉴定其成骨成脂分化能力.结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长,呈均一梭形,具有较强的增值能力,流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志CD73,CD105和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45;成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性;成脂诱导3周后细胞油红0染色阳性.结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力,表达间充质干细胞的表面标记,具有成骨成脂分化潜能.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及其生物学性状的研究

目的：分离培养兔骨髓间充质干细胞，对其生物学性状进行观察。方法：用密度梯度离心法与贴壁培养法相结合，分离兔骨髓间充质干细胞，进行体外培养扩增，绘制其生长曲线，用倒置显微镜、细胞爬片、扫描电镜、透射电镜观察细胞的生物学性状。结果：密度梯度离心后，活细胞比例在95％以上，贴壁培养的细胞呈纺锤形，细胞增殖力强，平均倍增时问为32h，细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降。结论：密度梯度离心与贴壁培养相结合可以提高细胞分离效率。体外培养的兔骨髓问充质干细胞生长稳定，增殖力强，可以作为组织工程的种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性及成骨诱导分化的研究

[目的]探讨成人骨髓间充质干细胞分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其成骨分化过程中Runx2基因的动态表达以及生物学特性。[方法]取自人股骨近端骨髓标本,利用联合密度梯度离心和差异贴壁法分离骨髓间充质干细胞,体外扩增和传代培养,流式细胞仪检测细胞表面标记,诱导向成骨细胞分化,并采用RT-PCR和Western blot方法检测Runx2的动态表达。[结果]原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲呈成"S"形,细胞表面标记物CD90阳性表达,CD34和CD45阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞的表型特征,随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。[结论]该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有成骨分化潜能,为骨组织工程提供理想的种子细胞,同时证实Runx2在成骨分化中起到重要的调控作用。     

大鼠牙髓干细胞与骨髓间充质干细胞分化成骨样细胞能力对比研究

目的：以骨髓间充质干细胞作为参考,讨论牙髓干细胞作为骨组织修复种子细胞的可行性。方法：通过酶消化法获得大鼠牙髓干细胞,离心法获得骨髓间充质干细胞,贴壁培养,通过倒置光学显微镜观察二者形态差异;流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞的间质细胞表面标志物表达;MMT法检测细胞生长曲线;特定的成骨诱导液诱导干细胞成骨分化,免疫荧光法检测成骨细胞表面标志物表达。结果：分离的大鼠骨髓间充质干细胞与牙髓干细胞形态学以及生长特性具有相似性,且符合间充质干细胞特性,牙髓干细胞第4天进入对数生长期,第7天进入平台期,骨髓间充质干细胞第4天进入对数生长期,第8天进入平台期;经过成骨诱导后二者都具备成骨样细胞分化能力,牙髓干细胞在成骨诱导后的骨钙素表达上与骨髓间充质细胞有着相似的能力;牙本质泌涎蛋白表达阳性。结论：牙髓干细胞具有与骨髓间充质干细胞都具有成骨分化能力,但牙髓干细胞细胞成分相对复杂,增殖能力较强。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养及分化潜能的鉴定

目的建立猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离培养和鉴定的方法,探讨体外培养的间充质干细胞的一些生物学特点,为利用猪的实验研究提供实验基础.方法从猪的髂嵴穿刺取骨髓,经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞,接种后形成单层贴壁的成纤维样的细胞.检测细胞周期,多向诱导分化鉴定分离的细胞.结果体外培养的原代MSCs 12～14d达到融合,传代后仍具有分化成骨的能力,细胞周期显示有80%细胞处于G0/G1期.结论体外培养猪的MSCs具有分化成骨的潜能,生长稳定,传代后仍保持未分化状态.猪骨髓间充质干细胞分离培养体系的建立为基础研究和组织工程提供了一个有价值的动物模型.     

