大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因5′端调控序列初步分析

目的　分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位 (GCLC)基因 5′端调控区域和相应转录因子的特性。方法　克隆 1 760bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的 5′端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其 11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验 (EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子。结果　实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的 11个缺失体。将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性:GCLC Luc(-1 758 /+2 Luc),缺失体 1(-1 231 /+2 Luc),缺失体 2(-1 108 /+2 Luc),缺失体 3(-1 087 /+2 Luc),缺失体 4(-876 /+2 Luc),缺失体 5(-745 /+2 Luc),缺失体 6(-705 /+2 Luc),缺失体 8(-613 /+2 Luc),缺失体 9(-595 /+2 Luc),缺失体 10( -403 /+2 Luc)和缺失体 11( -111 /+2 Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(28     

乙型肝炎病毒X基因对c-met基因启动子区的调控作用

目的 明确乙型肝炎X基因(HBx)对c-met基因启动子区的调控及其在肝细胞癌侵袭和转移中的机制.方法 将HBx表达质粒转染HepG2细胞,采用Western blot方法比较转染前后HBx对原癌蛋白质c-met(c-met)表达的影响,进一步将c-met基因启动子区分成5个(包括全部序列)不同长度的片段,然后与PGL3-Basic荧光素酶报告基因系统连接构建成重组质粒,将上述质粒与HBx表达质粒共转染于HepG2细胞中,通过荧光素酶测定、启动子区突变分析及侵袭试验比较转染前后HBx对c-met表达调控的影响.荧光素酶活性值采用ANOVA单因素方差分析,侵袭细胞数统计采用t检验.结果 HBx能够增强c-met的表达;通过对c-met基因启动子区缺失分析,确定了c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)是HBx作用的调控区域,进一步对该区域可能的转录因子结合位点(SP1-1、SP1-2、AP-2)进行突变分析,发现这3个结合位点均参与了HBx对c-met基因启动子区的调控.测定全部缺失构建体荧光素酶活性结果显示,-184上游部分序列缺失后对HBx的反应有轻微的降低,当-183 bp/-122 bp、-121 bp/-100 bp两个片段缺失后,启动子对HBx的反应均有明显降低,F=40.37,P<0.01;c-met启动子突变分析显示,HBx诱导的荧光素酶活性在SP-1-1、SP-1-2,AP-2突变体组中明显下降,F=235.3,P<0.01.Matrigel侵袭试验检测结果显示,转染pCEP4-X-FLAG表达质粒的HepG2细胞侵袭性增加,穿膜细胞数为(74.33±6.24)个,而未转染组穿膜细胞数为(28.24±3.05)个,t=9.68,P<0.01.结论 HBx引起肝细胞癌的侵袭转移可能是通过对c-met基因启动子区(-183 bp～-100 bp)转录因子SP-1、AP-2结合位点的调控来实现的,但是该过程中所涉及的信号通路仍有待进一步研究.     

人细胞色素P450 4A11基因核心启动子区的鉴定

目的研究细胞色素P4504A11基因启动子区对该基因转录活性的影响。方法运用生物信息学的方法预测细胞色素P4504A11基因启动子区的重要调控序列，然后采用5’侧翼区缺失的方法将包含重要调控序列的启动子克隆到双报告基因载体中，用脂质体转染HepG2细胞，24h后检测荧光素酶相对活性。然后使用Alibaba 2．0Transfae4．0预测增强子区域可能存在的转录因子结合位点。结果·36--720-＋1、-972～＋1、-1039-＋1区域的启动子活性较高，其中-972～＋1区域最强，与此相比-536-＋1、-720～＋1荧光素酶相对活性分别下降了96．9％和70．1％。结论人CYP4A11基因5’侧翼区的影响转录活性的启动子关键区域位于-972--720bp范围内。     

