大鼠GAD65重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建大鼠GAD65重组腺病毒载体。方法将目的基因大鼠GAD65 cDNA亚克隆到穿梭质粒pShutile启动子CMV的下游,再通过I-CeuⅠ和PI-SceⅠ两个稀有酶切位点,将目的基因GAD65与腺病毒质粒DNA(pAdeno-X)进行体外连接,获得含目的基因GAD65重组腺病毒质粒DNA,后者经限制性内切酶PaeⅠ切割后,两端露出反向末端重复序列(rTR),利用脂质体转染293细胞,获得含目的基因重组腺病毒上清。PCR双引物检测含有目的基因GAD65的片段。结果在挑选的5个空斑中,有4个含GAD65 cDNA阳性重组腺病毒。GAD65重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效的复制。PCR双引物检测证明含有目的基因GAD65片段,表明利用体外连接法成功构建了含目的基因GAD65重组腺病毒转移载体。结论成功构建了GAD65重组腺病毒,为进一步研究GAD65重组腺病毒的功能提供了条件。     

腺病毒重组疫苗载体构建的研究进展

腺病毒(Ad)基因组E_1、E_3、以及E_4区和右侧端插入性末端重复(ITR)之间的区段,均存在外源基因插入位点。本文论述了外源保护性免疫原基因插入Ad基因组上述不同位点构建各类重组疫苗载体的研究进展。     

腺病毒载体构建原理与方法的研究进展

由于腺病毒 (Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ,Ａｄ)载体在哺乳动物及其多种细胞上进行基因转移和蛋白表达的高效性 ,使其在基因疫苗及基因治疗的研究中受到人们的青睐 ,成为当今使用最多的病毒载体之一。为了取得更满意的效果 ,人们在腺病毒载体构建与改进方面 ,做了大量工作。本文谨就近年来腺病毒载体构建原理与方法的研究进展扼要综述如下。1　腺病毒载体的构建原理腺病毒的基因组为线形双链ＤＮＡ ,长度约为 36ｋｂ ,被包装在一个二十面体的蛋白质外壳内 ,可分为编码区和非编码区。编码区又可分为早期转录区和晚期转录区两种 ,前者有Ｅ1、Ｅ2、…     

构建重组腺病毒的新策略

重组腺病毒作为基因载体具有很多优越性，因此极大地引发了人们的研究兴趣．构建第一代和第二代腺病毒的方法各式各样，大体上可分为两类：一类是DNA直接在哺乳动物细胞内进行重组，另一类是先在细菌中构建好病毒DNA再转染哺乳动物细胞．而第三代腺病毒因缺失了大部分的病毒基因，构建时需要辅助病毒．几年前，腺病毒的构建还是一项耗时费力的工作，现在已经有了许多优化构建过程的新策略。     

大鼠GLUT1基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

目的:构建携带大鼠葡萄糖转运体1基因（GLUT1）的复制缺陷型重组腺病毒载体，为进一步研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡机制奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法获取大鼠GLUT1基因全长cDNA，将其克隆至穿梭质粒pShuttle中构建穿梭质粒pShuttle-Glut1，经酶切后与线性化的腺病毒骨架质粒pAdeno-X体外连接并转化大肠杆菌DH5α，构建重组腺病毒质粒pAd-Glut1，酶切线性化重组腺病毒质粒后转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒，重组腺病毒在HEK293细胞中反复扩增数代后，分别用聚合酶链反应（PCR）及免疫印迹法（Western blotting）从基因和蛋白表达水平鉴定重组的腺病毒。结果:经PCR分析及DNA测序显示GLUT1 cDNA序列正确；筛选出重组腺病毒质粒pAd-Glut1后在HEK293细胞中成功包装出重组病毒，包装后冻融细胞行PCR及Western blotting检测表明重组腺病毒包装成功。结论:成功扩增了大鼠GLUT1基因并构建了携带大鼠GLUT1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体，这有助于研究脑缺血缺氧引起的神经元死亡的机制。     

