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1.
弓形虫不同分离株ROP1和P30基因的体外扩增 总被引:7,自引:0,他引:7
通过体外扩增弓形虫RH,ZS1,ZS2,GT14个分离株的编码棒状体蛋白和主要表膜蛋白,抗原的基因片段,比较虫株间差异,为克隆及其DNA免疫的研究做准备。特定引物的设计,弓形虫虫株的复苏;接种,收集,纯化;提取弓形虫RH,ZS1,ZS2及GT1分离株的基因组DNA,并以此为模板进行PCR扩增,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。 相似文献
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目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2(ROP2)靶基因,构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取基因组DNA;根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物,应用PCR扩增ROP2基因片段,回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T;用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子,将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3,并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板,PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段,克隆于pUCm-T载体中,再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3,经筛选鉴定,构建pc-DNA3-ROP2重组质粒;测序结果显示,重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列,能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段,经TA克隆及亚克隆,构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。 相似文献
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编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达 总被引:10,自引:2,他引:8
郭虹 《中国人兽共患病杂志》1999,15(2):15-18
目的构建弓形虫棒状体蛋白(ROP1)基因重组质粒并在E.coli中表达。方法用RH株接种小鼠,收集腹水,纯化速殖子,抽提基因组DNA;据ROP1基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,BamHI酶切位点,用PCR技术从RH株基因组DNA中扩增编码ROP1的基因片段,插入pBV220质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切鉴定;经温度诱导在E.coli中表达,SDS-PAGE及免疫印迹分析。结果ROP1基因体外扩增产物大小与预期值相符,约756bp;构建成功pBV220-ROP1重组质粒;SDS-PAGE、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约43kD,表达产量约占菌体蛋白13.23%。结论从弓形虫基因组DNA中获取ROP1基因,并成功构建pBV220-ROP1重组质粒,诱导表达ROP1非融合蛋白,为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。 相似文献
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弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 构建弓形虫RH株pcDNA3.1-P30-ROP2真核表达重组质粒,为进一步表达及DNA疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组人puC18克隆载体,然后将pUC18-P30-ROP2中的P30-ROP2外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组中扩增m特异的P30、ROP2片段,克隆成功pUC18-P30-ROP2重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3.1-P30-ROP2重组表达质粒。结论 成功构建了弓形虫puC18P30-ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功pcDNA3.1-P30-ROP2直核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段,克隆至表达载体pET22b中,导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段,克隆至质粒pUC119中,经PCR和酶切鉴定后,进行DNA序列测定,并以SacⅠ/HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上,重组质粒pET22b—ROP2转化大肠杆菌BL21,CodonPlus(DE3)-RIL菌株中,经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1.0kb的ROP2基因片段.构建成功重组质粒pUC119,ROP2,经DNA序列分析与已报道序列基本一致,重组质粒pET22b,ROP2在大肠杆菌中表达,产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达,构建成功的重组盾粒pUC119-ROP2可用千下一步多基因融合的市隆操作。 相似文献
