MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白的构建、表达及其双重生物学功能的初步研究

目的:利用基因工程技术制备具有双重生物学活性的MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白.方法:通过引物设计和分级克隆的策略构建了MIP-2γ/GM-CSF融合基因真核表达载体,MIP-2γ与GM-CSF由(Gly4Ser)3相连;瞬时转染293-T细胞后收集含融合蛋白的细胞培养上清;研究了该融合蛋白在体外的促造血细胞增殖活性和对免疫细胞的趋化活性.结果:MIP-2γ/GM-CSF融合基因载体构建正确;融合蛋白分子量约为24.9 kD;初步生物学功能研究表明,融合蛋白能有效促进TF-1细胞增殖,比活性约为2.2×107IU/mg,并能显著刺激骨髓细胞的集落形成;融合蛋白能有效趋化未成熟树突状细胞和CD3 T细胞.结论:MIP-2γ/GM-CSF融合蛋白具有促进造血和趋化免疫细胞的双重活性,有望成为在造血调控和抗肿瘤免疫中具有良好开发应用前景的新型细胞因子.     

mSDF-1γ/GM-CS融合蛋白的制备及其对辐射小鼠造血损伤恢复的促进

目的:利用毕赤酵母表达系统表达mSDF1γ/GMCSF融合蛋白,研究该融合蛋白对辐射小鼠的促造血增殖作用和免疫增强作用。方法：化学合成mSDF1γ/GMCS基因,构建携带该基因的表达载体,转化酵母后分泌表达重组融合蛋白,离子交换柱纯化,SDSPAGE和Western blotting分析鉴定。60Co γ射线照射制备小鼠辐射模型,以融合蛋白皮下注射进行治疗,观察辐射小鼠骨髓造血细胞的增殖活性及免疫细胞的趋化活性。结果：成功构建表达载体pPIC9K SDF1rhGMCSF1,转化毕赤酵母菌株GS115后表达融合蛋白mSDF1γ/GMCS,其相对分子质量为32 000,含量为78 ng/ml。融合蛋白治疗后,辐射小鼠骨髓单个核细胞增殖活性、GMCFU形成能力明显提高（均P<0.01）、骨髓细胞凋亡率非常明显地降低（P<0.05或P<0.01）,小鼠外周血CD3+CD4+T细胞数显著高于辐射组和GMCSF治疗组（均P<0.05）。结论： mSDF1γ/GMCSF融合蛋白具有促进造血和免疫细胞增殖的双重活性,有望在抗肿瘤免疫和造血调控中开发成为有应用前景的新型细胞因子。     

SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白的制备及其趋化作用

目的:利用基因工程技术制备SDF-1与hGM-CSF的融合蛋白(SDF-1γ/rhGM-CSF),研究该融合蛋白对肿瘤患者造血和免疫功能的增强作用。方法:构建表达SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白的pPIC9k-SDF1-rhGM-CSF1质粒,转染酵母菌,诱导SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白的表达,Western blotting鉴定SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白的表达。集落形成实验观察SDF-1γ/rhGM-CSF对骨髓细胞集落形成的影响,趋化实验检测其对未成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)的趋化作用。结果:成功构建pPIC9k-SDF1-rhGM-CSF1质粒,高表达SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白,分子量约为25 000,并可被GM-CSF特异性抗体所识别。SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白能显著刺激骨髓细胞的集落形成,其效果强于GM-CSF(P<0.05)。与SDF-1相比,SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白可更有效地趋化未成熟DC(P<0.05)。结论:SDF-1γ/rhGM-CSF融合蛋白可有效促进骨髓细胞的集落形成,趋化未成熟DC,有促进肿瘤化疗患者造血和免疫功能恢复的潜在临床应用前景。     

