四环素调控的介导bFGF重组腺相关病毒的构建及体外实验

目的:制备携带碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ,bFGF)的病毒载体,能被四环素调控表达。方法:构建重组质粒pAAV-S3-bFGF,生产重组病毒rAAV2-tet-off-bFGF,并感染小鼠颅骨前成骨细胞MC3T3-E1,实时定量PCR检测强力霉素(doxycycline,Dox)调控下rAAV2-tet-off-bFGF对MC3T3-E1中成骨相关因子的影响。结果:生产出高滴度及纯度的重组病毒rAAV2-tet-off-bFGF,能被Dox调控,感染 MC3T3-E1后能促进胞内成骨相关因子的表达升高。结论:这种重组病毒rAAV2-tet-off-bFGF能在Dox调控下有效传递外源基因,为骨组织工程中的种子细胞提供基因传递载体。     

介导Sonic Hedgehog基因传递载体的体外构建实验

目的：制备高纯度滴度的病毒载体，介导外源基因Sonic Hedgehog传递至骨组织工程的种子细胞内。方法：包装重组质粒pSNAV2．0-Shh，生产重组病毒rAAV—Shh，并感染小鼠颅骨前成骨细胞MC3T3-E1，流式细胞仪及实时定量PCR检测基因传递效果。结果：生产出高滴度及纯度的重组病毒rAAV—Shh，能有效感染MC3T3-E1，促进胞内成骨相关因子的表达升高。结论：这种重组病毒rAAV—Shh能有效传递外源基因，为骨组织工程中的种子细胞提供基因传递载体。     

鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷用于组织工程支架修复颅骨缺损实验研究

目的 观察鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷支架用于组织工程支架修复颅骨缺损的成骨性能.方法 来源于髂骨松质骨的自体骨髓基质细胞经含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导液培养,直至培养皿底部形成一层膜性结构,用该膜性结构包绕多相钙磷陶瓷支架后将其植入兔颅骨缺损区.单纯支架材料植入和不植入材料作为对照.植入后4 w、8 w取材,通过X线片分析、大体和组织学观察评价其成骨性能.结果 支架/细胞复合物植入后4 w,在材料表面及孔隙内形成部分成熟骨和骨髓组织;植入后8w,更多的成熟骨形成,新形成的组织工程骨与颅骨融合.结论 支架/细胞复合物能够有效地修复颅骨缺损,鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷可能成为一种有发展前景的骨组织工程支架材料.     

支架材料的免疫反应对骨组织再生的影响

大多数组织工程方法都试图通过将干细胞与生物相容性材料和生物活性因子结合来改善损伤后的再生效果。骨组织工程的主要组成部分是种子细胞、支架材料和生长因子。将支架材料植入骨组织损伤部位,增强细胞的成骨活性,提高骨组织生长的能力,从而促进骨组织再生。然而,植入材料可能引起宿主的免疫反应,决定着骨组织再生的效果。该文就支架材料引起的组织免疫反应对骨组织再生的影响作一综述。     

碱性成纤维细胞生长因子与骨再生修复

骨组织的再生修复一直是多年来的研究热点之一，而生长因子因其能够促进组织细胞的生长和分化也已引起了广泛的关注。骨组织工程学的发展把生长因子作为重要激活物与种子细胞、支架材料、立体培养等联系在一起，成为构建骨组织再生修复必不可少的要素。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是主要的生长因子之一，但由于其促进成骨与毛细血管生成的双重作用，使其在促进骨再生修复方面的前景日益受到人们的重视。另外，它还可通过细胞因子网络发挥广泛的生物学作用。现就bFGF在骨组织再生修复过程中的作用及机制，及其在细胞因子网络中与其他因子的相互作用作一综述。     

鸵鸟骨转化羟基磷灰石支架复合骨膜修复颅骨极限缺损实验研究

目的：观察鸵鸟骨转化羟基磷灰石支架复合骨膜修复颅骨缺损的成骨性能。方法：鸵鸟骨转化多孔羟基磷灰石作为支架材料。24只新西兰大白兔随机分为3组并在其颅骨上制备极限缺损，修复方法分别为A组：支架材料＋骨膜植入，B组：单纯支架材料植入，C组：自体颅骨植入。植入后8、16周取材，通过X线片分析、大体和组织学观察评价其成骨性能。结果：大体观察发现A组陶瓷材料孔隙表面及内部有大量新骨形成，新骨与周围颅骨发生骨性融合，其强度与邻近颅骨接近。X-线片显示A组绝大多数区域呈现高密度阻射影。组织学观察显示新的板层状骨组织、骨髓腔及骨髓细胞在陶瓷支架孔隙表面及内部形成。B组材料大部分被纤维组织覆盖或充填。结论：支架／骨膜复合物能够有效地修复颅骨缺损，结果提示鸵鸟骨转化羟基磷灰石能够对骨膜提供良好的支持作用。     