肿瘤坏死因子α5''''上游核因子-κB结合位点在转录调控中的作用

目的:研究大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因5'上游序列中核因子-κB的5个结合位点(-898,-641,-610,-498,-208)在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导乳鼠心肌细胞TNF-α表达中的作用.方法:运用脱氧核糖核酸(DNA)重组技术构建5个分别包含SD大鼠TNF-α基因5'上游不同序列(-1167～ 63 bp,-730～ 63 bp,-632～ 63 bp,-548～ 63 bp,-421～ 63 bp)的荧光素酶报告基因质粒1～5(V1～V5),转染乳鼠心肌细胞V1～V5共5组及空载体组,检测在AngⅡ刺激及核因子-κB抑制剂咖啡酸苯乙酯(CAPE)作用下心肌细胞荧光素酶比活性的变化.结果:基础状态下转染质粒V3、V4的心肌细胞荧光素酶比活性高于V5,而V5又高于V1、V2.10-8mol/L AngⅡ刺激24 h后,与对照相比,转染V5的心肌细胞荧光素酶比活性显著增加,转染V4的心肌细胞荧光素酶比活性明显下降,且V5高于V4.在AngⅡ刺激同时加入CAPE可使转染任一重组质粒的心肌细胞荧光素酶比活性显著下降,且低于对照.结论:TNF-α基因5'上游核因子-κB的5个结合位点在基础状态下,κB4(-498)、κB5(-208)位点促进TNF-α转录,κB2(-641)抑制TNF-α转录.AngⅡ通过κB3(-610)、κB5位点促进TNF-α转录,而通过κB4则抑制TNF-α转录.     

丹参对血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞组织因子基因表达的作用

目的 探讨丹参有效单体764-3(764-3)对心血管血栓栓塞性疾病防治的可能机制。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、内皮细胞株(ECV304)。采用限制性内切酶法,构建含有人血管内皮细胞组织因子基因不同上游调控序列的荧光素酶报告基因质粒,经脂质体法转染内皮细胞,用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及764-3处理内皮细胞,测定细胞裂解物荧光素酶及β半乳糖苷酶活性。用激光共聚焦扫描显像系统观测单个内皮细胞胞内游离钙浓度([Ca2+]i)水平的改变。结果 在TF基因上游序列-244/+121bp存在下,AngⅡ可使转染内皮细胞荧光素酶表达量明显高于对照组,764-3抑制这种增加。AngⅡ可引起人内皮细胞[Ca2+]i缓慢升高,加入764-3可迅速大幅度降低[Ca2+]i,使接近基线水平。结论764-3可抑制AngⅡ诱导的人内皮细胞TF基因表达增强,这种作用依赖于该基因上游序列-244/+121bp的存在。     

幽门螺杆菌cag致病岛ORF10基因下调胃上皮白细胞介素-8转录

目的　幽门螺杆菌 (Hp)cag致病岛 (cagPAI)含 30多个基因 ,HpcagⅠ与cagⅡ中许多基因能增加胃上皮白细胞介素 8(IL 8)基因转录与IL 8蛋白分泌。本研究观察HpcagⅡ中ORF10基因对胃上皮细胞IL 8基因转录的影响 ,以验证HpcagPAI中某些基因下调IL 8基因转录及表达的可能性。方法　构建cagⅡORF10基因缺失 ( ORF10 )Hp突变株及带有IL 8报告基因的人胃癌细胞系L5F11,用液体闪烁计数仪测定荧光素酶 (IL 8转录 )活性 ,用ELISA法测定IL 8蛋白浓度。结果　 3株 ORF10Hp菌株 (2 8 1,2 8 2 ,2 8 3)诱导荧光素酶活性较亲代菌株 2 6 6 95显著增加 [分别为 2 8 1:(1.4 9± 0 .2 7)× 10 6cpm ,2 8 2 :(1.33± 0 .2 8)× 10 6cpm ,2 8 3:(1.33± 0 .2 9)× 10 6cpm ;亲代菌株2 6 6 95 :(0 .6 7± 0 .0 8)× 10 6cpm ;P分别 <0 .0 1,0 .0 5和 0 .0 5 ];2株 ORF10Hp菌株诱导IL 8蛋白水平较亲代菌株 2 6 6 95均显著升高 [分别为 2 8 2 :(1.2± 0 .0 8)ng/ml;2 8 3为 (1.2 4± 0 .0 7)ng/ml;亲代菌株 2 6 6 95为 (0 .33± 0 .19)ng/ml,P <0 .0 5 ,<0 .0 1]。结论　与HpcagⅠ与cagⅡ中大多数基因上调IL 8转录不同 ,cagⅡ中ORF10基因对胃上皮细胞IL 8转录起下调作用     