mSDF-1γ/GM-CS融合蛋白的制备及其对辐射小鼠造血损伤恢复的促进

目的: 利用毕赤酵母表达系统表达mSDF-1γ/GM-CSF融合蛋白,研究该融合蛋白对辐射小鼠的促造血增殖作用和免疫增强作用.方法:化学合成mSDF-1γ/GM-CS基因,构建携带该基因的表达载体,转化酵母后分泌表达重组融合蛋白,离子交换柱纯化,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定.60Co γ射线照射制备小鼠辐射模型,以融合蛋白皮下注射进行治疗,观察辐射小鼠骨髓造血细胞的增殖活性及免疫细胞的趋化活性.结果:成功构建表达载体pPIC9K- SDF1-rh-GM-CSF1,转化毕赤酵母菌株GS115后表达融合蛋白mSDF-1γ/GM-CS,其相对分子质量为32 000,含量为78 ng/ml.融合蛋白治疗后,辐射小鼠骨髓单个核细胞增殖活性、GM-CFU形成能力明显提高(均P<0.01)、骨髓细胞凋亡率非常明显地降低(P<0.05或P<0.01),小鼠外周血CD3+CD4+T细胞数显著高于辐射组和GM-CSF治疗组(均P<0.05).结论: mSDF-1γ/GM-CSF融合蛋白具有促进造血和免疫细胞增殖的双重活性,有望在抗肿瘤免疫和造血调控中开发成为有应用前景的新型细胞因子.     

HSP70L1与OVA融合蛋白的制备及其生物学功能的初步研究

目的： 〖HT5"SS〗获取原核表达的新型热休克蛋白分子HSP70L1与模型抗原卵清蛋白(OVA)片段的融合蛋白,并观察其生物学功能。〖HT5W〗方法： 〖HT5"SS〗构建表达载体pQE30OVAHSP70L1,在相应的表达宿主菌中诱导表达后,从包涵体中依次以Ni2+螯合层析柱和DEAE层析柱纯化目的蛋白;通过获得的融合蛋白对树突状细胞的成熟和细胞因子释放的促进作用初步检测其生物学活性。〖HT5W〗结果： 〖HT5"SS〗pQE30OVAHSP70L1载体构建正确;纯化的OVAHSP70L1融合蛋白相对分子质量约68 000,纯度大于95％;活性研究表明,OVAHSP70L1融合蛋白可以有效地促进树突状细胞的成熟和Th1型细胞因子IL12和TNFα的产生。〖HT5W〗结论：〖HT5"SS〗 纯化的HSP70L1与抗原OVA融合蛋白具有一定的生物学功能,融合蛋白的获取为进一步开展HSP70L1佐剂效应机制研究奠定了基础。     

LRP16融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的观察和鉴定LRP16在大肠杆菌中的表达,并分离、纯化其蛋白产物。方法应用DNA重组技术,用RT-PCR方法从正常人血液中扩增出LRP16基因全长及其抗原表位区,构建重组表达质粒pRSET-C-LRP16,IPTG诱导表达并纯化融合蛋白采用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。结果成功构建LRP16基因融合蛋白载体,SDS-PAGE显示pRSET-C-LRP16表达于原核细胞,蛋白经电泳分离,切胶后获得纯化的LRP16蛋白。结论制备的高纯度的LRP16蛋白,可在大肠杆菌中稳定表达。     

EGF-Ang融合蛋白的构建、表达及活性研究

目的：构建由人表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和人血管生成素（angiogenin, Ang）组成的人源化的融合蛋白，并检测其对肿瘤细胞的靶向杀伤能力。方法：利用基因工程技术将EGF和Ang基因连接起来，克隆到高效表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pEGFAng，并在大肠杆菌中表达该融合蛋白（EGFAng）。经DEAESepharose FF阴离子交换柱层析纯化后，用MTT法检测复性蛋白的细胞毒性。结果：SDSPAGE和薄层扫描分析表明外源蛋白的表达量占菌体裂解蛋白总量的18.6%。细胞活性检测表明EGFAng重组蛋白能明显地抑制Hep2细胞的生长，而不影响MA104细胞的正常生长。结论：融合蛋白EGFAng在体外对过度表达EGFR的Hep2细胞具有明显的杀伤作用。     