新型3D打印生物材料用于兔颅骨缺损修复重建的实验研究

目的 :观察3D打印生物活性玻璃陶瓷改性材料(AP40mod)对颅骨缺损的修复能力。方法 :将AP40mod制成支架材料,羟基磷灰石/磷酸钙复合材料(HA-TCP)作为对照材料。27只新西兰大白兔随机分为3组并在颅骨上制备极限缺损并采取不同方法处理缺损。A组为空白对照(制造全层缺损无任何植入物),B组为AP-40mod支架材料植入,C组为HA-TCP支架材料植入。植入后4、8、12周取材,通过大体观察,显微CT分析和组织学染色评价其成骨性能。结果:显微CT结果显示A组缺损区边缘向缺损内部有部分新骨形成且随着时间增加新骨逐渐增多,B组较C组材料吸收比率更高,材料与周围颅骨骨性结合更好,新骨形成更多。组织学观察显示,B组可见新的板层状骨组织、骨髓腔及骨细胞在AP40mod支架孔隙表面及内部形成。新骨的结构、成熟度、成骨量均较HA-TCP支架更好。结论:AP40mod材料在兔颅骨缺损中能与颅骨紧密结合,诱导新骨组织生成,能有效的修复颅骨缺损。     

鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷支架负载骨髓基质细胞异位成骨性能研究

目的：观察鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷复合骨髓基质细胞后植入裸鼠皮下的成骨性能。方法：获取兔髂骨松质骨骨髓基质细胞，体外分离、扩增、诱导后接种于多相钙磷陶瓷支架。支架／细胞复合物植入裸鼠背部皮下，单纯支架材料植入作为对照。植入后4周、8周取材，通过大体、组织学观察评价成骨活性。结果：支架／细胞复合物植入后4周，新骨主要以软骨为主，部分区域见少量成熟骨，可见软骨内成骨方式。植入后8周，材料表面和孔隙内有更多的成熟骨形成，部分区域有血管和多核巨细胞分布。结论：支架／细胞复合物显示良好的成骨活性，鸵鸟骨转化多相钙磷陶瓷可以用于骨组织工程支架材料。     

异种脱钙骨兔体内成骨能力的实验研究

目的制备猪脱钙骨,将兔骨髓间质干细胞与猪脱钙骨支架形成细胞-生物材料复合物,回植入兔皮下观察该材料体内成骨能力。方法梯度离心法分离兔骨髓基质干细胞,向成骨细胞方向诱导培养。将猪颅骨用氯仿丙酮及过氧化氢处理后冻干保存,钴60照射消毒待用。制备细胞-生物材料复合物后植入兔皮下,分别在4w,8w,12w取材,同期大体观察及组织学检测,切片HE染色。结果倒置相差显微镜下见细胞在材料孔隙间大量生长增殖、交叠覆盖;扫描电镜观察细胞贴附于材料表面并向孔隙内生长。组织学检测4w实验组见多数骨小梁表面有细胞被覆,有较多小血管形成。8w、12w实验组见新生骨小梁有新生骨组织形成,见成骨细胞和破骨细胞并存。结论兔骨髓间质干细胞与猪脱钙骨有良好的生物相容性,在该支架材料上细胞增殖分化并具有一定的体内成骨能力。     