中国幽门螺杆菌胃上皮细胞白细胞介素-8的转录能力

目的探讨中国幽门螺杆菌(Hp)的空泡毒素基因(vacA)型及cag致病岛对胃上皮细胞白细胞介素-8(IL-8)转录的影响.方法以基因测序与Southern杂交法确定HpvacA基因型及cag致病岛状态;构建带有IL-8报告基因的人胃癌细胞系L5F11,用液体闪烁计数仪测定荧光素酶活性(IL-8转录),用HeLa细胞测定空泡毒素活性.结果所有cag致病岛完整菌株(15株)较野生型cag致病岛阴性菌株G50诱导荧光素酶活性[记数/分(cpm)]明显增强[(0.47±0.19)×106cpm比(0.13±0.02)×106cpm,P＜0.01];而cag致病岛部分丢失菌株(4株)荧光素酶活性与G50差异无显著性[(0.23±0.08)×106cpm比(0.13±0.02)×106cpm,P＞0.05];vacA基因s1/m1型菌株(5株)较s1/m2型菌株(14株)空泡毒素活性增强(P＜0.01),但二者诱导荧光素酶活性差异无显著性[(0.29±0.12)×106cpm比(0.53±0.41)×106cpm,P＞0.05].结论中国Hp诱导胃上皮细胞IL-8转录能力与cag致病岛状态密切相关,而与vacA基因型无明显关系.     

氯沙坦对胆固醇饮食兔主动脉粥样硬化及核因子-κB活性的影响

目的观察AT1受体拮抗剂氯沙坦(losartan)对胆固醇饮食兔动脉粥样硬化及核转录因子NF-κB活性的影响,以探讨losartan在动脉粥样硬化防治中的可能作用机制.方法日本大耳白兔给予含1.5%胆固醇饲料80g·kg-1·d-1喂养12周后,随机分为两组①高脂组继续饲以1.5%胆固醇饲料4周;②氯沙坦组饲以1.5%胆固醇饲料的同时加喂10mg·kg-1·d-1的氯沙坦,共4周.另选普通饲料喂养16周兔作为正常对照.实验结束后,取主动脉行组织形态学观察及核因子-κB、细胞间粘附分子-1的免疫组织化学分析.结果12周末,胆固醇组血脂(TC、LDL-C)水平明显高于对照组(P＜0.01),而两组间血压无显著性改变.氯沙坦干预亦未对血脂及动脉血压产生影响.胆固醇组主动脉斑块/内膜面积比为32.48±3.31%,氯沙坦干预组则减少至11.52±4.16%(P＜0.01).内膜厚度亦由51.85±8.42%减至25.38±6.59%(P＜0.01).免疫组织化学及图像分析结果提示,核转录因子NF-κB及其靶基因产物ICAM-1的数量因氯沙坦的干预而明显减少(P＜0.05).结论本研究结果证实,氯沙坦对动脉粥样硬化产生了某种程度上的消退作用,其抗动脉粥样硬化机制可能与抑制核转录因子NF-κB的激活有关.     