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目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白18(ROP18)与ROP12的复合基因真核表达重组质粒,并检验其在真核细胞中的表达情况。方法重组质粒p VAX1-ROP18和p VAX1-ROP12分别经Bam HⅠ和XbaⅠ双酶切,将ROP12基因克隆至p VAX1-ROP18重组质粒。经菌落PCR、酶切及测序鉴定正确的重组表达质粒p VAX1-ROP18-ROP12转染至He La细胞。同时设空质粒组、p VAX1-ROP18转染组和p VAX1-ROP12转染组。提取各组He La细胞的总RNA并逆转录为c DNA,分别进行管家基因β-肌动蛋白和ROP18-ROP12复合基因的RT-PCR鉴定;同时,采用间接荧光免疫法和蛋白质印迹(Western blotting)法检测重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12瞬时转染He La细胞后蛋白的表达情况。结果重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12的菌落PCR电泳显示在约2 373 bp处出现特异性扩增片段,与预期大小相符。提取重组质粒经HindⅢ、Bam HⅠ和XbaⅠ单酶切、双酶切及三酶切鉴定均正确。测序结果显示,p VAX1-ROP18-ROP12重组质粒与已发表的弓形虫RH株ROP18基因(登录号为AM075204.1)序列一致性为100%,与弓形虫RH株ROP12基因(登录号为DQ096559.1)序列一致性为99%。脂质体转染后各组β-肌动蛋白的RT-PCR扩增产物均为613 bp,与预期大小相符。p VAX1-ROP18-ROP12转染组的ROP18-ROP12复合基因扩增产物大小为2 373 bp,而其他组未见条带。间接荧光法检测显示,在重组质粒转染的He La细胞胞浆中观察到黄绿色荧光,而对照组无黄绿色荧光。Western blotting法检测显示,融合蛋白ROP18-ROP12相对分子质量(Mr)约为85 000。结论构建了重组质粒p VAX1-ROP18-ROP12,该质粒能在真核细胞中表达。 相似文献
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目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。 相似文献
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弓形虫棒状体蛋白 1(ROP1)是与虫体侵入相关的重要分子。将含编码 ROP1蛋白基因的真核表达重组质粒 pc DNA3转染 Hep G- 2细胞 ,为进一步研究做准备。用脂质体介导的真核细胞转染法 ,G418筛选阳性克隆 ,SDS-PAGE及 Western- blot分析鉴定表达产物。结果显示 ,在所筛选的克隆化生长的细胞裂解液样品电泳图谱中 ,有一大小约 35~ 40 k Da的特异电泳条带 ,该条带可被弓形虫免疫兔血清识别。本研究建立了体外稳定表达 ROP1的细胞系 ,证实了表达产物的免疫原性 相似文献
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弓形虫昆山分离株P30蛋白的纯化、复性和鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的表达并纯化弓形虫昆山分离株膜蛋白P30。方法将构建的pET28b-P30重组质粒转入大肠埃希菌BL21,挑重组菌于LB培养基中增菌,IPTG诱导其表达,然后纯化包涵体,用尿素溶解包涵体,Ni2 螯合柱纯化产物,以透析法复性蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果大肠埃希菌表达的P30蛋白以包涵体的形式存在,P30蛋白经Ni2 螯合柱纯化后纯度大于95%。经Western blot鉴定,复性蛋白能被弓形虫感染的鼠血清识别。结论得到了纯度高的膜蛋白P30。 相似文献
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刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达 总被引:3,自引:1,他引:3
目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 相似文献
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弓形虫ZS2株抗原基因的扩增及克隆 总被引:2,自引:0,他引:2
扩增弓形虫ZS2株P30抗原基因,构建PcDNA3—P30真核表达重组质粒。方法本文采用PCR技术,自行设计一对寡核苷酸引物(P1,P2),从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRI和Hind双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨共青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoRI和Kind双酶切鉴定。结果从弓形虫ZS2株DNA中扩增出1025bP的P30基因,构建重组质粒PcDNA3—P30,酶切产物的大小分别与预期相符。结论成功地对弓形虫ZS2株P30基因进行体外扩增及构建真核表达重组质粒PcDNA3—P30,为重组P30抗原及核酸疫苗研究做好准备。 相似文献
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弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达 总被引:6,自引:0,他引:6
