人工材料作为细胞体外培养载体的观察实验研究

目的：在体外培养的条件下了解人工材料与细胞的相容性以及细胞在材料上的生长情况。方法：将冻存复苏后的传代细胞在碳纤维、头发、涤纶、几丁质四种材料联合培养，进行光镜、扫描电镜观察。结果：在Ｆ－１２培养基中，碳纤维与成纤维细胞、肌腱细胞相容性均好，有良好的吸附性；眷属材料次之；涤纶材料上两种细胞生长均少，可能与其表面结构有关；几丁质则明显抑制这两种细胞生长。同时发现两种细胞在碳纤维上坐落的数量都明显优于     

猪去抗原半月板体外降解的实验研究

目的 研究猪去抗原半月板在体外的降解规律，以进一步调整其合适降解速度。方法选用4～6月龄健康小型猪5只，取其双膝关节半月板。一部分采用环氧化物进行去抗原处理，制备成去抗原半月板；另一部分不作任何处理，为新鲜半月板。将两种半月板冻干处理后，置于含胶原酶、木瓜蛋白酶、透明质酸酶和胰酶的PBS液中，于37C酶解3、7、15、30d。另取两种半月板在PBS液37℃下水解30d。采用失重法、紫外光谱分析及扫描电镜测定其降解特性，并测定两种半月板的亲水性。结果两种半月板于4种酶中的酶解效果显著，其中以胰酶最明显，但去抗原半月板酶解程度低于新鲜半月板。新鲜半月板及去抗原半月板水解率分别为0．76％、0．81％。两种半月板在4种酶的降解液中紫外吸收值范围大致相同，为200～300nm。扫描电镜观察，去抗原半月板的空间结构改变不及新鲜半月板明显。去抗原半月板的亲水性较新鲜半月板稍低：吸水率为157％、188％；保水率为152％、167％。结论去抗原半月板降解较新鲜半月板慢，为调整去抗原半月板在体内降解速度提供依据。     

去细胞猪主动脉瓣膜基质支架材料体外降解的初步观察

目的 观察去细胞猪主动脉瓣膜基质支架材料的体外降解方式和过程。方法 将制备好的去细胞猪主动脉瓣膜基质支架材料90片随机分为3组，胶原酶组、弹性蛋白酶组和水解对照组，每组30片，分别用0．05mg／ml胶原酶Ⅰ、0．05mg／ml弹性蛋白酶和磷酸盐缓冲液（PBS）作为降解液在体外处理去细胞猪主动脉瓣膜。于处理后第3、6、9、12、15和30d从每组取出5个平行样本观察瓣膜组织形态学改变，测定降解失重率、降解液中蛋白含量、羟脯氨酸含量等指标。结果 胶原酶组和弹性蛋白酶组去细胞瓣膜基质支架材料均随降解时间延长逐渐变得菲薄、韧性差、组织疏松、纤维网孔变大、断裂，降解液外观变浑浊，瓣膜失重率增加，降解液蛋白含量和羟脯氨酸含量增加（P〈0．01）；胶原酶组较弹性蛋白酶组对去细胞猪主动脉瓣膜基质支架材料的降解作用强。结论 胶原酶和弹性蛋白酶对去细胞猪主动脉瓣膜基质支架材料均有降解作用，且前者的降解作用强于后者。     