趋化因子受体4基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：目前研究发现,基质细胞衍生因子1/趋化因子受体4轴具有介导骨髓间充质干细胞定向迁移的作用。 目的：构建小鼠趋化因子受体4基因重组腺病毒载体。 方法：从C57BL/6小鼠中提取总RNA,以RT-PCR方法获得小鼠趋化因子受体4基因全长1 080 bp的完整编码序列,通过穿梭质粒pAdTrack-CMV,将目的片段克隆入AdEasy-1腺病毒DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转染293细胞,经包装扩增后,获得重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4,并感染293细胞,PCR鉴定、Western blot检测蛋白表达。 结果与结论：含趋化因子受体4基因的重组腺病毒pAdTrack-CMV-CXCR4构建成功,经PCR鉴定鉴定重组病毒中含有趋化因子受体4cDNA全长,经序列测定表明趋化因子受体4cDNA序列正确无丢失和错配现象,病毒滴度高,Western blot检测感染后293细胞趋化因子受体4的蛋白表达较未感染293细胞明显增加。     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染HEK293T细胞包装病毒。荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达。结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400bp插入片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×108pfu/mL;重组病毒感染后,HEK293T细胞中IL-16 mRNA和蛋白质均有表达。结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础。     

快速构建腺病毒载体的新方法

近年来,随着腺病毒载体广泛应用于实验性基因治疗等生物学研究领域,构建重组腺病毒的方法也有了很大改进,本文主要介绍两种快速构建人腺病毒载体的新方法：1．用DNA-末端蛋白质复合物构建重组腺病毒。2在大肠杆菌细胞内而非真核细胞内完成通过同源重组产生重组腺病毒核酸的过程。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的 构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具.方法 人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western 印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化.结果 成功构建了MKRN1的siRNA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性.结论 构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具.     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。     

编码HIV-1 Pr42~(gag)的杆状病毒转移载体的构建及鉴定

本文作者采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ），从ＨＩＶ－１ｃＤＮＡ克隆ＢＨ１０中扩增出Ｐｒ４２ｇａｇ的基因片段，经适当的限制性内切酶消化后插入到杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ９中，使其处于多角蛋白启动子的控制之下，构成重组转移载体ｐＢａｃＧＡＧ４２。酶切鉴定结果与预期的一致。再用载体上多克隆位点两翼的引物对连接处进行序列分析，结果表明外源基因处于多角蛋白启动子的控制下，且成功地引入了起始码和终止码。     

Septin8红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的septin8红色荧光蛋白融合表达载体（pmCherry—C2／septin8）,并观察其在细胞内的表达和定位情况。方法采用PCR的方法从人脑胶质细胞瘤eDNA文库中扩增获得septin8基因编码区序列,将其克隆至红色荧光蛋白载体pmCherry—C2上,重组质粒经PCR、酶切以及序列分析正确无误后转染NIH3T3细胞,并利用Westernblotting和细胞免疫化学技术分析重组蛋白在细胞内的表达和定位。结果重组pmCherry—C2／septin8融合蛋白在NIH3T3细胞中得到高量表达且主要分布于细胞浆。结论成功构建了pmCherry—C2／septin8融合表达载体,该载体能在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究septin8细胞内生物学功能打下了良好的基础。     

含人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1重组腺病毒的构建与体外表达

从人肝癌组织中提取总RNA，RT—PCR合成hTIMP-1的全长cDNA，克隆到腺病毒载体AdEasy系统的穿梭质粒pAdTraek—CMV上，与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183受体菌中进行同源重组，成功构建含hTIMP-1全长eDNA的重组腺病毒载体，经293细胞的包装、扩增，生成含hTIMP-1基因的重组腺病毒AdhTIMP-1并实现体外表达，为进一步研究肝癌浸润和转移机理以及肝癌的基因治疗提供实验基础。     

携带反义多药耐药基因的重组腺病毒载体的构建

从携带有全长人类 MDR1c DNA的质粒 p Ha MDR1- 1获得 MDR1基因片段 ,将其反向克隆到腺病毒载体 Ad Easy系统的穿梭质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装生成携带反义 MDR1基因片段的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- as MDR1,可以有效地感染人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究逆转肝癌多药耐药性的机制提供了基础     

小鼠β_2m反义核酸重组荧光蛋白表达载体的构建及表达研究

本研究应用分子生物学技术 ,构建小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN ,经过酶切、PCR鉴定 ,以及序列分析证实克隆的正确性。然后用脂质体转染NIH3T3细胞 ,经过RT PCR及Westernblot检测 ,观察重组质粒对细胞β2 mmRNA和蛋白表达的影响 ,同时在荧光显微镜下直接观察细胞转染的结果。结果证明pEGFP β2 mAN已成功导入NIH3T3细胞中 ,且有效表达 ,在荧光显微镜下可见梭形绿色荧光细胞 ;与同步转染的小鼠 β2 m正、反义核酸表达载体pcDNA3 β2 mSN、pcDNA3 β2 mAN的转染结果一起进行分析 ,转染pcDNA3 β2 mSN细胞的 β2 mmRNA和蛋白表达水平升高 ,而转染pcD NA3 β2 mAN和pEGFP β2 mAN的细胞 β2 mmRNA和蛋白表达水平降低。小鼠 β2 m反义核酸重组荧光蛋白表达载体pEGFP β2 mAN的转染结果显示 :它不但可以降低NIH3T3细胞 β2 m基因的表达 ,而且为观察脂质体转染效果提供了直观、即时的方法     