骨髓间充质干细胞复合多孔纳米羟磷灰石/聚酰胺6整复大鼠颅骨缺损的实验研究

目的初步探讨纳米羟磷灰石/聚酰胺6（n-HA/PA6）多孔材料对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及分化的影响,以及BMSCs作为种子细胞、多孔n-HA/PA6作为支架材料构建组织工程化骨修复大鼠颅骨极限骨缺损的可行性及整复效果。方法矿化诱导的第3代BMSCs与n-HA/PA6多孔材料复合培养,MTT检测细胞增殖,ALP染色检测骨向分化。将BMSCs与n-HA/PA6复合物植入大鼠颅骨8 mm骨缺损处,4、8、16周时,应用组织学、扫描电镜观察植入物与骨组织交界处的成骨修复情况,并与单纯n-HA/PA6植入组修复效果进行比较。结果与n-HA/PA6复合培养的BMSCs生长良好,细胞增殖未受影响,ALP染色阳性。BMSCs复合n-HA/PA6植入4周时,有较多新骨长入支架孔穴;8周时,材料和宿主骨融为一体,接近正常骨;16周时,材料和天然骨形成骨性结合。单纯n-HA/PA6组植入4周时,新骨形成较少;8周时,新骨明显增加,但骨钙化程度较低;16周时,2组无明显差异。结论多孔n-HA/PA6支架材料对种子细胞BMSCs的增殖和骨向分化无影响;BMSCs作为种子细胞、n-HA/PA6多孔复合体作为支架材料构建组织工程化骨能够加速界面骨愈合,有效修复颅骨缺损,具有潜在的骨组织工程应用前景。     

兔颅骨缺损修复中对多孔块状β-磷酸三钙陶瓷可吸收性的定量研究

目的：通过多孔块状β磷酸三钙(β-TCP)对兔颅骨缺损的修复,定量测量其在体内的吸收速度。方法：24只家兔随机分为2,4,8,12周4个时间点组,每组6只动物,分别将β-TCP及羟基磷灰石(HA)样本种植在兔左右顶骨的缺损处,于术后2,4,8,12周取材,采用"数点法"计算各组材料的剩余量。结果：12周时β-TCP组材料剩余34．54％,材料吸收了40．01％。结论：多孔块状β-TCP陶瓷作为骨代用品,不失为一种较好的材料。     

HIF-1α促进BMSCs成骨及成血管作用的体内外研究

目的:运用基因工程技术,检测HIF-1α基因诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体内、外向成血管和成骨方向分化的作用.方法:(1) HIF-1α基因突变后,应用Lentivirus构建Lenti-LacZ、Lenti-WT、Lenti-MT.(2)分别用Lenti-LacZ、Lenti-WT及Lenti-MT转染BMSCs,检测①细胞转染效率;②目的基因在mRNA及蛋白水平的表达;③目的基因在BMSCs细胞内的定位.(3) BMSCs成功转染目的基因后,分别在特定时间点提取总RNA和蛋白,通过RT-PCR和Western印迹检测目的基因对BMSCs成血管和成骨因子表达的调控作用.(4)行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和钙结节的表达检测.(5)检测生物支架材料-明胶海绵(GS)的结构、形态及细胞附着情况.(6)建立F344大鼠颅骨双侧直径5mm的标准骨缺损模型,分别将细胞复合支架材料植入骨缺损区.术后8周取材,行Microfil灌注,观察血管形成,通过大体标本观察、X线及Micro-CT检查、组织学和形态学检测等观察骨修复情况,采用SPSS10.0软件包对结果进行单因素方差分析,评价修复效果.结果:当感染复数(MOI)=15时,BMSCs的转染效率最高.免疫荧光检测表明,目的基因在BMSCs细胞核内.体外常氧条件下,HIF-1α能够显著上调BMSCs的成骨和成血管因子的表达,且ALP和钙结节结果表明目的基因可诱导BMSCs骨向分化.体内实验结果显示,8周时,Lenti-WT组和Lenti-MT组对骨缺损的修复作用明显强于Lenti-LacZ组,而Lenti-MT组又优于Lenti-WT组.结论:HIF-1α基因可以显著提高BMSCs成血管和成骨活性.     

巨噬细胞在β-TCP支架修复牙槽突裂中成骨作用的探讨

目的： 评价使用3D打印β磷酸三钙（β-TCP）支架复合骨髓干细胞（bone marrow stem cell, BMSC）修复牙槽突裂的成骨效果以及巨噬细胞在成骨中的作用。方法： 将16只大鼠随机分为2组,将第1组8只大鼠双侧上颌第一磨牙拔除,形成4 mm×4 mm×3 mm的箱状骨缺损。8周后,一侧植入3D打印β-TCP复合干细胞支架,另一侧植入同样载有干细胞的空白支架。将第2组8只大鼠以相同方式造裂,两侧同时放置3D打印β-TCP复合干细胞支架,一侧注射氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞,另一侧注射对照脂质体。术后8周进行显微CT扫描和组织学分析,检测成骨效果。采用 SAS 8.0 软件包对数据进行统计学处理。结果： β-TCP支架移植侧BV/TV为(41.38±3.33)%,空白支架放置侧为(30.42±2.97)%,两者之间差异显著（P<0.05）。去除巨噬细胞后,BV/TV下降至(18.71±2.19)%,对照脂质体注射侧为(39.81±2.68)%,β-TCP支架放置侧和对照脂质体注射侧结果无统计学差异。结论： 3D打印β-TCP支架复合骨髓干细胞有较好的成骨效果,巨噬细胞在β-TCP介导成骨过程中起到重要作用,去除巨噬细胞阻碍新骨形成。     