人工生物胰的体外分泌功能研究

目的 探讨海藻酸钠-氯化钡微囊对成人胰岛细胞体外分泌功能的影响.方法 对6例成人胰腺组织称重后采用V型胶原酶消化法分离,采用Ficoll间断密度梯度离心纯化法纯化,采用DTZ染色显微镜下评价胰岛细胞的数量、纯度.采用海藻酸钠氯化钡为材料包裹成人胰岛,体外培养及放射免疫法测定培养液中基础胰岛素浓度.结果 成人胰腺经胶原酶消化分离后,胰岛平均收获量(3600±447)个胰岛/g胰腺;Ficoll间断密度梯度离心纯化后,每克胰腺组织平均收获量(2140±207)个胰岛,纯度大于70％;成人胰岛细胞培养2、4、6d后,微囊化组第2、4、6天的基础胰岛素平均浓度(每100个胰岛单位mU/L)分别为3.302±1.63、3.504±1.10、2.921±1.13,未微囊化组的基础胰岛素平均浓度(每100个胰岛单位mU/L)分别为3.814±1.49、4.175±1.60、3.617±1.34,两组基础胰岛素浓度差异无统计学意义(P＞0.05).结论 人工生物胰具有良好的体外分泌功能,包裹成人胰岛的海藻酸钠-氯化钡微囊对胰岛体外分泌胰岛素的功能无影响.     

丝状支架韧带材料机械强度和体外降解性研究

膝关节交叉韧带断裂是发生率较高且严重的运动创伤，由于交叉韧带自身愈合能力差，人们很早就放弃了单纯缝合修复的方法，而多使用移植物重建。本实验旨在通过观察丝状支架的机械强度和体外降解性，探讨其临床应用的可行性及其影响因素。     

复合壳多糖人工皮肤修复家兔全层皮肤缺损的实验研究

目的　探讨复合壳多糖人工皮肤在修复新西兰家兔全层皮肤缺损中的作用。　方法　在无菌条件下将成纤维细胞与复方真皮基质凝胶混合制成真皮替代物 ,然后接种角质形成细胞 ,培养1周后升至液面 ,继续培养 1～ 2周 ,形成人工皮肤。将复合壳多糖人工皮肤移植于家兔的全层皮肤缺损处 ,观察家兔反应 ,定期活检 ,作组织病理检查。　结果　所有家兔创面愈合良好 ,无一例出现移植物下积脓、出血和感染 ,没有明显的免疫排斥反应 ,能长期覆盖创面 ,且具有较好的弹性和抗撕拉性 ,便于操作。　结论　复合壳多糖人工皮肤是一种操作简便的具有良好的组织相容性的生物活性敷料。     

胶原基人工皮肤的研究进展

组织工程人工皮肤的出现为救治大面积皮肤缺损病人提供了一种有效的新方法。人工皮肤按照常见的分类方法可分为:人工表皮替代物、人工真皮替代物及人工复合皮替代物。胶原作为脊椎动物细胞外基质中含量最为丰富的生物大分子,具有极重要的生理作用,能够促进细胞黏附、生长、增殖、分化、迁徙。作为研究最早、了解最为透彻的一种重要的支架材料,胶原被广泛用于人工皮肤。文中介绍了近年来国内外胶原基人工皮肤的研制情况。     

体外构建皮肤基底膜的组织学特征

目的观察制备的组织工程皮肤基底膜的组织学特征。方法取门诊正常儿童包皮环切术之包皮，采用胰蛋白酶胶原酶顺序消化得到角质形成细胞（KC）和成纤维细胞（Fb）悬液。制备复方壳多糖组织工程皮肤，浸没培养3d后，继续行气液界面培养。将培养7、10、15d的复方壳多糖组织工程皮肤用中性甲醛溶液固定后石蜡包埋、切片，行HE及高碘酸-雪夫（PAS）染色，并用免疫组织化学染色法观察基底膜的重要成分：Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原及层黏连蛋白（LN）的存在情况。结果HE染色可见培养的组织工程皮肤表皮结构分化良好，大致可分为基底层、棘层和角质层，各层均有数量不等的扁平梭形细胞。PAS染色显示真皮表皮间有一均匀红染的条带。免疫组织化学染色结果显示，Ⅳ型胶原、Ⅶ型胶原及LN呈阳性表达。结论复方壳多糖组织工程皮肤基底膜构建良好。     

