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CXC趋化因子CRG—2真核表达载体的构建及表达 总被引:1,自引:1,他引:0
1材料和方法1.1材料克隆质粒pGEM3Zf/crg-2为本室建立4。真核表达载体pcDNA3.1购于Invitrogen公司。胶回收试剂盒及转染用质粒小量提取试剂盒购自Gibco公司。内切酶、T4连接酶、Taq酶及转染脂质体Tfx-20购自Promega公司。鼠Lewis肺癌细胞LLC为本室保存。山羊抗CRG-2多抗购自SantaCruz公司。1.2方法1.2.1重组真核表达载体的构建和鉴定将含有crg-2全长cDNA的重组质粒pGEM3Zf/crg-2,用XbaI和KpnI双酶切亚克… 相似文献
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CD34分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白,主要表达于多功能造血干细胞、祖细胞表面,在成熟血细胞表面无CD34抗原表达,提示CD34分子在早期造血调控方面起着重要的作用。本文采用RT-PCR方法,从高表达人CD34抗原的KG-1a细胞系中成功地克隆出人CD34抗原全长cDNA,并将此基因插入克隆“载体pUC18HincII酶切位点,构建了重组质粒pUC18-34。用双酶切pUC18-34质粒,将分离得到的基因片段插入痘苗病毒载体的SmaⅠ位点,构建了重组质粒PJSA1175-34。采用Lipofectin方法,PJSA1175-34转染已被野生痘苗病毒感染的TK ̄-143细胞,用BudR和LacZ双筛选,获得带有人CD34抗原全长cDNA的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和APAAP检测,表明重组痘苗病毒能特异地表达人CD34抗原。人CD34抗原cDNA克隆和表达,为进一步研究其结构和功能的关系以及研究造血调控机理奠定了基础。 相似文献
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AngiostatinK(1—3)基因真核表达载体的构建,鉴定和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
构建携带人angiostatinK(1-3)cDNA的真核表达载体,并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的angiostatinK(1-3)cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3,构建CMV启动子控制的载体pcD-NA-SAK(103),采用酶切鉴定结果。 相似文献
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人细胞色素p450IA1基因cDNA的克隆和鉴定 总被引:5,自引:1,他引:4
在用3-甲基胆蒽诱导培养人羊膜FL细胞24h后,抽提细胞总RNA并直接合成cDNA第一链。利用人工合成的一对寡核苷酸引物,采用PCR技术特异性地扩增Cyt p50IA1 cDNA。30个循环后琼脂糖凝胶电泳显示1.5Kb大小片段,长度与预计相符。Southern杂交结果证实此片段确为Cyt p450IA1 cDNA。将此片段克隆至质粒pGEM-3Z并进行部份序列分析。结果显示克隆片段包含Cyt p 相似文献
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人胰岛素样生长因子1的真核细胞表达及其鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 构建人胰岛素样生长因子1(IGF-1)的真核细胞表达质粒。方法 用PCR方法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出IGF-1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3中,并用脂质体方法转染COS7细胞。用ELISA法和人胚肺纤维母细胞以及NIH3T3纤维细胞增殖法分别测定转染细胞上清液中IGF-1的含量和生物活性。结果 重组的真核细胞表达质粒pcDNA3-IGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确,其转染的COS7细胞分泌较高浓度的IGF-1,并且具有明显促进纤维细胞增殖的能力。结论 本实验所构建的重组真核细胞表达质粒pcDNA3-IGF-1能够高效表达有活性的IGF-1,对进一步研究IGF-1体内表达的生理和病理作用有一定意义。 相似文献
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人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定 总被引:7,自引:1,他引:6
目的:克隆中国人IL-2p40基因,构建IL-12的真核基因表达载体。方法:采用RT-PCR从北京地区人脐血树突状细胞(DC)中克隆IL-12p40cDNA基因,并进行序列分析。利用pcDNA3.1和pLXPXSN构建IL-12表达载体,转染人肝癌细胞后对其进行生物学和免疫学分析。结果:北京地区人DC中IL-12p40cDNA基因210位密码子有独特的结构,为GCC(Ala)。并且239和291位 相似文献
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我室曾建立分泌抗B血型抗原IgM类单克隆抗体的5D12杂交瘤细胞株[1] ,本文应用基因工程技术 ,分离和克隆了 5D12株单抗的VH 和VL 基因 ,采用重叠延伸拼接PCR(SOEPCR )技术[2 ] 体外成功构建 5D12单链抗体基因 ,获得较高水平的表达。1 材料和方法1 1 细胞和载体 E coliTG1为英国Winter教授惠赠 ;质粒pGEX 4T 2购自Pharmacia公司 ;含十五肽接头质粒pSTE 2 15由德国Dubel教授惠赠。1 2 引物和试剂 用于扩增重链可变区的一对引物为VHBack (5 AGGT (C/G )CAGCTG… 相似文献
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从内皮细胞总RNA中用RT-PCR方法扩增出E-选择素cDNA全长编码区,并将其克隆到pUC18载体中,构建了重组质粒pUC18/E-selectin,对此质粒进行了酶切及DNA序列分析鉴定。将E-selectincDNA插入到天坛株痘苗病毒载体SmaI位点,构建了表达质粒pJSA1175/E-selectin。采用Lipofectin方法,pJSA1175/E-selectin转染TK-143细胞,用BudR和LacZ双筛选,获得带有人E-选择素cDNA的重组痘苗病毒。经活细胞荧光染色和APAM检测,重组痘苗病毒能有效地表达人E-选择素cDNA。 相似文献
