端粒重复序列扩增聚合酶链反应检测肺刷落细胞端粒酶活性

用端粒酶聚合酶链反应（ＰＣＲ）酶联免疫吸附测定（ＥＬＩＳＡ）法，联合聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）和银染色法，检测肺刷落细胞中端粒酶活性，并探讨了其在肺癌诊断中的价值。一、方法ＴＲＡＰＰＣＲＥＬＩＳＡ测定具体操作如下：将肺刷落细胞加裂解液１０～５...     

端粒酶在泌尿系肿瘤中应用的研究进展

端粒酶是一种核糖核蛋白酶 ,其表达在绝大多数体细胞中受抑制 ,但在胚胎细胞、成年男性生殖细胞、子宫内膜细胞、造血干细胞、活化淋巴细胞、表皮基底细胞和肠滤泡细胞中也存在 ;而在绝大多数肿瘤中 ,其表达活跃 ,代表了细胞永生化和癌变的一个重要环节。本文对其功能及其在泌尿系肿瘤中的应用价值综述如下。1　端粒酶的结构和功能1.1　基本结构　端粒酶由三部分组成 :端粒酶 RNA组分、相关蛋白和端粒酶催化亚单位。 1RNA组分 (TR) :人类的TR基因位于 3q2 6 .3,端粒酶是以 TR为模板 ,利用逆转录酶活性来延长端粒。通过反义人端粒酶 RN…     

端粒酶在胃癌诊断中的意义

端粒酶是真核生物染色体末端的一段特殊结构,由富含鸟嘌呤碱基G的序列及相关蛋白质组成。端粒的长度和稳定与细胞生命活动密切相关,因此被成为细胞寿命的“时钟”。端粒酶是在80年代从四膜虫细胞提取物中首次被发现的。它的主要组成单位是蛋白质和RNA。人类的端粒酶属于逆转录酶,端粒酶参与了端粒的生物合成过程。表达端粒酶是细胞增殖的特点,肿瘤是细胞的异常增殖形成,只要有异常增殖便表达端粒酶,所以对端粒酶进行检测便可最早期的筛查肿瘤,现将在我院病理切片为阳性的胃癌患者进行端粒酶活性检测,进一步探讨端粒酶在临床检测中的意义。…     

乳头溢液脱落细胞端粒酶活性检测

目的探讨乳头溢液脱落细胞端粒酶活性检测在临床诊断中的应用。方法采用ＴＲＡＰ－ＰＣＲ银染定性法及ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ定量法对５０例溢乳进行脱落细胞端粒酶活性分析。结果５０例溢乳脱落细胞端粒酶阳性率高达７８％（３９／５０）,随着年龄的增大,端粒酶阳性率呈逐步下降趋势,而同期送检的细胞病理诊断则无１例找到癌细胞。结论溢乳脱落细胞端粒酶阳性检出率明显增高。随着疾病的发展,端粒酶阳性患者易发生恶变的可能性是否大于端粒酶阴性患者需进一步研究。     

端粒酶反转录酶在长骨造釉细胞瘤中的表达

目的:端粒酶反转录酶作为端粒酶蛋白的主要组分,被称为端粒酶活性作用的限速因子,在细胞增生过程中起重要作用.观察长骨造釉细胞瘤中端粒酶反转录酶的表达及其反义寡核苷酸对其表达和细胞增生的抑制作用.方法:实验于2006-02/2007-04在沈阳市第四人民医院完成.体外培养长骨造釉细胞瘤细胞,在24,48,72 h 后采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法作端粒酶反转录酶免疫组织化学检测;将2.5,5.0 μmol/L 和10.0 μmol/L 不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸分别作用于体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞,无寡核苷酸混合液的DMEM液作空白对照,采用免疫组织化学方法检测端粒酶反转录酶的表达;四甲基偶氮唑盐比色法检测在不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸作用下,长骨造釉细胞瘤细胞生长活性及其生长抑制率.结果:①体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞可表达端粒酶反转录酶,在5.0,10.0 μmol/L 反义寡核苷酸作用下,端粒酶反转录酶的表达明显受抑制,与空白对照组比较,差异有显著性意义(P < 0.01).②端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能明显抑制长骨造釉细胞瘤细胞增生活性,并呈剂量依赖性. 结论:一定浓度端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能序列特异性地抑制长骨造釉细胞瘤细胞端粒酶反转录酶表达和增生活性.     

靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。 目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。 方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列,经退火成互补双链,与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定,应用蛋白质印迹和免疫荧光技术,在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。 结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明,重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实,实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体,此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。     

肿瘤细胞端粒、端粒酶调节机制研究进展与临床意义

随着对端粒、端粒酶结构、功能、调控及其与细胞增殖、分化、凋亡及癌变的关系的深入研究 ,人们对端粒、端粒酶在细胞永生化及癌变过程中的作用较前了一更新的认识。端粒酶对恶性肿瘤的诊断、预后估计及针对端粒酶有效成分的反义核酶在肿瘤的基因治疗中具有重要的临床意义。     

构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体转染人骨髓基质细胞

背景：骨髓基质细胞不表达端粒酶,因而在体外传代扩增过程中端粒长度逐渐缩短,导致细胞衰老,这是限制其用于细胞治疗应用的一个重要因素。目的：构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体,探讨以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法：以pReceiver-M02-hTERT质粒为模板PCR扩增获得目的基因。用BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上。然后使用LR重组系统将目的序列重组到载体pLenti6.3/V5-DEST上。将重组载体与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞获得慢病毒颗粒。结果与结论：成功构建人端粒酶催化亚单位慢病毒表达载体,病毒的平均物理滴度为1.07×1012LP/L。以之转染人骨髓基质细胞,目的基因表达水平有显著提升,细胞正确表达人端粒酶反转录酶蛋白。说明以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞能强化细胞表达人端粒酶催化亚单位。     

人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

背景：椎间盘髓核细胞分离培养困难,老化较快,迫切需要一种标准细胞株用于实验研究。目的：探讨人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性研究。方法：通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染人端粒酶反转录酶表达检测等步骤进行实验。结果与结论：构建出人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体,成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。结果表明运用人端粒酶反转录酶转染椎间盘髓核细胞构建永生化细胞是一种可行的方法。     

三氧化二砷、人参皂甙和β榄香烯对K562细胞株端粒-端粒酶系统作用机制的研究

本研究目的是探索三氧化二砷、人参皂甙及β榄香烯等几种药物在不同浓度作用时对K562细胞株端粒长度和端粒酶活性的调节及抑制作用，并研究上述药物抗白血病的作用机制，为寻求治疗急性白血病的新方法奠定基础。用3组不同浓度的三氧化二砷、人参皂甙及β榄香烯与人类红白血病细胞株K562共培养，采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性，Southem blot法检测端粒长度。观察上述药物对K562细胞端粒酶活性及端粒长度的影响。结果表明：①经人参皂甙、三氧化二砷及β榄香烯作用后，K562细胞株端粒酶活性下降，下降程度呈浓度、时间依赖性，在一定浓度及作用时间后端粒酶呈阴性。②三氧化二砷、人参皂甙、β-榄香烯作用后K562细胞的存活率下降，且抑制作用呈浓度、时间依赖性。③三氧化二砷、人参皂甙及β-榄香烯作用于K562细胞72小时后，端粒长度略有延长。结论：①三氧化二砷、人参皂甙及β-榄香烯均能抑制K562细胞的端粒酶活性，抑制作用呈浓度、时间依赖性。抑制端粒酶活性可能是其抗肿瘤作用的机制之一。②三氧化二砷、人参皂甙及β-榄香烯均能抑制K562细胞的生长，抑制作用呈浓度、时间依赖性。③抑制端粒酶活性后，K562细胞的端粒长度略有延长。本研究结果提示除了端粒酶以外，白血病细胞可能存在其他的端粒长度调节机制。     

甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞株的作用观察

目的研究甲氨蝶呤(MTX)对体外培养骨肉瘤细胞株(HOS)生长的影响及端粒酶活性方面的作用。方法采用MTT法检测不同浓度的甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞株(HOS)生长作用;TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性的变化。结果甲氨蝶呤对骨肉瘤细胞株(HOS)有生长抑制作用,且呈时间,浓度依赖性。甲氨蝶呤可以降低骨肉瘤细胞株(HOS)端粒酶活性。结论甲氨蝶呤对体外培养骨肉瘤细胞株(HOS)的生长及端粒酶活性有抑制作用。     

Nonradioactive direct telomerase activity detection using biotin‐labeled primers

BackgroundTelomerase is a ribonucleoprotein enzyme responsible for maintenance of telomere length which expressed in more than 85% of cancer cells but undetectable in most normal tissue cells. Therefore, telomerase serves as a diagnostic marker of cancers. Two commonly used telomerase activity detection methods, the telomerase repeated amplification protocol (TRAP) and the direct telomerase assay (DTA), have disadvantages that mainly arise from reliance on PCR amplification or the use of an isotope. A safe, low‐cost and reliable telomerase activity detection method is still lacking.MethodWe modified DTA method using biotin‐labeled primers (Biotin‐DTA) and optimized the method by adjusting cell culture temperature and KCl concentration. The sensitivity of the method was confirmed to detect endogenous telomerase activity. The reliability was verified by detection of telomerase activity of published telomerase regulators. The stability was confirmed by comparing the method with TRAP method.ResultsCells cultured in 32°C and KCl concentration at 200 mM or 250 mM resulted in robust Biotin‐DTA signal. Endogenous telomerase activity can be detected, which suggested an similar sensitivity as DTA using radioactive isotope markers. Knockdown of telomerase assembly regulator PES1 and DKC1 efficiently reduced telomerase activity. Compared with TRAP method, Biotin‐DTA assay offers greater signal stability over a range of analyte protein amounts.ConclusionBiotin‐labeled, PCR‐free, and nonradioactive direct telomerase assay is a promising new method for the easy, low‐cost, and quantitative detection of telomerase activity.     