复合型组织工程皮肤的体外快速构建

目的寻找一种体外快速构建复合型组织工程皮肤的方法,为大面积烧伤、创伤创面的覆盖提供足够的自体皮源。方法取人的包皮,进行表皮细胞及成纤维细胞的分离鉴定及体外培养扩增,对表皮细胞群行广谱角蛋白抗体-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、角蛋白19（cytokeratin19,K19）-FITC免疫荧光染色及K19流式细胞仪鉴定;对成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光鉴定。将表皮细胞接种于异体脱细胞真皮（acellular dermalmatrix,ADM）乳头面,于气-液平面培养构建表皮层,实验分两组进行,实验组培养基中添加25ng/ml角化细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）,对照组不添加。6d后,接种成纤维细胞于两组ADM的另一面,继续培养24h。收集构建的组织工程皮肤,切片行苏木素-伊红染色,观察所构建皮肤的镜下结构,并对比添加KGF对其影响。结果免疫荧光染色培养扩增的表皮细胞群广谱角蛋白抗体-FITC染色均为阳性、K19-FITC染色部分阳性,流式细胞仪鉴定其中K19阳性表达的细胞接近17%。成纤维细胞体外培养7d可扩增超过100倍,波形蛋白-FITC免疫荧光染色呈阳性。经过7d的体外培养构建,可以得到复合型皮肤,经苏木素-伊红染色镜下观察显示,实验组表皮层连续,形成细胞层数2-3层的复层结构,真皮中含有成纤维细胞;对照组表皮层不连续,细胞层数少,两组比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论利用胶原酶结合胰蛋白酶消化法进行种子细胞的分离,应用添加KGF的条件培养基,采用分步接种构建的方法,可在7d内构建出复合型组织工程皮肤。     

兔肌腱细胞和成纤维细胞与人工材料体外联合培养的形态学观察

在兔肌腱细胞、成纤维细胞分离培养的基础上，将冻存复苏的传代细胞与碳纤维、涤纶及几丁质三种材料体外联合培养，观察细胞与材料的相容性以及细胞在材料上的生长情况，比较这两种细胞在三种材料上的生长差异。结果发现，在体外培养条件下，碳纤维与两种细胞的相容性均好，有良好的吸附性；涤纶材料上两种细胞生长均少，可能与其表面结构有关；几丁质明显抑制这两种细胞生长。同时发现，无论肌腱细胞，还是成纤维细胞，在碳纤维上座落的数量都明显优于涤纶、几丁质。三种材料交错在一起时，胶原纤维方向是以碳纤维为轴，形成网状，交织缠绕在材料之间。随时间延长，细胞在单根碳纤维或多根碳纤维上排列均匀，包绕碳纤维，且相互衔接。研究结果，为进一步研究有生命的人工肌腱、韧带提供了依据。     

壳多糖-胶原-糖胺聚糖凝胶人工皮肤的初步研究

目的 研制一种新型的胶原凝胶类人工皮肤。方法 制备壳多糖—胶原—糖胺聚糖(GAGs)—成纤维细胞真皮替代物(DE)，观察成纤维细胞(FB)在凝胶中的生长情况和不同因素对凝胶收缩的影响，并绘制FB生长曲线和凝胶收缩曲线。了解不同含量壳多糖对FB和角质形成细胞(KC)生长的影响，不同含量壳多糖DE的抗感染能力。再于“成熟。的DE表面接种KC，先浸没培养，后行气液界面培养，构建完整的人工皮肤。对DE和人工皮肤行组织学和电镜分析。结果 DE收缩度与FB数量呈正比，终末收缩度与胶原蛋白浓度成反比；FB在凝胶中2—9天呈指数增生。DE基质配方对FB的生长无明显抑制作用，但可促进KC的生长，对金黄色葡萄球菌的抑制作用随壳多糖的含量增大而增强。扫描电镜示DE有丰富的微孔结构。人工皮肤组织学观察见类似于正常皮肤，有分化良好的表皮和致密的真皮。结论 壳多糖—胶原—GAGs胶原凝胶人工皮肤是一种新型、有一定抗感染能力的活人工皮肤。     

