重组人α1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的 获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础.方法 制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定.应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸"标签"(6 × His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察.结果 成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg/L,约占总蛋白的30%.经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白.结论 首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点.     

重组人胰腺α-淀粉酶在毕赤酵母菌中的分泌性表达

目的:构建人胰腺!-淀粉酶(HPA)真核表达载体并在毕赤酵母中进行表达。方法:从人胰腺组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,RT-PCR法扩增HPA基因,将其插入到酵母分泌性表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组质粒pPIC9-HPA,用该质粒转化毕赤酵母菌GS115,PCR方法筛选阳性克隆,摇瓶培养、0.5%甲醇诱导重组HPA分泌性表达,测定培养上清中的淀粉酶活力;重组HPA用冷乙醇-糖原亲和沉淀、疏水层析纯化并以SDS-PAGE电泳和Westernblot方法鉴定。结果:成功构建了重组HPA真核酵母表达载体,重组质粒酶切和核酸测序结果与预期一致,显示HPA基因正确插入质粒pPIC9中;以pPIC9-HPA转化毕赤酵母菌GS115,实现了重组HPA在毕赤酵母菌分泌性表达;重组HPA经纯化后鉴定具天然HPA相同的免疫原性,其对可溶性淀粉酶的水解产物和酶动力学分析与天然HPA相近。结论:成功实现了HPA在毕赤酵母真核表达系统中的分泌性表达,重组HPA与天然HPA具有相似的催化和酶动力学性质。本实验为下一步作为临床HPA测定标准品的研制准备了实验基础。     

重组人α_1-微球蛋白在毕赤酵母中的高效分泌性表达

目的获得可溶、稳定、高纯度的α1-微球蛋白(α1-microglobulin,α1-MG),为临床检测标准品、质控品制备奠定基础。方法制备构建重组人毕赤酵母真核分泌表达质粒,并对重组α1-MG进行诱导表达、纯化和鉴定。应用PCR方法扩增重组人α1-MG pET-15b质粒,得到N端带有6个组氨酸“标签”(6×His-tag)的α1-MG融合基因,将该基因插入到真核酵母分泌表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组分泌表达质粒pPIC9-MG、并转化毕赤酵母菌菌株GS115(Pichia pastoris GS115);用甲醇进行重组人α1-MG的诱导表达,摇瓶发酵,上清α1-MG含量测定;目的蛋白采用硫酸铵沉淀、一步亲和层析纯化并通过免疫学含量测定、PAGE电泳、Western blot以及生物质谱进行鉴定;初步进行稳定性观察。结果成功构建了重组人α1-MG真核酵母表达载体,核酸测序与预测一致,并在毕赤酵母中实现了重组人α1-MG的分泌性表达,表达量可达73 mg／L,约占总蛋白的30％。经纯化及鉴定,得到了可溶性的、具有天然蛋白生物学活性的PAGE纯目的蛋白。结论首次在毕赤酵母中实现重组人α1-MG的高效分泌性表达,表达目的蛋白具有良好的生物学活性、稳定性好、易纯化等优点。     

Stathmin基因毕赤酵母表达体系的构建及鉴定

目的构建Stathmin基因毕赤酵母表达体系,并对表达产物进行纯化和鉴定,为Stathmin相互作用蛋白的进一步研究提供实验基础。方法通过PCR方法从SKBR3乳腺癌细胞中扩增出人Stathmin基因片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K,构建重组载体pPIC3.5K-Stathmin,转化GS115工程菌,经含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基筛选出阳性克隆。用0.5%甲醇诱导表达,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鉴定表达产物。结果 DNA测序结果表明,所获基因片段与Stathmin基因序列一致。在含有G418 600μg/mL的YPD培养基上筛选出的pPIC3.5K-Stathmin转化子,经PCR鉴定为阳性克隆。SDS-PAGE可见约37×103处有目的条带表达,经Western Blotting鉴定,此条带为Stathmin蛋白。结论成功构建了Stathmin酵母表达载体,并在毕赤酵母中表达成功,为Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治疗药物的制备奠定了基础。     

体外重组内皮抑素及其抑制肿瘤血管生成机制探讨

目的克隆及表达中国昆明种小鼠的内皮抑素（endostatin）基因。方法RT-PCR方法扩增鼠内皮抑素基因，构建温敏型表达载体pBV220-endostatin，在大肠杆菌DH5“中诱导表达出鼠内皮抑素蛋白。结果筛选出pBV220-endostatin阳性克隆菌株，诱导表达外源蛋白内皮抑素，纯化复性后具有一定生物学活性。结论克隆小鼠内皮抑素基因，重组内皮抑素在大肠杆菌中高效表达，复性后具有抑制血管生长活性。     