丙型肝炎病毒5''非翻译区DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)基因组5'非翻译区(5'UTR)DNA序列在HepG2细胞中的启动子活性,以了解HCV的复制调控机制.方法分别构建HCV基因组5'UTR DNA正反向序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒5'UTR- Luc(+)/(-)和5'UTR DNA序列驱动绿色荧光蛋白基因表达的质粒5'UTR -EGFP(+)/(-),分别转染HepG2细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因m R N A水平,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因的表达水平,并与相应对照作比较,来证实H CV基因组5'UTR DNA序列的启动子活性.结果 5'UTR- LUc(+)有明显的虫荧光素酶表达,但比pGL3 control表达水平低(Luc/R为0.690 ± 0.086,Luc/RL为4.210±0.340),而5'UTR-Luc(-)和pGL3 enhancer无明显虫荧光素酶表达(Luc/RL分别为0.095±0.008和0.044±0.00 5);逆转录聚合酶链反应结果与之相符,5'UTR- Luc(+)检测到虫荧光素酶基因mRNA,而5'UTRLuc(-)则未检测到.5'UTR- EGFP(+)观察到较强绿色荧光,而5'UTR -EGFP(-)无荧光表达.结论 HCV基因组5'UTR DNA序列具有明显的启动子活性,能启动下游基因的表达,在HCV基因组复制过程中有重要作用.     

溃疡性结肠炎组织中NF-κB,COX-2和iNOS表达的意义

目的:转录因子NF-κB的诱导,调控着免疫和炎症反应中众多基因的表达。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)存在上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的异常激活及细胞因子的表达失调。我们检测了UC组织中NF-κBp65,及两种启动子含NF-κB结合位点的蛋白COX-2和iNOS的表达和分布,探讨他们在UC发病机制中的作用,及三者之间的关系。 方法:用免疫组化SP法检测39例活动期溃疡性结肠炎内镜活检标本及30例正常对照石蜡包埋组织中NF-κBp65,COX-2和iNOS的表达情况。 结果:UC组p65,COX-2和iNOS均为阳性表达,主要分布于上皮细胞,固有层炎性细胞及血管内皮细胞也有程度不同的表达。对照组均为阴性或弱阳性表达。三者在UC组的表达与对照组相比,差异均有非常显著性(P<0.01)。p65的表达与内镜及病理分级有关,内镜Ⅱ级与Ⅰ级比较(5.8±2.6 vs 3.6±1.9),差异显著(P<0.05)。病理Ⅱ,Ⅲ级与Ⅰ级比较(6.1±2.4,7.3±2.5 vs 4.0±2.3),差异显著(P<0.05,P<0.01)。iNOS的表达与病理分级有关,Ⅲ级与Ⅰ,Ⅱ级比较(7.8±2.5 vs 4.6±2.3,5.0±1.6),差异显著(P<0.01,P<0.05),COX-2的表达在病情轻重,内镜及病理分级间差异无显著性(p>0.05)。p65与COX-2,iNOS表达显著相关(r_s~1分别为0.713,0.706;P<0.01),COX-2与iNOS表达显著相关(r_s~1=0.85     

激肽释放酶腺相关病毒载体的构建及对脐静脉内皮细胞功能的影响

目的构建激肽释放酶(HK)腺相关病毒(AAV)载体,检测重组病毒感染脐静脉内皮细胞系(HUVEC)后HK基因和内皮功能相关基因表达的变化。方法HK基因克隆人腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS,和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、腺病毒辅助质粒pHe1per共转染293细胞,包装成带有HK基因的重组腺相关病毒(rAAV-HK)。以rAAV-HK感染HUVEC。RT-PCR法检测HK基因、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、凋亡蛋白酶(caspase-3)、内皮素-1(ET-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素B_1受体以及缓激肽B_1受体、缓激肽B_2受体的mRNA转录变化。ELISA法测定HUVEC上清液和胞内HK的含量。结果成功构建了rAAV-HK。rAAV-HK感染HUVEC后,实验组胞内HKmRNA转录(0．59±0．12)比空白组(0．26±0．05)明显增加(P＜0．01)；实验组胞内HK含量(120．1±40．9)比空白组(30．8±12．8)显著升高(P＜0．01)；实验组eNOSmRNA转录(1．19±0．28)较空白组(0．66±0．11)增加(P＜0．05),实验组caspase-3mRNA转录(0．30±0．25)较空白组(0．67±0．27)减弱(P＜0．05)。VEGF、内皮素-1、内皮素B_1受体、缓激肽B_1受体、缓激肽B_2受体mRNA转录两组差异无统计学意义。结论rAAV-HK病毒感染HUVEC后能高效表达HK,并促进HUVEC胞内eNOSmRNA转录,抑制caspase-3mRNA转录,提示导入HK基因能够改善内皮功能。     