骨形态发生蛋白-2与碱性成纤维细胞生长因子在异位和原位成骨中的作用

目的通过骨髓基质细胞（BMSCs）的体外增殖和分化、异位成骨和原位成骨实验来观察骨形态发生蛋白-2（BMP-2）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在成骨过程中的作用。方法分别用含BMP-2、bFGF和BMP-2+bFGF的培养液体外培养Beagle犬的BMSCs,通过甲基噻唑基四唑（MTT）比色法测定细胞增殖水平,通过测定碱性磷酸酶（ALP）活性观察细胞的分化情况。将BMSCs与多孔磷酸钙（CPC）分别在含BMP-2、bFGF和BMP-2+bFGF的培养液中复合培养,制成复合材料,一部分植入裸鼠皮下,观察异位成骨情况,另一部分植入Beagle犬的种植体周围骨缺损区,经过荧光标记观察原位成骨情况。结果含有BMP-2+bFGF的培养液促进BMSCs增殖和分化的能力最强。异位成骨情况：BMP-2+bFGF组的成骨量较其他组明显增加,其新骨形成百分比为48.79%±11.31%,高于单一BMP-2组（30.71%±10.85%）和bFGF组（27.33%±9.67%）以及对照组（10.65%±6.05%）。原位成骨术后12周,BMP-2+bFGF组的矿化沉积率高于其他组,其差异有统计学意义（P<0.01）。结论在促进成骨方面,BMP-2和bFGF共同作用优于单一因子。     

载辛伐他汀β-磷酸三钙支架复合脂肪干细胞修复兔颅骨缺损

目的：应用辛伐他汀(simvastatin)作用于脂肪干细胞,研究其对细胞生长、成骨、成血管分化的影响;利用β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)三维支架材料负载辛伐他汀,与脂肪干细胞复合,构建组织工程骨,用于兔颅骨缺损模型的修复。方法：原代培养兔脂肪干细胞(rabbit adipose-derived stem cells, rASCs),分别以含0、0.01、0.1和1 μmol/L辛伐他汀的培养液培养,计数法检测细胞数目;以0、0.05、0.1 μmol/L浓度辛伐他汀培养ASCs,1、7 d后,实时定量PCR检测成骨、成血管基因的表达(RUNX2、OPN、OCN、VEGF); 7 d后行ALP染色;14 d后行茜素红染色。12只新西兰大白兔颅顶双侧8 mm缺损,分别以4组材料修复(A: β-TCP,B: β-TCP/Cell,C: β-TCP/Sim,D: β-TCP/Cell/Sim),每组6例,植入8 周后取材,进行组织学观察。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果：0.05 μmol/L辛伐他汀对脂肪干细胞RUNX2、OCN、OPN和VEGF等成骨、成血管基因的表达具有明显促进作用,碱性磷酸酶染色和von Kossa染色更为明显;植入体内8周后,β-TCP/Cell/Sim组材料的成骨面积显著大于其他3组。结论：0.05 μmol/L辛伐他汀在体外对ASCs具有明显的促成骨作用,载辛伐他汀β-TCP复合脂肪干细胞可促进兔颅骨缺损的修复。     

P-15对β-TCP多孔材料修复兔下颌骨缺损的影响

目的本研究旨在探讨β-TCP(β-磷酸三钙)/P-15(P-15多肽)复合材料修复兔下颌骨骨缺损的能力。方法将β-TCP完全浸入到P-15多肽溶液中,制备出β-TCP/P-15多孔复合材料。在日本大耳白兔的下颌骨体部制备出骨缺损区,随机植入β-TCP/P-15(TP组)、β-TCP(T组)及空白对照组,在术后第4周、8周和12周分别处死动物,进行大体观察、组织学染色观察及成骨量(新生骨面积)的测定。结果随着时间的延长,三组骨缺损区的成骨量均增加,同一时间的不同组之间,以及同一组的不同时间段之间均有显著差异(P<0.001),TP组成骨量增加最快;各时间点TP组的成骨量均大于同一时间的对照组(P<0.001)。结论本实验中所用的β-TCP/P-15复合材料具有良好的骨诱导活性、降解性、生物相容性以及成骨性能,可促进骨缺损的修复,具有进一步的研究和临床应用价值。     