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HSV—1 SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免?… 总被引:3,自引:1,他引:2
目的 构建HSV-1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体,并用此重组质粒直接免疫小鼠,探讨HSV-1 gD基因作为基因疫苗的可能性。方法 从HSV-1基因组中扩增gD的全编码基因,克隆入载体pUC19中,测序鉴定后转入真核表达载体pcDNA3.1(+)。所得重组质粒pcD-NA-gD以电穿孔法转染CHO细胞,并以荧光染色法鉴定表达效果。用pcDNA-gD免疫小鼠,ELISA法检测基因免疫 相似文献
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将人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的cDNA插入融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,构建成质粒pGEX/MCP转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导后合成GST-MCP-1融合蛋白。用12%SDS-PAGE检测在30kD左右有新生蛋白条带出现,表达量约占菌体总蛋白的31.7%。趋化实验证明,该产物具备明确的单核细胞趋化活性。 相似文献
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将人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的cDNA插入融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,构建成质粒pGEX/MCP转化大肠杆菌JM109,经IPTG诱导后合成GST-MCP-1融合蛋白。用12%SCS-PAGE检测在30kD左右有新生蛋白条带出现,表达量约占菌体总蛋白的31.7%,趋化实验证明,该产物具备明确的单核细胞趋化活性。 相似文献
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利用聚合酶链式反应技术(PCR),从人肺巨细胞癌PLA-801母系细胞系统克隆化高转移细胞株D中特异性扩增P2 cDNA(Human ribosomal phosphoprotein P2 gene cDNA),并将扩增产物克隆入pGEM-3Z载体,获得了重组质粒pMP2,对其中两个克隆pMP2-1、pMP2-2的P2 cDNA进行了序列分析。结果表明:pMP2-1的P2cDNA序列与文献报道基本 相似文献
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p53基因诱导G1停滞研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
王志洁 《国外医学:遗传学分册》1996,19(4):175-175
p53基因可与其专一的DNA交感结合部位结合,通过活化含有此反应元件的CDK抑制剂p21^waf-1/cip-1/cdi-1及gadd45基因的转录,使DNA受损伤的细胞生长停滞在G1关卡。p53基因还可和TATA结合蛋白结合,抑制细胞增殖的速发早期基因c-fos、c-jun、PCNA等的转录,抑制细胞增殖。p53蛋白还可和复制因子A相互作用,抑制DNA复制。G1停滞在细胞对DNA损伤的修复中有重 相似文献
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用PCR聚合酶链反应技术从人细胞间粘附分子1(ICAM-1)cDNA中获取了其编码细胞外氨基端功能区Ⅰ、Ⅱ185个氨基酸的DNA序列,构建了重组质粒pET/rsICAM-1。经转化宿主菌,通过SDS-PAGE,薄层扫描和Western blot,证明目的基因在大肠杆菌中获得了高效表达。 相似文献
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一、材料和方法1.材料 :胶质瘤细胞C6购自本校全军神经外科研究所。重组人肿瘤坏死因子α(RhTNF α)购自Sigma公司 ,按照所需浓度以PBS稀释。噻唑蓝 (MTT)购自Amresco公司。二甲基亚砜 (DMSO)购自Fluka公司。RPMI 16 40培养液购自Sigma公司。小牛血清购自杭州四季青生物制品公司。p38丝裂素活化蛋白激酶 (p38mitogen activatedproteinkinases,p38MAPK)抗体由新加坡国立大学林圣彩教授惠赠。免疫组织化学SABC试剂盒购自武汉博士德公司。2 .方法 :(1)M… 相似文献
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p53基因可与其专一的DNA交感结合部位结合,通过活化含有此反应元件的CDK抑制剂p21waf-1/cip-1/cdi-1及gadd45基因的转录,使DNA受损伤的细胞生长停滞在G1关卡。p53基因还可和TATA结合蛋白结合,抑制细胞增殖的速发早期基因c-fos、c-jun、PCNA等的转录,抑制细胞增殖。p53蛋白还可和复制因子A相互作用,抑制DNA复制。G1停滞在细胞对DNA损伤的修复中有重要意义。 相似文献
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表达人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞可抑制人血清补体的细胞毒作用 总被引:3,自引:0,他引:3
目的研究转染人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞抗补体的细胞毒作用。方法从人胎盘组织提取总RNA,用RT-PCR技术扩增得到人膜辅助因子蛋白(hMCP)基因全长cDNA,将其克隆到带有巨细胞病毒(CMV)IE启动子的pCI-neo哺乳动物表达载体和以pCI-neo为基础构建成的带有人EF-1α启动子的pEF-neo哺乳动物表达载体上,得到质粒pCIM和pEFM。利用电穿孔基因转移方法分别转染猪内皮细胞(PEC),以G418筛选稳定表达克隆。用正常人血清处理此转基因细胞来检测其抗补体作用。结果Northern杂交结果表明,在EF-1α启动子引导下的hMCP基因得到了高效表达。死细胞计数和LDH释放实验结果表明,表达hMCP基因的PEC可有效抑制人血清补体对其的裂解作用(P<0.01)。结论克隆的hMCP基因在EF-1α启动子引导下于PEC可高效表达,且使PEC能够抗人补体的细胞毒作用。 相似文献