幽门螺杆菌cagⅡ对胃上皮细胞IL-8基因转录的影响及机制

目的探讨HpcagⅡ对胃上皮细胞IL-8基因转录的影响及信号传导机制。方法构建 cagⅡ基因位点缺失Hp突变株及带有IL-8报告基因的人胃癌细胞系L5F11,用液体闪烁计数仪测定荧光素酶(IL8转录)活性,用ELISA法测定IL8蛋白浓度。结果所有Hp突变株诱导荧光素酶活性与IL8蛋白浓度较亲代菌株26695均降低[(0．13±0．01)×cpm比(0．59±0．05)×(P<0．01);(0．73±0．13)ng／ml比(2．22±0．65)ng／ml,(P<0．05)]。PTK抑制剂herbimycinA不仅抑制Hp诱导的荧光素酶活性[(0．71±0．18)×cpm比(1．51±0．23)×cpm,(P<0．05)],而且抑制IL-8蛋白表达[(0．83±0．41)ng／ml比(3．22±0．59)ng／ml,(P<0．05)],但herbimycinA对TNFα诱导的荧光素酶活性及IL8蛋白表达均无影响(P均>0．05);PKA抑制剂H7抑制TNFα诱导的荧光素酶活性[(0．74±0．16)×cpm比(2．62±0．26)×cpm,(P<0．001)]及IL8蛋白表达[(1．45±0．38)ng／ml比(4．12±0．43)ng／ml,(P<0．01)],而对Hp诱导的荧光素酶活性无影响(P>0．05)。结论HpcagⅡ中的多基因能够调节胃上皮细胞IL-8基因转录,且这一作用主要经蛋白酪氨酸激酶途径。     

核因子-κB与大肠肿瘤细胞凋亡及增生的关系

目的:通过观察大肠腺瘤、腺癌和正常大肠组织中的细胞凋亡、细胞增生及其调控基因Bcl-2,Bcl-Xl,C-myc和核因子-κB的表达状态,探讨核因子-κB在大肠癌发病过程中的作用。 方法:利用DNA缺口末端标记技术和NF-κB,Bcl-2,Bcl-Xl,C-myc,PCNA蛋白免疫组化染色,原位检测30例大肠腺瘤和30例大肠腺癌中凋亡细胞、细胞增生和NF-κB,Bcl-2,Bcl-Xl,C-myc阳性表达细胞的密度和分布,以10例正常大肠组织作对照。 结果:NF-κB,Bcl-2,Bcl-Xl,C-myc蛋白的表达率和表达强度腺癌和腺瘤高于正常组织(70.9±7.2 vs 54.0±4.5 vs 30.6±2.4;78.2±8.3 vs 55.6±6.5 vs 11.0±1.9;77.3±6.5 vs 56.4±4.7vs 9.3±1.1;70.3±6.7 vs 50.1±4.2 vs 14.2±1.7,P<0.01),腺癌高于腺瘤(70.9±7.2 vs 54.0±4.5;78.2±8.3 vs 55.6±6.5;77.3±6.5 vs 56.4±4.7;70.3±6.7 vs 50.1±4.2,P<0.01)。腺瘤和腺癌中的凋亡细胞指数均高于正常组织(105.9±6.1 vs31.5±3.7 vs 10.0±1.5,P<0.01),腺瘤高于腺癌(105.9±6.1vs 31.5±3.7,P<0.01)。腺癌和腺瘤中的细胞增生高于正常组织(75.4±5.6 vs 50.7±4.9 vs 29.6±3.0,P<0.01);腺癌高于腺瘤(75.4±5.6 vs 50.7±4.9,P<0.01)。 结论:NF-κB在大肠肿瘤中促进细胞增生、抑制细胞凋亡,在其发病过程     