SDF-1α复合Pluronic F-127对兔上颌窦底提升术成骨影响的实验研究

目的 :通过制备基质细胞衍生因子(SDF1-α)的Pluronic F-127复合凝胶材料,观察这种复合材料在体外对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的矿化及成血管作用和复合凝胶材料在兔上颌窦外提升术中的成骨及成血管效果。方法:将兔骨髓间充质干细胞、50ng/ml SDF1-α和质量百分比浓度0.1%的Pluronic F-127复合培养,MTT法检测其细胞毒性,碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色。将18只新西兰大白兔双侧进行上颌窦外提升术,双侧植入不同的复合材料(共3种)并进行对照。材料分别为:β-磷酸三钙(β-TCP),生理盐水及SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶。于术后4、8、12周处死,X线片观察双侧上颌窦骨质形成情况,行HE染色、CD31+、CD34+、BMP-2及VEGF免疫组织化学染色观察成骨及成血管作用,并进行统计学分析。结果:体外实验采用MTT法证实了0.1%w/w Pluronic F-127无细胞毒性(P>0.05)。BMSCs-SDF1α复合凝胶碱性磷酸酶染色下,细胞质可见大量碱性磷酸酶染色沉淀,其余3组未见沉淀。BMSCs-SDF1α复合凝胶、BMSCs-单纯凝胶、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下均产生矿化结节,非成骨诱导组未见矿化结节形成。体内实验,X线片结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶及β-TCP充填侧均有阻射影,生理盐水组未见明显阻射影;HE染色结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶成骨效果与β-TCP成骨效果明显,生理盐水组未见骨质形成,统计学分析表明BMSCs-SDF1-α复合凝胶成血管作用较β-TCP及生理盐水组明显增加。结论:SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶能够成功诱导BMSCs分化为成骨细胞,无细胞毒性,在体外及兔上颌窦内成骨、成血管效果明显。     

hbFGF基因及hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物联合应用促进牙槽骨再生动物实验研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)基因及人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因修饰的组织工程化复合物联合应用对牙槽骨缺损再生的影响.方法 利用hbFGF基因转染Beagle犬牙龈成纤维细胞(GFs),并将其接种于脱细胞真皮基质(ADM)形成组织工程化复合物,同时以hBMP-7基因转染Beagle犬骨髓基质细胞(BMSCs),将其与胶原膜BME-10X复合,共同植入Beagle犬的人工牙周组织缺损区,通过组织学观察和测量分析,评价其对牙槽骨再生的影响.结果 术后6、12周,光镜下观察可见转染GFs复合ADM组和未转染GFs复合ADM组均较单纯BMSCs复合BME-10X组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质样组织生长;术后12周各组相对于术后6周的各组有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨质样组织.新生牙骨质与新生牙槽骨测量显示,转染hbFGF的GFs/ADM复合物的联合应用能显著提高hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物修复牙周组织缺损的程度.结论 转染bFGF的GFs/ADM复合物有助于促进hBMP-7基因修饰的组织工程化复合物对牙周组织缺损的修复.     

Shh修饰骨髓间充质干细胞与不同骨移植材料复合的体外观察

目的：研究两种不同骨移植材料对Shh基因修饰的骨髓间充质干细胞（MSCs）生长和增殖活性的影响。方法：差异贴壁法培养大鼠MSCs,携带音狸因子（Shh）腺相关病毒2型（rAAV2-Shh）转导MSCs,然后与两种不同的骨移植材料—聚D,L-乳酸/羟基磷灰石（PDLLA/HA）和β-磷酸三钙（β-TCP）体外复合。MTT法检测MSCs的增殖活性和黏附能力。扫描电镜观察MSCs在骨移植材料上的生长情况。结果：β-TCP组黏附和增殖活性均强于PDLLA/HA组（P〈0.05）。此结果在扫描电镜观察中得到同样的证实。结论：与PDLLA/HA比较,β-TCP具有更良好的生物相容性。     

bFGF真核表达载体的构建及骨髓基质细胞转染

目的：探讨bFGF基因转染骨髓基质干细胞的方法及可行性。方法：构建bFGF基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染骨髓基质细胞,通过免疫组织化学、RT-PCR及Western blot方法检测bFGF基因转染骨髓基质细胞的成功性。结果：bFGF基因成功转染大鼠骨髓基质细胞,并能持续稳定地分泌bFGF蛋白。结论：bFGF基因可以转染骨髓基质细胞,并能在骨髓基质细胞内稳定表达。