外源性胶原对人工活性肌腱影响的体外形态学观察

目的探讨外源性胶原在人工活性肌腱的构建中对细胞功能的影响. 方法将人发、碳纤维(carbon fiber, CF)及聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)3种材料复合外源性胶原(实验组)及不复合外源性胶原(对照组),与密度为3×106/mm3的转化人胚腱细胞进行体外联合培养,于培养后2小时、3天和5天3个时间点行倒置显微镜观察,以及培养5天行扫描电镜观察细胞数量及形态. 结果有胶原复合的实验组人工活性肌腱培养2小时后,细胞向材料周围聚集,附着于材料的部分细胞呈圆形;3天时附着的细胞增多,细胞与材料相容性好,细胞密度大.而无胶原复合的对照组3种材料上细胞附着较少.5天后实验组细胞形态由圆形→椭圆形→梭形演变,对照组细胞形态大部分仍为圆形及椭圆形,细胞数量仍少于实验组. 结论外源性胶原有助于细胞对材料的附着以及细胞自身的增殖.     

利用不同支架材料构建人工真皮的研究

目的 探讨脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶的不同支架材料上构建人工真皮的可行性。方法 采用酶消化法分离幼儿包皮成纤维细胞，并进行传代培养；将第3代成纤维细胞种植于三种不同支架上，14天后利用HE染色、透射电镜和扫描电镜对构建的人工真皮结构进行鉴定。结果 ①酶消化法得到皮肤成纤维细胞，可在含有10％小牛血清的DMEM中传代培养；②成纤维细胞在三种不同支架上形成单层细胞，并可向胶原膜和胶原凝胶内部生长；③成纤维细胞在胶原膜和脱细胞基质内增殖不如胶原凝胶内活跃，但人工真皮收缩不明显，而胶原凝胶构建的人工真皮收缩明显。结论 利用脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶支架材料构建的人工真皮具有较好的组织结构，是一种较理想的皮肤替代物，可作为移植物进行深入研究。     

纳米仿生组织工程血管兔腹主动脉置换术后体内演化的实验研究

目的 兔自体种子细胞构建的纳米仿生组织工程血管(nano-biomimetie tissue engineered bloodvessel,NBTEBV)移植置换兔腹主动脉,观察NBTEBV在兔体内降解和重塑演化过程,检测NBTEBV的组织相容性. 方法 6月龄新西兰大白兔20只,雌雄不限,体重2～3 kg.取兔自体种了细胞体外构建NBTEBV.取新两兰大白兔,游离.肾下腹主动脉结扎其分支,剪下长约10mm腹主动脉,采用同体种子细胞来源的NBTEBV置换兔腹主动脉,吻合口置钛夹标记.观察NBTEBV在兔体内降解及重塑演化过程:术后第12周行DSA检查及彩色多普勒检查;术后第1、4、12周,取移植血管行大体及组织学观察,并行移植血管14C标记的PLGA X射线电子能谱检测. 结果 17只兔移植NBTEBV在观察期内保持通畅,3只兔分别于术后36、72 h死于移植段腹主动脉闭寒.术后第12周DSA检查示移植血管显影良好,彩色多普勒检查示移植血管通畅,血流为层流,血流速度末见异常,无血管扩张.术后第1周移植血管腔被覆单层内皮细胞,管壁平滑肌细胞分布层次欠清晰,周围较多仿ECM夹杂未降解的黑色PLGA;术后第4周管壁平滑肌细胞分层,ECM开始形成,仿ECM成分部分降解,PLGA含量明显减少,颜色减淡;术后第12周管壁分层更清晰,ECM已形成,仿ECM成分完全降解,几乎无PLGA,血管形态近似自体血管.14C标记的PLGA射线电子能谱检测示14C能量峰值逐周递减. 结论 构建的NBTEBV有较好的手术操作性,同体移植术后具备良好组织相容性,在动物体内的自然重塑演化过程符合组织工程技术要求,电纺构建NBTEBV是可行的.     