重组人胱蛋白酶抑制剂C在毕氏酵母菌中的高效表达

目的：构建人胱蛋白酶抑制剂C（Cystatin C)的表达载体并进行蛋白的初步纯化。方法：用逆转录聚合酶链反应从人胎盘组织中扩增含有380bp的Cystatin C cDNA基因片段，并将其插入到pPIC9质粒中，携带有Cystatin C片段的pPIC9质粒转化毕氏酵母菌菌株GS115，醇氧化脱氢酶1（AOX1）启动子被甲醇诱导而产生可溶性Cystatin C.重组Cystatin C采用Hitrap-SP阳离子交换柱进行初步纯化。结果：核酸序列测定与预期一致。Cystatin C 表达水平达到16mg/L，约占菌体总可溶性蛋白的60％，蛋白纯化回收率为40．5％，Cystatin C在表达体系中至少可稳定3d，结论：Cystatin C在毕氏酵母力胞外有较高水平的分泌，既可作为抗原免疫动物获取抗体，也可作为测定的标准品，为今后进行国产Cystatin C免疫学测定剂研制奠定了基础。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

目的用PCR技术特异扩增人溶菌酶基因hLYz cDNA序列,克隆至质粒pMD18一T中,获得重组质粒pMD18-T-hLYZ。方法采用EcoRⅠ／NotⅠ双酶切及PCR确认正确后,将人溶菌酶基因cDNA目的片段亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,通过电穿孔法转化毕赤酵母菌GS115,获得重组质粒pPIC9k-hLYZ,采用EcoRⅠ／NotⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确,在毕赤酵母菌中诱导表达产物经SDS-PAGE电泳分析,结果表明表达产物与预期大小的hLYZ蛋白分子量一致,采用微球菌溶解法进行抑菌活性测定。结论证实具有明显的抑菌作用。     

人源多肽抗生素LL-37真核表达载体的构建

目的 构建抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,转化毕赤酵母GS115以获得表达LL-37的工程菌.方法 通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽LL-37的基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒,PCR鉴定及序列分析后转化毕赤酵母GS115.MM、MD平板筛选His^＋Mut^＋、His^＋Mut^-表型,PCR扩增鉴定基因的插入.结果 PCR鉴定及序列分析表明抗菌肽LL-37基因正确插入载体pPIC9,MM、MD平板筛选及PCR鉴定获得10个His^＋Mut^＋、9个His^＋Mut^-克隆.结论 获得含LL-37基因的工程菌.     

血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的:构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法:实验于2004-02/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成,表达质粒由中山大学医药分子实验室保存,肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,在16℃下以进行16h连接反应,转化大肠杆菌DH5α,对所获克隆扩大培养,提取质粒经EcoRI,BamHI酶切鉴定。将带有插入片段的重组质粒命名为PGEM-Tendo。对其阳性克隆扩大培养,大量提取质粒,以T7,SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEM-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRI,BamHI酶切后定向连接,转化入大肠杆菌DH5α,聚合酶链反应鉴定阳性克隆,命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养,经42℃热诱导4h后收菌,对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎,将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果:反转录—聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp,用EcoRI,BamHI双酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEM-T载体片段,说明内皮抑素已成功构建在PGEM-T载体上。经全自动正、反向测序,Genbank分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因,该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A,但编码的氨基酸都是精氨酸,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,出现特异性蛋白质条带,大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达,表达量为14.5%。结论:克隆的552bp的内皮抑素基因,经与GenBank中人胶原XVIIIcDNA中内皮抑素基因比较,基因序列基本一致,说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

人LYVE-1的基因克隆及其在毕赤甲醇酵母细胞中的表达鉴定

目的获得可溶、稳定、与人淋巴管内皮特异性透明质酸受体（LYVE-1）具备相同抗原性的重组人LYVE-1,为进一步研究LYVE-1在淋巴管形成中的作用及临床肿瘤免疫学诊断打下基础、提供材料。方法采用逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）自人淋巴结获得LYVE-1全长cDNA,将其克隆入真核表达载体pPICZα,构建含人LYVE-1的重组质粒（pPICZα-LYVE-1）;经全自动序列分析仪测序确证后,将此重组质粒转化入毕赤甲醇酵母细胞（GS115）中进行诱导表达,表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析及免疫印迹试验（Western blot）鉴定。结果经甲醇诱导的含pPICZα-LYVE-1的酵母细胞表达出重组人LYVE-1的融合蛋白,此蛋白在凝胶上表现为一约70000的区带,在Western blot实验中可被LYVE-1的特异多克隆抗体识别。结论人LYVE-1融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达,并具有与人体天然蛋白相同的抗原活性。     