Flag与GFP双标记人微粒体甘油三酯转移蛋白重组腺病毒载体的构建与表达

目的利用重组腺病毒（adenovirus，ad）技术Adeasy系统构建带绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）和Flag双标记的人类微粒体甘油三酯转移蛋白（human microsomal triglyceride transfer protein，hMTP）基因重组腺病毒载体，并包装成高滴度的腺病毒。方法自人HepG2细胞获得RNA，以RT-PCR和Nested PCR扩增hMTP-flag基因。PCR产物经测序证实后插入穿梭质粒GFP-Track。经PmeⅠ酶切线性化后，共转化到含腺病毒骨架质粒Adeasy的感受态细菌BJ5183。筛取阳性克隆，经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞，产生包装病毒颗粒，并传代扩增培养。结果经测序证实得到hMTP-flag-GFP基因，限制性内切酶证实同源重组腺病毒包含目的基因。荧光显微镜下可见GFP的高效表达，Western-blot检测可见97KD目的条带（hMTP分子质量为97KD）。结论成功构建含hMTP-flag-GFP基因的双标记重组腺病毒载体，并进行蛋白质表达，为进一步研究脂蛋白的功能打好了坚实基础。     

CVB3腺病毒载体疫苗Ad/VP1的构建及免疫效果研究

 目的 构建柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)VP1基因重组腺病毒疫苗Ad/VP1,并观察其对小鼠的免疫效果。方法 利用AdEasy-1系统构建、包装重组腺病毒Ad/VP1,并检测目的蛋白的表达。BALB/c小鼠随机分为Ad/VP1、Ad和PBS 3组,肌肉注射免疫,共免疫2次,每次间隔16d。用ELISA法和微量中和试验法分别检测血清CVB3 VP1 IgG和中和抗体滴度;CCK-8法检测特异性CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察小鼠的存活率。结果 成功构建、包装了重组腺病毒Ad/VP1,并在293细胞中检测到VP1蛋白的表达。免疫小鼠后,Ad/VP1组血清CVB3 VP1 IgG滴度、中和抗体水平明显高于PBS和Ad对照组(P<0.01),CTL杀伤活性和对小鼠的保护率也高于对照组(P<0.05),血清病毒滴度低于两对照组(P<0.05)。结论 重组腺病毒疫苗Ad/VP1能显著提高小鼠的细胞和体液免疫应答及免疫保护作用。     

抑制RAGE表达的siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性针对细胞膜上晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的小干扰RNA(siRNA)腺病毒载体,鉴定其对大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞RAGE表达的影响.方法 设计并合成针对大鼠RAGE基因的siRNA的靶DNA序列,克隆于穿梭载体pAdTrack中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,脂质体法转染至QBI293A细胞中包装,获得RAGE-siRNA的重组腺病毒,荧光显微镜观察RAGE-siRNA感染INS-1细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western印迹检测RAGE的蛋白表达.结果 成功制备RAGE-siRNA重组腺病毒,在INS-1细胞中RAGE-siRNA感染效率达到90 %以上,并能够抑制INS-1细胞RAGE的表达.结论 成功构建了携带RAGE的siRNA重组腺病毒载体,能有效沉默INS-1细胞中RAGE的表达.     

人Nephrin -GFP融合蛋白真核表达载体的构建和鉴定

目的 构建人19号染色体长臂Nephrin基因和绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)真核表达质粒,为进一步研究肾小球裂隙隔膜分子复合物构成与功能提供基础.方法 设计引物,扩增真核表达质粒pEGFP N3中的GFP基因片段,将其插入nephrin原核表达载体pcDNA3.1 nephrin V5-His,重组质粒经酶切鉴定后测序,并转染至COS-7细胞观察表达情况及生物学特性.结果 成功构建pcDNA3.1 nephrin-GFP重组质粒,并将Nephrin -GFP融合蛋白成功表达于COS-7细胞,进一步经交联实验证明Nephrin-GFP融合蛋白具有正确的细胞膜表达.结论 利用pEGFP N3和pcDNA3.1 nephrin V5-His可成功重组Nephrin-GFP表达质粒,为进一步研究肾小球裂隙隔膜分子复合物构成及其功能提供有利工具.