BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

BrdU标记胎兔骨髓间充质干细胞及对细胞生物学行为影响的体外研究

目的:通过用5-溴脱氧尿苷(5- bromodeoxyuridine,BrdU)标记胎兔骨髓间充质干细胞(bone marrow rnesenchymal stem cells,BMSCs),探讨BrdU作为干细胞标记示踪方法的可行性.方法:取胎兔骨髓组织密度梯度离心法分离培养BMSCs.取P3代细胞以终浓度分别为5,...     

兔骨髓间充质干细胞体外BrdU标记的实验研究

目的 探讨体外5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs) 的方法,探索BrdU体外标记兔MSCs的最佳时间和最佳浓度。方法 通过形态学及流式细胞术鉴定全骨髓培养法分离培养的细胞为MSCs。MSCs经不同BrdU浓度标记及不同BrdU标记时间, 免疫细胞化学法鉴定并评估。结果 全骨髓培养法培养的MSCs经流式细胞术检测,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU标记的阳性细胞率随标记时间延长以及标记物BrdU的浓度增加而逐渐增高, 40μmol/L及72h标记阳性率达85-95%。结论 应用BrdU体外标记MSCs是安全可靠的,兔MSCs体外BrdU标记最佳时间和最佳浓度分别为72h和40μmol/L。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率〉95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性

目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞体外分化特性.方法:用密度为1.073 kg/L的细胞分离液分离骨髓间充质干细胞.取第3代培养细胞用含0.1 μmoL/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的成骨细胞分化培养液培养.于培养7,14 d取细胞爬片做改良的Gomori钙钴法碱性磷酸酶染色,21 d做Von Kassa染色;脂肪细胞分化培养用含10 mg/L胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.25 mmol/L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤和100 μmol/L吲哚美辛的培养液诱导培养,于诱导3,7 d取细胞爬片做油红0染色.用含1mmol/L β-巯基乙醇和150 mL/L FBS的DMEM培养基先预诱导分化24 h.再用含有5 mmol/L β-巯基乙醇的DMEM无血清培养基诱导分化5 h.做神经元特异性烯醇化酶、角质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白免疫组化染色.结果:在加入成骨细胞分化培养液后7和14 d钙钴法碱性磷酸酶染色阳性细胞百分率分别为11.5%和37.5%.21 d的细胞爬片Von Kassa染色显示钙盐沉积.在脂肪细胞诱导3和7 d分别得到22%和90.33%油红O染色阳性细胞.5 h神经细胞诱导分化后NSE免疫组化染色阳性率为33%,NF-200阳性细胞率为37.5%,GFAP染色阴性.结论:骨髓间充质干细胞在体外可定向加药诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记

目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stemcells,MSCs）的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法（直接贴壁法）分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105这4种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU）体外标记兔MSCs,检测其标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7～8d MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4～8d为高速生长期,MSCs在第3～5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD105（＋）,证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85%～90%。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

大鼠骨髓间质干细胞的BrdU体外标记和体内示踪研究

目的探讨骨髓间质干细胞(BMSCs)的体外标记和体内示踪技术。方法分离培养并鉴定大鼠BMSCs,进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记后,体外培养被标记的BMSCs,观察其连续传代后的BrdU可标记时间和标记效率;建立大鼠胃黏膜损伤模型,将分离纯化的BrdU标记BMSCs移植到损伤的胃黏膜下,体内观察BrdU对活体移植BMSCs的示踪作用。结果免疫组化显示体外培养大鼠BMSCs的CD44、CD90表达阳性,CD14、CD45表达阴性,显微结构表现出干细胞特征。进行BrdU标记后,标记阳性率随标记时间延长而增高,48h达高峰,72h仍维持高阳性率。终浓度为10μmol/L的BrdU孵育48h、72h阳性标记率高于5μmol/L BrdU组(P<0.05),但与15μmol/L BrdU组阳性标记率差异无统计学意义(P>0.05),并且连续传代培养21d后也可检测到。BrdU可示踪BMSCs在损伤的胃黏膜下局部定植。结论 BrdU在浓度为10μmol/L、标记时间48h至72h标记效率较高;BrdU标记可用于一定时间段内BMSCs移植入体内后定植和生长的动态示踪观察方法。     

骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的可能机制研究

在心肌梗死的实验探索与临床研究方面,学者已发现骨髓间充质干细胞移植对治疗心肌梗死具有显著的作用。骨髓间充质干细胞的增殖能力强,分化范围广,能修复损伤的功能组织,通过移植来帮助心肌细胞再生,能有效改善患者的心肌功能。国内外学者已成功进行干细胞移植治疗心肌梗死的动物实验和医学临床试验,取得了可喜的效果。     