hnRNP A2/B1基因的蛋白表达初步探讨

目的：克隆hnRNPA2／B1基因并构建全长cDNA的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法：以RT-PCR法从人平滑肌肌细胞总RNA中克隆hnRNPA2／B1eDNA，连接至pGEX-4T—1载体，构建重组表达质粒，转化感受态E．coli BL21进行诱导表达。结果：克隆hnRNPA2／Bl基因全长eDNA序列，经DNA测序证明与GenBank一致。进而构建重组表达载体PCEX—A2／B1，在E．coli中表达出相对分子量约63kD的融合蛋白，免疫分析证实为hnRNPA2／B1蛋白。结论：成功克隆hnRNPA2／B1基因。在E.coli获得融合表达，为进一步研究其功能及应用提供基础。     

PD-L1-Ig融合蛋白的酵母表达及其对T细胞的抑制作用

目的：利用毕赤酵母表达系统表达PDL1Ig融合蛋白,检测该融合蛋白的生物学活性。方法：化学合成hPDL1IgG4融合基因,构建携带该基因的酵母表达载体,转化GS115酵母菌株后分泌表达融合蛋白,亲和层析和离子交换层析法纯化,SDSPAGE和Western blotting分析鉴定。ELISA法检测融合蛋白与受体PD1的结合能力,混合淋巴细胞反应检测融合蛋白对T细胞功能的抑制能力,51Cr稀释法检测其对CTL杀伤人结肠癌SW480细胞效应的抑制作用。结果：成功构建酵母表达载体pPIC9KPDL1IgG4,转化菌株分泌表达PDL1IgG4融合蛋白,相对分子质量为55 000,含量为120 μg/ml。发酵菌株,纯化制备融合蛋白。融合蛋白与受体PD1具有良好的结合能力,能够显著抑制T细胞增殖、活化（P<0.01）,并抑制CTL对结肠癌细胞的杀伤（P<0.01）。结论：成功制备了酵母表达PDL1IgG4融合蛋白,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为深入研究其在肿瘤免疫应答中的调控效应奠定了良好基础。     

免疫粘附素:一种新的研究和生物治疗工具——GM-CSF/Fc_(γ2)融合蛋白载体的构建与表达

粒细胞集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞等集落刺激因子是肿瘤病人化疗后提高机体造血和免疫功能所必须的药物,但由于各种集落刺激因子在体内的半衰期极短,因此须使用较大的剂量,而这又将产生明显的毒副作用.延长这些集落刺激因子在体内的半衰期,减少其用量有可能减轻毒副作用.免疫粘附素(Immunoadhesin)由于其特有的生物学活性,是近年来受人瞩目的一种新的研究和生物治疗工具.     

PPARγ蛋白与PTEN蛋白表达及其相关性在人乳腺癌中的研究

目的：探讨人乳腺癌组织中过氧化物酶体增殖因子激活受体（peroxisomeproliferators—activatedre—ceptorgmma,PPARY）和第十染色体同源丢失性磷酸酶一张力蛋白基因（phosphataseandtensinhomologydele—tedonchromosometen,PTEN）蛋白表达的相关性。方法：采用免疫组化S—P法,检测20例人乳腺癌组织、癌旁组织中PTEN与PPARγ的表达情况。结果：PPARγ和PTEN的表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径大小、TNM分期、病理学类型、孕激素受体（PR）及Her-2表达情况无显著相关性（P〉0．05）;肿瘤组织高分化组患者的PPARγ蛋白表达阳性率显著高于低分化组（P〈0．05）;腋窝淋巴结转移阴性者PTEN的表达显著高于≥4个淋巴结转移者（P〈0．0125）;雌激素受体（ER）阳性者PTEN的表达显著高于ER阴性者（P〈0．05）;癌旁组织PPARγ和PTEN的表达显著高于癌肿组织（P〈0．01）;PPARγ与PTEN蛋白在乳腺癌的表达成显著正相关（P〈0．01）。结论：人乳腺癌中PPARγ与PTEN蛋白表达相关联,并可能参与乳腺癌的发生、发展、浸润与转移。     