心肌细胞中微小核糖核酸let-7c对肌营养素基因表达的调控作用

目的:探讨心肌细胞中微小核糖核酸(mi R)let-7c(mi R-let-7c)对肌营养素基因表达是否具有调控作用以及可能的作用机制。方法:首先构建携带肌营养素基因3'非编码区(3'-UTR)片段的荧光素酶报告基因载体,与mi R-let-7c前体共转染Hela细胞,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性以验证mi R-let-7c与肌营养素基因的靶向调控关系。进而培养大鼠心肌细胞H9c2,Taqman实时定量聚合酶链式反应(PCR)法检测mi R转染效果,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测mi R-let-7c及mi R-let-7c抑制物转染心肌细胞后肌营养素蛋白表达,以及心肌肥厚相关信号通路分子核转录因子-κB(NF-κB)的活性变化。结果:荧光素酶活性实验结果表明,与重组荧光素酶报告基因表达载体(p MIR-MTPN)+mi R前体阴性对照组相比,p MIR-MTPN+mi R-let-7c前体组荧光素酶活性显著降低[(59.30±9.90)%vs(98.10±15.10)%]。Western blot结果表明,mi R-let-7c前体组与mi R阴性对照组相比,肌营养素蛋白表达水平显著降低([0.28±0.05)vs(0.90±0.09)],此外,NF-κB蛋白水平显著降低([0.25±0.06)vs(0.75±0.07)];相反,mi R-let-7c抑制物组与抑制物阴性对照组相比,肌营养素蛋白表达水平显著升高[(1.14±0.09)vs(0.44±0.09)],同时,NF-κB蛋白水平也显著升高[(1.09±0.05)vs(0.71±0.06)],差异均有统计学意义(P0.05)。结论:miR-let-7c能够通过作用于3'UTR区域,抑制肌营养素基因表达,并影响心肌肥厚关键信号通路分子NF-κB的活性。     

非诺贝特与过氧化体增殖物激活型受体α对人肝瘤细胞1型纤溶酶原激活物抑制剂表达的影响

目的探讨非诺贝特对人肝瘤细胞株(HepG2)细胞1型纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响及机制。方法用不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化。构建4个荧光素酶报告基因质粒,分别由PAI-1启动子序列从-804至+17间不同长度片段驱动,体外转染HepG2细胞,检测荧光素酶的活性。结果非诺贝特能使HepG2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著降低,且呈一定剂量依赖性;还可使PAI-1转录活性显著降低;当转染质粒含有PAI-1启动子序列-636~+17、-449~+17-、276~+17 bp 3个片段时,荧光素酶活性显著增高;共转染过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)表达质粒(PPAR-αpSG5)的细胞在非诺贝特诱导下PAI-1转录活性显著降低。结论非诺贝特可以抑制HepG2细胞PAI-1mRNA表达及其活性,调节PAI-1的基因转录,PPARα参与非诺贝特对PAI-1基因的表达调控。     