全骨髓贴壁改良法分离培养人骨髓间充质干细胞及标记鉴定

目的对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的方法,探讨hMSCs鉴定和标记的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法采集成人健康志愿者骨髓5mL,全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增,获得hMSCs,对比三种方法。＂慢冻速融＂的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）标记,免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得,比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示：CD44阳性及CD71弱阳性,表达率分别为95.05%,78.86%;CD34、CD45阴性,表达率分别为3.40%,2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增,Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库,为组织工程、细胞移植研究打好基础。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外的诱导分化及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性. 方法:利用密度为1.073 kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞,体外培养与扩增MSCs;取生长良好的第3代细胞,用成骨细胞分化培养液培养21 d,Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶(AKP)组化染色;分别以浓度为5,10和15 μmol/L的Brdu溶液标记MSCs,孵育12,24,48,72和96 h后免疫组化检测Brdu,确定最佳标记量和最佳标记时间. 结果:诱导分化第21日, AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性. 10 μmol/L Brdu标记MSCs的效果最好,随着孵育时间的延长,Brdu标记率逐渐增高,标记72 h后标记率在90%以上. 结论:MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞,用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10 μmol/L,最佳时间是72 h.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养的适宜条件。方法:采用密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠骨髓MSCs,观察其形态,流式细胞仪检测细胞表面标记,MTT法观察不同浓度的胎牛血清(FBS)对MSCs生长曲线的影响及不同代MSCs的生长曲线和细胞贴壁率。结果:大鼠MSCs呈梭形或纺锤形,CD34、CD45表达阴性,CD44表达71.5%、CD166表达83.2%;MSCs用10%的FBS培养,其增殖明显高于用无血清、5%及20%的FBS培养;第1、3、5、10代MSCs的生长曲线及细胞贴壁率无明显差异(P>0.05)。结论:密度梯度离心法结合贴壁分离法适于大鼠MSCs的分离;10%的FBS适合MSCs的培养;早期传代对MSCs的增殖无影响。     

人骨髓间充质干细胞体外培养及生物特性的观察

目的：观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养的生物学特性和作为组织工程的种子细胞的可能性。方法：将人骨髓MSCs自骨髓中分离、纯化和培养，观察原代和传代培养的增殖及生长特征。结果：原代培养及传代培养显示，在体外培养条件下人骨髓MSCS有活跃的增殖能力。结论：体外获得的人骨髓MSCs的生物年龄较为年轻，可以为组织工程的进一步研究提供种子细胞。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向血管内皮细胞分化

目的研究人骨髓间充质干细胞(BDMSC)向血管内皮细胞的诱导分化,为复杂器官组织工程血管化及细胞移植修复损伤组织提供理想的细胞来源.方法以血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子对种植于纤维蛋白凝胶及基底膜基质中的BDMSC进行三维立体诱导培养,在培养后不同时间分别进行形态观察、组织切片和CD34、CD31、血管内皮生长因子受体-1(VEGFR-1,Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1)、vWF的免疫组织化学荧光染色.结果诱导后的人BDMSC阳性表达血管内皮细胞特有表面标志CD34、CD31、Flt-1、Flk-1、vWF,并生成内皮样细胞,形成血管样结构.结论血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及诱导后表达的Flt-1、Flk-1等表面分子可能在BDMSC向血管内皮细胞分化、并形成血管样结构的过程中提供适宜的微环境并起重要作用,这为间充质干细胞在组织工程血管化及细胞移植修复损伤中的应用提供了理论与技术上的支持.     

成人骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞

目的：建立成人骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养的方法,并探讨定向诱导分化为成骨细胞的途径．方法：抽取成人骨髓,Percoll密度梯度离心法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C,培养15d后,在倒置显微镜观察细胞形态,钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达,免疫组化(SABC法)检测Ⅰ型胶原、骨钙素表达,茜素红染色检测钙结节形成．结果：Percoll密度梯度离心法培养可获得均一的MSCs;诱导分化的MSCs呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性率可达81％以上;Ⅰ型胶原、骨钙素表达阳性;茜素红染色见钙结节形成．结论：可以从成人骨髓中培养出MSCs,并可定向诱导分化为成骨细胞,可用作临床骨组织工程种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

In vitro cartilage production using an extracellular matrix-derived scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Cartilage repair is a challenging research area because of the limited healing capacity of adult articular cartilage.We had previously developed a natural,human cartilage extracellular matrix （ECM）-derived scaffold for in vivo cartilage tissue engineering in nude mice.However,before these scaffolds can be used in clinical applications in vivo,the in vitro effects should be further explored.Methods We produced cartilage in vitro using a natural cartilage ECM-derived scaffold.The scaffolds were fabricated by combining a decellularization procedure with a freeze-drying technique and were characterized by scanning electron microscopy （SEM）,micro-computed tomography （micro-CT）,histological staining,cytotoxicity assay,biochemical and biomechanical analysis.After being chondrogenically induced,the induction results of BMSCs were analyzed by histology and Immunohisto-chemistry.The attachment and viability assessment of the cells on scaffolds were analyzed using SEM and LIVE/DEAD staining.Cell-scaffold constructs cultured in vitro for 1 week and 3 weeks were analyzed using histological and immunohistochemical methods.Results SEM and micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure.The majority of the cartilage ECM was found in the scaffold following the removal of cellular debris,and stained positive for safranin O and collagen Ⅱ.Viability staining indicated no cytotoxic effects of the scaffold.Biochemical analysis showed that collagen content was （708.2±44.7）μg/mg,with GAG （254.7±25.9） μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli （E） were （1.226±0.288） and （0.052±0.007） MPa in dry and wet conditions,respectively.Isolated canine bone marrow-derived stem cells （BMSCs） were induced down a chondrogenic pathway,labeled with PKH26,and seeded onto the scaffold.Immunofluorescent staining of the cell-scaffold constructs indicated that chondrocyte-like cells were derived from seeded BMSCs and excreted ECM.The cell-scaffold constructs contained pink,smooth and translucent cartilage-like tissue after 3 weeks of culture.We observed evenly distributed cartilage ECM proteoglycans and collagen type Ⅱ around seeded BMSCs on the surface and inside the pores throughout the scaffold.Conclusion This study stuggests that a cartilage ECM scaffold holds much promise for in vitro cartilage tissue engineering.