人血浆蛋白S成熟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

目的 构建人血浆蛋白S的原核表达载体并诱导其表达。方法 自行设计引物，采用PCR法，以现有人血浆蛋白S真核表达载体为模板，扩增人血浆蛋白S成熟肽的编码序列。PCR产物经EcoRI和BamHI双酶切后，克隆至GST融合表达载体pGEX-2T中，在E．coli BL21中诱导GST-人血浆蛋白S融合蛋白的表达。结果 对重组质粒的序列分析表明，插入片段的序列与Gen Bank登录的人血浆蛋白S基因编码序列完全一致。10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，在IPTG的诱导下，BL21重组菌高效表达分子量约为96kD的产物．并可通过GST亲和层析柱纯化。结论 人血浆蛋白S编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-2T，并在E．coli BL21中获得表达。     

MK—EGFP融合蛋白的构建和表达

目的克隆中期因子（midkine，MK）的编码序列，构建MK—EGFP融合表达质粒，诱导表达并亲合纯化。方法用RT—PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因，构建原核表达质粒pET—MK-EGFP；转化大肠杆菌，诱导表达重组蛋白；纯化回收后鉴定生物活性。结果重组质粒经酶切测序与预期相符，融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见，MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性。结论MK—EGFP重组质粒构建正确，融合蛋白大量表达，并具有完整的生物学活性。     

人泛素-核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达

目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

人自身抗原Sm B'基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的 通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原Sm B'.方法 PCR扩增Sm B'基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Sm B'.用电穿孔法转化酵母菌Sm D1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(WB)鉴定,并用免疫酶斑点法和免疫印迹法(immunoblot,IBT)检测与评价分析30例系统性红斑狼疮(SLE)患者、30例混合结缔组织病患者和30名健康体检者血清中抗-Sm B'水平差异.结果 PCR产物约700 bp,与预期657 bp接近,pPIC9k-Sm B'重组阳性克隆测序结果与核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Sm B'的相对分子质量约32 000,WB法证实表达产物具有天然Sm B'分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的 表达条带.免疫酶斑点法检测阳性率为46.7%(42/90),IBT的检测阳性率为51.1%(46/90);2种方法检测结果一致性较佳(Kappa值=0.911 2,P<0.01).结论 Sm B'在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,这为Sm B'试剂盒研究奠定了基础.     

小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础。方法用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒。结果酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中。结论成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础。     

HE4融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的重组及表达人附睾上皮分泌蛋白4(HE4)的融合蛋白,为建立一种新的卵巢癌的诊断方法奠定基础。方法提取人卵巢癌细胞株SKOV3中总RNA,应用RT-PCR技术扩增出HE4基因,将其与PUCm-T载体连接,转化入TOP10菌中进行克隆并测序鉴定。进一步构建PET28a-HE4表达体系,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,最终在BL21菌中表达HE4融合蛋白(含有His-Tag),并进行SDS-PAGE及western blot鉴定。结果SKOV3细胞株提取的RNA经RT-PCR扩增后得到一条400bp左右的DNA片断,经测序鉴定含HE4基因序列;成功构建了HE4融合蛋白的重组表达质粒;并在大肠杆菌中实现了可溶性高表达,经western blot鉴定为HE4融合蛋白。结论采用原核表达方法可获得高纯度的HE4融合蛋白,为进一步开发HE4诊断试剂打下基础,为卵巢癌的诊断开辟新途径。     

重组pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的构建与鉴定

背景:腺病毒临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的:将人骨形态发生蛋白9的cDNA构建于pcDNA4 His/Max,得到重组真核表达载体pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9。方法:将已有的Padtrack-cmv-人骨形态发生蛋白9进行PCR扩增,电泳回收人骨形态发生蛋白9片段,将pcDNA4 His/Max用NotⅠ和KpnⅠ双酶切,得到pcDNA4His/Max酶切片段,连接人骨形态发生蛋白9和pcDNA4 His/Max片段得到重组质粒pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9,将该载体用DH5α转化,阳性克隆扩增及纯化、序列分析鉴定。结果与结论:通过PCR及序列分析证明pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的人骨形态发生蛋白9基因长度为1.3kb,与报道的人骨形态发生蛋白9全长序列一致,无突变。结果证实,实验成功构建了pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体。     

SSA抗原真核表达载体的构建

目的：通过基因克隆构建表达人干燥综合征抗原A（SSA）的巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体。方法：从人白血病淋巴细胞HL60株中提取RNA，反转录出cDNA，然后以cDNA为模板，通过PCR法扩增目的基因SSA，经纯化、双酶切、DNA浓缩回收，插入到酵母分泌型表达载体pPIC9k，用热冲击法转化感受态细胞DH5a，筛选阳性克隆提取质粒，双酶切鉴定并测序。结果：PCR产物大小符合要求，重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致，测序结果正确。结论：成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体，为今后获取高纯度、高产量的SSA抗原，研制新型抗SSA诊断试剂盒作前期准备。