人E1A激活基因阻遏子基因启动子生物信息学分析及转录调控功能初探

目的对人类腺病毒5型早期区域1A(adenovirus type 5 early region 1A,E1A)激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A-stimulated genes,hCREG)启动子进行生物信息学分析、预测hCREG启动子位置和转录因子结合位点。方法对2005年1月至7月沈阳军区总医院全军心血管病研究所进行的从Genbank中获得hCREG的全长编码基因,利用First EF程序分析软件分析并获得hCREG的启动子序列,利用Motif软件对启动子序列中的转录因子结合位点进行预测。免疫荧光染色和Western blot分别观察相关转录因子的蛋白表达与细胞内hCREG蛋白及细胞表型转化之间的关系。结果用First EF软件测定长度为945bp的hCREG启动子序列,hCREG的启动子区可能定位于转录起始点上游-109~-359bp。用Motif软件预测启动子区域共含有80多个转录调控因子结合位点,其中肿瘤抑制基因wtp53结合位点为-456bp。进一步应用蛋白质印迹(western blot)和免疫荧光染色分析wtp53与细胞表型转化的关系。在0.5%胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)培养的HITASY细胞wtp53表达较10?S培养HITASY细胞明显增加。同时,hCREG蛋白和平滑肌细胞分化标志蛋白SMα-ac-tin亦表达增多。结论获得了hCREG启动子的转录调控信息,推测出wtp53是hCREG基因转录的重要调控因子,它可能结合于hCREG启动子区,参与hCREG蛋白对VSMCs表型转化的调控。     

冠心病患者胸腺苷合成酶多态性的探讨

目的研究胸腺苷合成酶(TS)5’-非翻译区(UTR)28bp串联重复序列多态性、3-’UTR1494bp位6bp插入或缺失多态性与血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平及冠心病之间的关系。方法用多聚酶链式反应(PCR)方法检测122例冠心病患者(冠状动脉造影显示至少有一支血管狭窄≥50%)与56例对照组(冠状动脉造影未发现任何可辨认斑块或狭窄)的TS 5-’UTR 28bp串联重复序列多态性;用聚合酶链反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)分析3-’UTR1494bp位6bp插入或缺失多态性;用荧光衍生后高压液相色谱分离法检测血浆总Hcy水平。结果(1)冠心病组的血浆Hcy水平(12.99±4.76)μmol/L高于对照组(10.95±4.75)μmol/L(P=0.009)。(2)TS5-’UTR 28bp串联重复序列有三种基因型(3R/3R,3R/2R,2R/2R),这三种基因型频率在冠心病组和对照组之间的分布有差异(P=0.029);TS28各基因型个体的Hcy水平在冠心病组高于对照组(P=0.03)。3R/3R、3R/2R基因型个体的Hcy水平均高于2R/2R型个体(分别为P<0.001和P=0.011),但3R/3R基因型个体与3R/2R基因型个体的Hcy水平间的差异没有统计学意义(P=0.979)。(3)TS3-’UTR6bp插入或缺失多态性有三种基因型(+6bp/+6bp,+6bp/-6bp,-6bp/-6bp),这三种基因型频率在冠心病组和对照组之间的分布差异无显著性(P>0.05)。TS6各基因型个体的Hcy水平在冠心病组高于对照组(P=0.006)。冠心病组TS6 bp各基因型个体间Hcy水平的的差异均没有统计学意义(P均>0.05)。结论(1)高Hcy血症与冠心病有关系。(2)TS基因5-’UTR28bp串联重复序列多态性可能是冠心病发病中的一个遗传因素。3 R与冠心病组个体的Hcy水平有关系。     