目的 在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法 采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大肠杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。结果 1、在我们比较的783个碱基中,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同;2、得到-分子量为54kDa的融合蛋白,占大肠杆菌总蛋白的38%。结论 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。 相似文献
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截短的弓形虫P30基因在E.coli中的高效表达及纯化条件的探索 总被引:10,自引:2,他引:10
目的:构建能在E.coli中高效表达的弓形虫主要表面抗原(P30)基因的重组表达质粒,并对纯化条件进行优化。方法:对已知的弓形虫P30基因序列进行部分取舍,用PCR技术从弓形虫ZS1株的基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,插入载体pET-30(a)中,转化大肠杆蓖DH5α,IPTG诱导表达,包涵体经洗涤、变性、复性及不同程度的浓缩后,进行SDS-PAGE及免疫印迹分析。结果:从弓形虫ZS1株基因组DNA中扩增出截短的P30基因片段,成功构建重组表达质料粒pET-P30;SDS-PAGE显示蛋白表达带的分子量约为31kD,表达量占菌体总蛋白的31.58%,经1M及2M尿素洗涤后,其纯度分别达63.42%及75.7%;免疫印迹显示,该纯蛋白能被弓形虫病人阳性血清所识别,产而且当浓缩至初始体积的1/3-1/6时,纯化蛋白与DNA免疫鼠血清的反应最强。结论: 成功构建重组质粒pET-P30,并以融合蛋白的形式进行了高效表达,经变 性、复性后,该蛋白具有特异的免疫反应性,为弓形虫诊断试剂盒的研制打下基础。 相似文献
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目的 单克隆抗体免疫亲和层析技术提纯弓形虫主要表膜P30抗原SDS-PAGE进行鉴定。 方法 用已建立的能分泌抗弓形虫P30抗原的E3杂交瘤细胞腹腔注入BALB/c小鼠自腹水中收集单克隆抗体(McAb),经饱和硫酸胺沉淀后DEAE-纤维柱层析纯化,偶联至溴化氢活化的琼脂糖4B载体上装柱,将大量的低频超声粉碎速殖子抗原反复过柱洗脱以收集纯化的P30蛋白质并通过SDS-PAGE进行鉴定。 结果 经单克隆抗体免疫亲合层析约获得了8.1mg较纯的P30蛋白质,在SDS-PAGE上呈现单一条带。 结论 单克隆抗体免疫亲合层析技术为一较好的提纯P30抗原的方法。 相似文献
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含弓形虫P30基因插入昆虫杆状病毒的研究 总被引:4,自引:0,他引:4
目的:将弓形虫ZS1株主要表膜抗原(P30)基因插入到昆虫杆状病毒基因组中,为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产P30作准备。方法:先将P30基因亚克隆到转移载体质粒pSX-IVVI+X3中,然后用此重组载体质粒DNA与亲本株病毒DNA共转染培养的草地夜蛾细胞,经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果:已得到含P30基因的重组杆状病毒TnNPV-P30。结论:本文已将弓形虫ZS1株P30基因亚克隆到昆虫杆状病毒TnNPV中。 相似文献
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弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 构建弓形虫主要表面抗原P30 基因的原核表达载体并在E-coli 中表达。方法 根据已发表的弓形虫P30基因序列,自行设计合成一对引物并在引物5’端分别引入限制性内切酶EcoRI、SalI酶切位点,用PCR技术从弓形虫RH 株基因组DNA中扩增P30 基因片段,插入pMALP2 质粒转化大肠杆菌DH5aα感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子。将阳性重组子经IPTG诱导表达,SDS- PAGE及免疫印迹分析。结果 从弓形虫RH 株DNA中扩增出976bp 的P30 基因,构建成功pMALP2 - P30 重组质粒;SDS- PAGE电泳及Western - blot 显示MBP/P30 融合蛋白条带的分子量约为77-5kD,减去MBP的分子量43kD,得出P30 蛋白分子量为34-5kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论 从弓形虫基因组DNA中获取P30 基因,并成功构建pMALP2 - P30 重组质粒,诱导表达了P30 的融合蛋白。为进一步P30 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。 相似文献
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弓形虫非同源性不同地理株的GRA1基因体外扩增片段的鉴定及比较研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的对弓形虫人源性RH株、人源性ZS_2株、猪源性CN株3个不同地理株的GRA1基因片段鉴定并比较异同。方法采用PCR技术和限制性内切酶技术,分别对弓形虫3株的GRA1基因片段进行体外扩增。扩增的目的基因片段分别用3种内切酶HindⅢ、HPaⅡ、TaqⅠ进行单酶切鉴定、比较。结果从弓形虫3个分离株RH株、ZS_2株、CN标基因组DNA中扩增出785bp的GRA1基因片段。3个株的GRA1基因分别用3种内切酶酶切后,酶切片段与理论值相符。结论实验所用不同来源弓形虫分离株的GRA1基因扩增片段基本相同,且3种限制性内切酶酶切图诺基本一致,表明这3个分离株的GRA1基因高度保守。 相似文献