成人骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的研究

目的研究成人骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）体外分化为血管内皮细胞的能力并探讨其诱导条件。方法分离成人骨髓单个核细胞，经贴壁法获取MSCs。所获细胞分4组进行诱导：组1、2以5×10^3／cm^2细胞密度接分别接种于含2％和15％胎牛血清的L—DMEM培养基；组3、4以5×10^4／cm^2细胞密度分别接种于上述两种血清浓度的培养基，各组细胞经血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）辅以牛脑提取物的诱导，对照组为正常传代培养的MSCs。在诱导的第14、21天分别测定表面分子CD34、VEGFR-2、CD31和Ⅶ因子相关抗原（factor Ⅷ—related antigen，又称von Willebrand factor，vWF）以及体外成血管实验对分化细胞进行鉴定，同时测定不同诱导条件下的细胞增殖指数（proliferation index，PI）。结果组3细胞经诱导后，内皮系表面分子CD34、VEGFR-2、CD31、vWF于第14天均有不同程度表达，分别为8．5％、12．0％、40．0％、30．0％．其中CD34、VEGFR-2在第21天表达上调，为15．5％、20．0％，余各诱导组细胞未表达上述表面分子；诱导后的组3细胞呈低增殖状态（PI值约为10．4％），在半固体培养基中还可形成血管腔样结构。结论从成人骨髓中分离培养的MSCs，在较高细胞接种密度和低增殖状态下，经VEGF、牛脑垂体提取物诱导后，可分化为血管内皮细胞，可作为治疗性血管生成及组织工程理想的种子细胞。     

壳多糖基质网架复层组织工程皮肤的移植研究

目的 探讨组织工程皮肤动物移植实验的效果。方法 应用以壳多糖为基质网架构建的组织工程化复层人工皮肤，对裸鼠大面积(直径20mm)全层皮肤缺损模型进行移植修复。24只8周龄裸鼠分为组织工程皮肤移植(AS)组、壳多糖膜覆盖物(CH)组及对照组，术后进行大体观察，并在3、7、14和21天应用组织学、红外热像扫描分析等手段对修复组织进行动态监泅。结果 AS组在移植第3天，组织工程皮肤与自体皮肤能够很好地融合，有少量毛细血管长入移植物，皮肤移植钧颜色与自体皮肤颜色接近；随着时间的延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，表皮层清晰可见基底层、棘细胞层、颗粒层和角质层，角化征象加强，有角化物脱落；真皮层细胞数量增多，网架逐渐降解，分泌的细胞外基质成分增多；第14天，创面基本愈合，修复区皮肤颜色与正常皮肤颜色非常接近，短痕小，无需进行二次植皮。CH组至移植第14天，结痂未完全脱落，创面未愈合，颜色较AS组深；第21天创面愈合，遗留较大短痕，与正常皮肤区分明显，而对照组的结痴脱落，创面大而深，颜色深红。结论 以壳多糖为基质网架构建的组织工程化皮肤具有良好的组织相容性，可应用于皮肤缺损的移植修复。     

人胚腱细胞体外培养及生物学特性研究

应用显微外科手术剥除人胚肌腱外膜组织外，经过胰蛋白酶及胶原酶分步消化分离出人胚腱细胞，使用含２０％新生小牛血清的Ｆ－１２培养液将其传代培养１５代后全部冻存。该细胞贴壁生长，具有接触抑制的性质。细胞群体倍增时间大致为４天与细胞有丝分裂高峰时间相符。在传代培养过程中探索了体外培养的腱细胞生长的最适宜条件。通过冻存后复苏的细胞继续培养发现，冻存对其生长、形态、遗传学等特征无明显影响。本研究测定了培养细胞