缺氧诱导热休克蛋白70-2表达的分子机制

目的 观察缺氧对HepG32细胞中热休克蛋白(HSP)70-2(基因名为HSPA2)表达的影响,探讨缺氧条件下缺氧诱导因子(HIF)-1在转录水平调控HSP70-2表达的具体机制. 方法 以物理缺氧法和化学缺氧诱导剂(DFO或CoC12)诱导法分别模拟肿瘤缺氧环境,Western blot检测HIF-1α和HSP70-2蛋白表达的变化,荧光素酶报告基因分析技术检测缺氧对HSPA2基因的激活作用.HIF-1α抑制剂(YC-1)或HIF-1α小干扰RNA(siRNA)处理后检测缺氧HepG2细胞中HSP70-2的表达变化.构建一系列截短和突变的HSPA2基因启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与HIF-1α siRNA共转染HepG2细胞,荧光素酶分析技术检测HSPA2启动子活性的变化,寻找HIF-1在HSPA2启动子上的结合位点.各组间比较用方差分析,两组间比较用t检验. 结果 缺氧培养6 h后,HepG2细胞中HIF-1α和HSP70-2表达增加,其表达量随着缺氧培养时间的延长而逐渐增加(F=77.369,P<0.01;F=108.854,P<0.01).各组分别加终浓度为0、50、100 μmol/L的化学缺氧诱导剂DFO或终浓度为0、100、200 μmol/L的CoCl2,培养24 h后检测,随着DFO浓度增加,HIF-1α和HSP70-2蛋白表达逐渐增加(F=443.174,P<0.01;F=589.238,P<0.01);随着COCl2浓度增加,HIF-1 α和HSP70-2蛋白表达也逐渐增加(F=637.724,P<0.01;F=692.918,P<0.01).与常氧培养相比,缺氧培养后HSPA2启动子活性增加7.09倍(t=43.551,P<0.01).随着YC-1浓度升高,HIF-1α表达受到明显抑制(F=883.614,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=218.112,P<0.01).转染HIF-1α siRNA后HIF-1α表达受到明显抑制(F=577.130,P<0.01),HSP70-2表达水平也相应下降(F=465.598,P<0.01).构建系列截短的HSPA2启动子报告基因载体转染HepG2细胞后检测,转染HSPA2(-1114/+62)-LUC和HSPA2(-653/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性无明显改变,但转染HSPA2(-385/+62)-LUC细胞的相对荧光素酶活性较前明显降低(t=13.717,P<0.01).分别构建突变缺氧反应元件(HRE)1和HRE2的HSPA2启动子报告基因载体,转染HepG2细胞后检测,突变HRE1后HSPA2启动子活性显著降低(t=10.954,P<0.01),但是突变HRE2后HSPA2启动子活性无明显改变.结论 缺氧显著上调HepG2细胞中HSP70-2的表达,其机制可能是HIF-1与HSPA2启动子上HRE1结合后激活该基因的转录.     

核因子-κB异常激活与肝炎病毒感染关系的研究进展

核因子-κB(NF-κB)是与免疫球蛋白κ轻链增强子B区结合,具有和某些基因上启动子区固定核苷酸序列结合而启动该基因转录的蛋白质。NF-κB是具有多向性调节作用的核转录因子,可调控多种基因(免疫、炎症反应、病毒和原癌基因)的转录表达[1]。激活的NF-κB参与癌症的启动、发生及发展过程,在炎症性相关的肝癌(HCC)发生发展中呈高表达,在肝细胞炎症与癌变间起桥梁作用,其中包括肝脏免疫炎症反应相关基因、肝炎病毒相关基因和原癌基因的转录表达。在肝癌组织中异常激活,可抑制细胞凋亡,促进肝细胞存活,与肝癌的发生发展密切相关[2]。1NF-…     

载脂蛋白M基因启动子区域－778C→T置换对其表达的影响

目的构建含载脂蛋白M(ApoM)基因启动子区的荧光素酶报告基因的真核表达载体,探讨ApoM基因启动子区域-778C→T置换对ApoM表达的影响。方法采用PCR法扩增人染色体中含ApoM基因-1316 bp至+73 bp的DNA片段,筛选出含ApoM-778TT基因型(-778 bp无变异)及ApoM-778CT/CC基因型(-778bp变异)的DNA片段,构建含以上两个基因片段的PGL3重组载体。并采用阳离子脂质体转染法将携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒转染HepG2细胞,经48 h培养,检测荧光素酶的活性,以反映ApoM的表达水平。结果荧光素酶报告基因活性显示,ApoM-778C基因型携带者引起荧光素酶相对活性明显低于ApoM-778T基因型者。结论 ApoM基因启动子-778C→T对ApoM转录活性起抑制作用,它可能是影响ApoM基因表达的重要因素。