PPARγ蛋白与PTEN蛋白表达及其相关性在人乳腺癌中的研究

目的:探讨人乳腺癌组织中过氧化物酶体增殖因子激活受体(peroxisome proliferators -activated receptor gmma,PPARγ)和第十染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)蛋白表达的相关性.方法: 采用免疫组化S-P法,检测20例人乳腺癌组织、癌旁组织中PTEN与PPARγ的表达情况.结果: PPARγ和PTEN的表达与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径大小、TNM分期、病理学类型、孕激素受体(PR)及Her-2表达情况无显著相关性(P﹥0.05);肿瘤组织高分化组患者的PPARγ蛋白表达阳性率显著高于低分化组(P<0.05);腋窝淋巴结转移阴性者PTEN的表达显著高于≥4个淋巴结转移者(P<0.0125);雌激素受体(ER)阳性者PTEN的表达显著高于ER阴性者(P<0.05);癌旁组织PPARγ和PTEN的表达显著高于癌肿组织(P<0.01);PPARγ与PTEN蛋白在乳腺癌的表达成显著正相关(P<0.01).结论: 人乳腺癌中PPARγ与PTEN蛋白表达相关联,并可能参与乳腺癌的发生、发展、浸润与转移.     

人His6-IFNγ/TNFβ(His6γ-TNFNβ)融合蛋白(包涵体)的分离、纯化与复性研究

应用pET28(含T_7lac启动子和His6-tag)质粒,将人γTNFβ融合基因与之组建成pETγLT表达质粒,并转化于E.coliBL21(DE3).本文对pETγLT/ BL21(DE3)工程菌的His6-γTNFβ重组产物进行了诱导表达,分离纯化的研究.结果表明,该工程菌用LB培养基在37℃扩增至OD_(590)为0.5左右,加IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导5小时,此时His6-γTNFβ的表达量可占菌体总蛋白的45%.重组产物绝大多数以IBs形式存在于菌体中.工程菌经反复超声破碎、高速离心,得IBs粗制品后,再经含2mol/L脲的缓冲液洗涤可得到相对纯净的IBs.然后用7mol/L脲变性溶解IBs,离心取上清,进行Ni~(2 )-Sepharose 6B柱一步法亲和层析,可得到电泳纯度为95%的His6-γTNFβ,经稀释复性和用凝血酶切去His6-tag的产物,其细胞毒活性为(1.2～2.0)×10~7U/mgp,抗病毒活性为(6.0～6.6)×10~6U/map.     

TAT-ASPP2融合蛋白的制备及其对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的:制备TAT-ASPP2融合蛋白,探讨其对人胶质瘤U-87MG细胞和U251细胞增殖的抑制作用。方法:设计TAT-ASPP2引物,应用IN-Fusion技术构建原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,双酶切、DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coliBL21,IPTG诱导TAT-ASPP2融合蛋白的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定TAT-ASPP2融合蛋白。MTT法检测TAT-AS-PP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的作用。结果:成功构建了原核表达质粒pET-TAT-ASPP2,转化E.coli BL21后成功表达TAT-ASPP2融合蛋白,其相对分子质量约为128000,并可被ASPP2特异性抗体所识别。TAT-ASPP2融合蛋白对U-87MG和U251细胞增殖的抑制率分别为(65.0±3.0)%和(64.7±2.5)%,而ASPP2蛋白则不能抑制U-87MG和U251细胞的增殖。结论:成功地克隆、表达及纯化TAT-ASPP2融合蛋白,该融合蛋白可抑制胶质瘤细胞的增殖。     