同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定

目的：探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外的共培养方法，并行神经分化诱导。方法：分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，各传至第3代后。取等量细胞混合后共培养，共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导，并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态，经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论：同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

[目的]建立人骨髓来源的间充质干细胞( hBMSCs)分离、培养及传代的方法,观察成hBMSCs体外成骨潜能.[方法]采用全骨髓贴壁筛选法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;所得细胞第3代用含100 nmol/L地塞米松、5mmol/Lβ -甘油磷酸钠,50 μg/ml抗坏血酸的条件培养基进行骨诱导,茜素红染色鉴定.[结果]分离培养的细胞流式细胞术检测显示CD44、CD105阳性,而CD34、CD45阴性,符合MSCs特征;hBMSCs经骨诱导后可形成钙结节,茜素红染色显示阳性.[结论]全骨髓贴壁筛选法可分离获得高纯度的hBMSCs,其在体外具有成骨潜能.     

自骨密质中分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的介绍一种自Wistar大鼠骨密质中分离培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的方法。方法应用骨髓密度梯度离心、酶消化骨密质两种方法分离、培养Wistar大鼠MSC,比较其形态学、体外增殖能力差异;并用碱性磷酸酶染色和油红O染色分别鉴定MSC的成骨和成脂分化潜能。结果采用密度梯度离心骨髓或用酶消化后的骨密质,经贴壁培养后均能够成功分离和培养大鼠的MSC,两者在形态学和体外增殖能力方面无明显差异;且两种方法培养的MSC经特异性诱导剂诱导后,均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色及碱性磷酸酶染色均阳性。结论自骨髓和骨密质中均能够分离培养出较为纯化的大鼠MSC,两种方法培养的MSC体外生物学性能无明显差异。     

人脐血源和骨髓源间充质干细胞神经前体细胞分化的研究

目的 对比研究人脐血和骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外的分离、培养和生物学特性,并观察其分化潜能和形态学变化,为组织工程选取种子细胞提供实验依据.方法 Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法分别分离纯化成人骨髓和脐血源MSCs,体外培养和连续传代,并在含有2%B27的Neurobasal培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子,将获得的MSCs向神经干细胞定向诱导,利用倒置显微镜连续观察细胞培养、传代和向神经细胞表型转化过程的形态学变化;采用免疫组化和荧光免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定.结果 原代分离的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在接种后48 h贴壁,7 d细胞呈长梭形,有一定的方向性,并达到90%融合;而脐血间充质干细胞(UMSCs)48 h后贴壁,似乎贴的不牢,持续14d才能形成小丛、小簇、小集落,21 d排列才有一定的方向性.培养基添加神经营养因子诱导后的细胞呈现典型的神经前体细胞样表型,免疫组化和免疫荧光结果显示,诱导后的细胞能特异性表达神经元特异性标志β微管蛋白(β-tubulin)和星形胶质细胞特异性标志神经胶质相关蛋白(GFAP).结论 人脐血和骨髓中含MSCs,且具备其基本恃征,体外培养UMSCs生长速度比BMSCs缓慢10 d～15 d左右,传代以后的各组细胞生长速度与形态无明显差异.骨髓和脐血来源的MSCs在体外可定向诱导分化为神经细胞.     

hBMP-2基因改良修饰骨髓间充质干细胞和人脐血间充质干细胞研究

目的研究hBMP-2基因改良修饰骨髓和人脐血间充质干细胞的方法,并比较修饰结果。 方法联合应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养骨髓和人脐血间充质干细胞,通过高效非脂质体试剂X-treme GENE介导重组hBMP-2质粒转染骨髓和人脐血间充质干细胞,倒置荧光显微镜检测荧光强度并计算转染效率,qPCR检测hBMP-2及软骨连接蛋白在两种细胞中的表达,免疫组化检测细胞中Ⅱ型胶原的变化。 结果成功分离、培养出骨髓和人脐血间充质干细胞,两种细胞具有不同的生长特性。高效非脂质体试剂介导的重组hBMP-2质粒成功转染骨髓和人脐血间充质干细胞,转染骨髓间充质干细胞效率[（18.44±5.94）%]低于人脐血间充质干细胞[（27.74±7.59）%],且差异有统计学意义（t=3.027,P<0.05）。转染后的两种细胞均检测到hBMP-2、软骨连接蛋白及Ⅱ型胶原的表达。 结论hBMP-2基因可以有效改良修饰骨髓和人脐血间充质干细胞,且能促进其向软骨细胞方向分化。     