淋巴母细胞端粒酶活性和成瘤性的关系

目的 EB病毒相关的淋巴母细胞（lymphoblastoid cell lines,LCLs）有较高的端粒酶活性。本实验旨在分析淋巴母细胞成瘤性与端粒酶活性的关系。方法采用端粒重复扩增法（telomericrepeat amplification protocol,TRAP）分别测定淋巴细胞源性肿瘤细胞以及EB病毒相关淋巴母细胞的端粒酶活性,并对淋巴母细胞的成瘤性进行体内体外试验。结果 5株EB病毒相关的LCLs端粒酶活性与细胞传代次数有关,它们都能在免疫缺陷小鼠体内致瘤。结论容易形成集落的细胞系更容易在小鼠体内致瘤,也具有更高的端粒酶活性。     

Development of a quantitative luminometric hybridization assay for the determination of telomerase activity.

OBJECTIVES: To develop a quantitative luminometric hybridization assay for the determination of telomerase activity in tissue and cell extracts. DESIGN AND METHODS: Quantification is based on the coamplification of telomeric repeats synthesized by telomerase along with a specifically designed recombinant DNA-internal standard (DNA-IS). The DNA-IS has a similar size and the same primer recognition sites as the telomerase DNA products and differs from them only in a central 18 bp sequence. PCR products are captured on microtiter wells via the biotin-streptavidin system and hybridized with two distinct digoxigenin-labeled oligonucleotide probes that are designed to recognize specifically telomerase products and DNA-IS. The hybrids are quantified by a luminometric reaction using an antidigoxigenin antibody conjugated to alkaline phosphatase. The hybridization assay was validated with the MCF-7 breast carcinoma and leukemia K-562 cell lines and a synthetic telomerase product (R(8)). RESULTS: Luminescence ratios for telomerase products and DNA-IS were linearly related to the concentration of the pre-PCR product synthesized by telomerase (R(8)), in the range of 0.0005 to 10 pM. The overall reproducibility of the assay (between-run) varied between 11.3 and 15%. Application of the method in eleven breast tumors showed a great variation in the levels of telomerase enzymatic activity. CONCLUSIONS: The proposed luminometric hybridization assay for the quantitative determination of telomerase enzymatic activity is highly sensitive and can be used for a large-scale prospective evaluation of clinical samples.     

Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomerase activity

BACKGROUND: Telomerase is a ribonucleoprotein enzyme associated with immortalization and transformation of human cells. The telomeric repeat amplification protocol (TRAP) is widely used for the detection of telomerase activity. The TRAP method, although highly sensitive and specific because it includes PCR amplification, is laborious and does not provide precise quantitative information. METHODS: We developed a real-time quantitative TRAP (RTQ-TRAP) system by combining a real-time PCR technique with the conventional TRAP method. Telomerase activity in human tumor cell lines and in 13 lymphoma samples was measured using the RTQ-TRAP assay, and the results obtained from the samples using the RTQ-TRAP method were compared with the conventional TRAP method. RESULTS: The RTQ-TRAP method was both accurate and reproducible in measuring telomerase activity in a dilution series of protein extracts from HL60 cells. Telomerase activity in 13 lymphoma samples, as determined by the RTQ-TRAP method, was ninefold lower than that measured by the conventional TRAP method. The half-life of telomerase activity in human tumor cells, as determined using RTQ-TRAP, was much shorter than the half-life reported previously. CONCLUSIONS: Our results suggest that the conventional TRAP assay frequently overestimates telomerase activity in tumor samples. The RTQ-TRAP method is thus a useful tool to rapidly and precisely quantify telomerase activity.     

抑制ERK增强白血病和卵巢癌耐药细胞系化疗敏感性

为了研究细胞外调节蛋白激酶(extracelluar regulated protein kinases，ERK)和端粒酶在白血病和卵巢癌细胞耐药中的作用，应用流式细胞术检测细胞凋亡率，应用端粒重复序列扩增法(TRAP)和生物发光分析法去除检测端粒酶活性，应用Weestern blot法检测磷酸化ERK1/2蛋白(ERK1和ERK2)表达水平。结果表明：ERK激酶1(MEK1)特异性抑制剂PD98059能增强HL-60／E6细胞对三尖杉酯碱(HRT)的敏感性，PD98059也能增强COCl／DDP细胞对顺铂(DDP)的敏感性。PD98059与化疗药物HRT和DDP均可以降低细胞内磷酸化ERK表达，抑制端粒酶活性，但PD98059与化疗药物的联合作用明显强于其各自的单独作用。结论：通过阻抑ERK通路，降低磷酸化ERK1/2蛋白表达水平，进而下调端粒酶活性，可以达到增强白血病和卵巢癌耐药细胞对HRT或DDP敏感性的目的。