靶向杀伤高表达IL-2R恶性血液病细胞的新策略IL-2/IL-2系统介导重组IL-2-霉素融合蛋白的特异性杀伤

恶性血液病的靶向杀伤治疗已成为必然的发展趋势,利用细胞因子与其受体的特异性结合来导向传递重组细胞因子.毒素融合蛋白,以达到特异性杀伤高表达相应细胞因子受体恶性血液病细胞的新策略,标志着肿瘤导向杀伤研究的最新进展之一.它较以抗原一抗体为主体的第一代导向杀伤策略具有很多优势.鉴于恶性血液病细胞异常高地表达IL-2R这一事实,近年来研究者们提出了利用IL-2与其IL-2R的特异性结合来导向传递重组IL-2一毒素融合蛋白以达到特异性杀伤高表达IL-2R恶性血液病细胞的新策略.体外及动物实验的巨大成功极大地促进了重组细胞因子一毒素融合蛋白的临床应用.1991年FDA已获批准,多个临床试用项目,试用结果十分鼓舞人心.新近又发现,重组细胞因子一毒素融合蛋白能克服目前已知的各种耐药机理,如对同时表达多药耐药相关蛋白MDR表型、p53表达缺乏以及高表达bcl-2的各种放、化疗耐药或抗性的白血病细胞均产生高度特异性的杀伤.因此,从理论上讲,该新策略既能增强导向杀伤的特     

基因工程抗体与IL-2融合蛋白研究的进展

利用基因重组技术构建抗肿瘤的小抗体／JL-2融合蛋白是肿瘤导向治疗中的一种新探索，这种策略治疗可增加肿瘤局部的IL-2浓度，减少其毒副作用．延长蛋白在体内的半衰期，更好地发挥IL-2介导的免疫细胞的抗肿瘤作用。本文就此融合蛋白的构建策略及表达、纯化的技术作一介绍。     

Snail/GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

引言上皮型钙粘附素(E-cadherin,E-cad)介导的粘附系统的破坏,是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤[1]。而锌指转录因子Snail,具有下调E-cad的作用[2],本研究通过制备Snail抗体,为进一步开展E-cad的功能研究和应用奠定了基础。1材料和方法1.1主要试剂和菌株主要试剂购自北京中山公司;大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。1.2 pGEX-4T-1/Snail原核表达载体的克隆从人血管内皮细胞提取总RNA,在逆转录酶作用下,合成cDNA。以逆转录的cDNA为模板,用上游引物5′-CT-GCAGGACTCTAATCCAG-3′(含有EcoRI内切酶位点)和下游引物5′-ATCCTTGGCCTCAGAGAGC-3′(含有Sal I内切酶位点),进行PCR扩增,得到Snail C-末端377bp的DNA片断;酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后,用玻璃奶法(自制)纯化回收,与pGEX-4T-1原核表达载体定向连接。转化DH5α感受态细菌,提取质粒并酶切鉴定重组体。1.3融合蛋白的诱导表达与纯化1.3.1表达鉴定表达质粒Snail/pGEX-4T-...     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的：利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质，以及探讨分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因的表达。方法：在构建融合蛋白之前，运用DNA分析软件（DNAssist）和蛋白质分析软件（ANTHEPROT V5）分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗肝癌ScFv基因5’端，其3’与人的肿瘤坏死因子TNF-α基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF—α基因，将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒感染人肝癌细胞命名为HCC／ScFv-TNF-α，以PCR，RT—PCR以及Western blotting对ScFv—TNF-α基因修饰的HCC9204细胞进行鉴定。结果：运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列，运用ANTHEPROT V5蛋白质分析软件分析融合蛋白的二级结构及其理化性质。经酶切及PCR分析鉴定，成功地构建了融合基因表达载体pL（ScFv—TNF-α ）SN，并获得高滴度产毒细胞株，以及Western blotting分析证明ScFv—TNF-α基因融合蛋白的表达。结论：利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质，为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据。