特定序列寡核苷酸对人骨髓间充质干细胞体外扩增及成骨分化的影响

目的探讨特定序列人工合成的寡核苷酸（Oligodeoxynucleotide,ODN）MT01对人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenehymal stem cells．hBMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法采用Ficoll梯度密度离心法分离培养hBMSCs并进行鉴定。以1μg／mL的ODN MT01处理hBMSCs,细胞计数试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测成骨分化情况。结果经1μg／mL的ODN MT01处理的hBMSCs体外培养,第3、4、5、6、7天hBMSCs增殖明显;成骨诱导的第4、14、21天．碱性磷酸酶表达明显增加。结论特定浓度人工合成ODN MT01能够在体外促进hBMSCs的扩增及成骨分化。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、扩增及诱导分化

目的探讨兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞的途径,为进一步的实验研究打下基础。方法抽取兔股骨骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代,倒置显微镜下观察细胞形态。取第3代细胞向成骨细胞和成脂肪细胞诱导,14d后成骨细胞诱导组检测碱性磷酸酶,成脂肪细胞诱导组进行油红O染色。结果全骨髓贴壁培养法可获得BM-MSCs,原代和传代培养的BM-MSCs具有活跃的增殖能力。成骨细胞诱导组碱性磷酸酶检测表达阳性,成脂肪细胞诱导组油红O染色见胞浆内出现大量红染脂滴。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BM-MSCs,分离培养的BM-MSCs生长稳定,增殖力强,可向成骨细胞和成脂肪细胞诱导分化。     

成人骨髓基质干细胞的分离与纯化

目的利用免疫磁珠分离成人骨髓神经生长因子受体(nerve growth factor receptor,NGFR)阳性细胞,获得同质性骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs).方法采用Percoll密度梯度离心法分离成人骨髓中单个核细胞(mononuclear cells,MNCs).对MNCs进行常规贴壁培养或应用磁分离技术分离NGFR+细胞.分别检测NGFR+细胞和常规贴壁培养所获BMSCs体外扩增和集落形成能力,分析其细胞表型和细胞周期,并进行成骨、成脂肪诱导.结果免疫磁珠分离获得NGFR+细胞的纯度为(90.4±4.7)%,NGFR+细胞较贴壁培养获得BMSCs具备更强增殖能力和成骨及成脂肪分化潜能.结论利用免疫磁珠分离骨髓NGFR+细胞可以获得同质性原始BMSCs.     

Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究

目的：对Ad－BMP－2／GFP转染兔骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT 法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot 检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs ,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。 Ad－BMP－2／GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs 的增殖（P＜0．05）,Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP－2目的蛋白。结论 Ad－BMP－2／GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。     

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞诱导的方法学研究进展

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可向软骨分化,具有来源广泛、取材方便、易于培养且无明显自体移植免疫排斥反应等优点,在体外进行定向分化可作为软骨修复的种子细胞.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性单一的软骨细胞,对组织工程及细胞的实验至关重要.然而,在骨髓中BMSCs含量极低,体外分离培养诱导方法不一,培养难度大.因此,总结骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并归纳细胞形态学、表面标志物鉴定及其向软骨细胞方向诱导分化的方法很有必要.     

脐血间充质干细胞的分离扩增及向成骨及脂肪细胞的分化

目的探讨新生儿脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。方法无菌条件下收集新生儿脐血60～120ml，枸橼酸钠抗凝，以Ficoll—Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）。分离获得的MNCs采用L—DMEM培养基或Mesencult^TM培养基／10％胎牛血清进行MSCs培养传代，获得第3代集落生长细胞作流式细胞仪表面抗原测定，并向成骨及脂肪细胞定向诱导分化，成骨细胞钙沉积经茜素红染色鉴定，脂肪细胞胞浆油滴经油红染色鉴定。结果经沉降红细胞后分离的MNCs，使用Mesencult^TM培养基／10％胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29、CD59、CD71而不表达CD34、CD45及HLA—DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积；成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论新生儿脐血中可分离出MSCs，并可在体外进行培养扩增。以甲基纤维素沉降红细胞后密度梯度离心分离的MNCs培养较为有效，集落细胞表达基质细胞表面抗原，能够向成骨细胞及成脂肪细胞定向诱导分化。