靶向MMP-9脱氧核酶抑制人肺腺癌细胞的粘附与迁移的实验研究

背景与目的脱氧核酶(DNAzyme,Deoxyribozyme)具有高效的催化活性和特异的序列识别能力,可特异性切割靶RNA使其失去生物学活性,从而抑制靶RNA的基因表达。本实验通过探讨靶向MMP-9的脱氧核酶对人肺腺癌A549细胞的细胞粘附与迁移能力的影响,为使用脱氧核酶抑制肺癌的浸润转移提供理论依据。方法设计靶向MMP-9的脱氧核酶,应用oligofectamine将脱氧核酶转染到A549细胞中,采用Western blot方法检测细胞中MMP-9的表达,以及利用细胞粘附与迁移试验观察脱氧核酶干预后细胞粘附与迁移能力的变化。结果在靶向MMP-9脱氧核酶干预后,细胞中MMP-9的表达较对照组与空白组显著减低(P<0.01),同时发现细胞的粘附率、迁移速度均显著降低(P<0.01)。结论靶向MMP-9的脱氧核酶能够抑制人肺腺癌A549细胞中MMP-9的表达,并且有效阻止细胞的粘附与迁移。     

hTERT脱氧核酶对白血病细胞HL-60凋亡相关基因的影响

[目的]探讨hTERT脱氧核酶对白血病细胞(HL-60)凋亡相关基因表达的影响。[方法]合成针对hTERTmRNA的"10～23"型脱氧核酶及其类似物,转染白血病细胞后,用PCR-ELISA法测定端粒酶活性;RT-PCR和荧光免疫测定Bcl-2和Bax的表达。[结果]脱氧核酶DzT转染白血病细胞后,能够显著降低白血病细胞端粒酶活性(P<0.01)和Bcl-2基因的表达(P<0.05),抑制白血病细胞的生长(P<0.05),上调Bax基因的表达(P<0.05)。[结论]脱氧核酶能降低白血病细胞的端粒酶活性,促进白血病细胞凋亡。     

寡聚体透明质酸逆转A549/DDP细胞耐药作用的研究

目的 研究寡聚体透明质酸逆转A549／DDP细胞耐药的作用。方法 MTT法研究寡聚体透明质酸对A549／DDP耐药逆转作用，流式细胞术测定细胞表面耐药相关蛋白P-gP、MRP的表达及凋亡调控蛋白P53、bcl-2的表达。结果 寡聚体透明质酸可提高A549／DDP对化疗药物的敏感性，使P-gp、MRP表达下降，P53表达增高。结论 寡聚体透明质酸有部分逆转A549／DDP耐药及诱导凋亡的作用。     

抗端粒酶核酶质粒的构建筛选及其对CNE-2Z细胞增殖与凋亡的影响

背景与目的:已证实端粒酶(telomerase,TLMA)对肿瘤的进展和肿瘤细胞的无限增殖起着重要的决定作用。核酶是具有特殊核酸内切酶活性的反义RNA,可序列特异性地与靶RNA分子配对并切割靶基因RNA。有报道人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞端粒酶阳性,本实验目的是构建抗端粒酶RNA模板区特异性核酶的真核表达载体并用电穿孔法将其导入人低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞,研究该核酶对CNE-2Z细胞增殖、凋亡的影响。方法:设计合成针对端粒酶RNA模板区的锤头状核酶基因teloRZ作为端粒酶抑制剂,构建3种带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)报道基因和嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的teloRZ真核表达质粒pGFPuro-teloRZ2.1、pGFPuro-teloRZ7.1、pGFPuro-teloRZ7.7,这3种质粒的不同点在于teloRZ基因和puromycin抗性基因按3种不同方向设计,然后将上述3种质粒及载体质粒pPAT-GFP电转染CNE-2Z细胞,用荧光显微镜检测GFP表达情况;用流式细胞仪、荧光染色法检测细胞增殖指数及凋亡等指标。结果:CNE-2ZGTR7.1细胞(转染目的基因质粒pGFPuro-teloRZ7.1的CNE-2Z细胞)增殖指数(25.100±0.141)%明显低于CNE-2Z细胞(未转染质粒的细胞)的(53.663±16.981)%、CNE-2ZG细胞(转染空载质粒pPAT-GFP的CNE-2Z细胞)的(61.575±5.166)%、CNE-2ZGTR2.1     

黄芪多糖降低A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药机制研究

目的:研究黄芪多糖对A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药的影响及可能机制。方法:将A549/DDP顺铂耐药肺腺癌细胞分为CON组（未行黄芪多糖及顺铂处理）、APS组（仅用黄芪多糖处理）、DDP组（仅用顺铂处理）及A+D组（黄芪多糖联合顺铂处理）,比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因表达的差异。结果:A+D组细胞d1-d7吸光度、S期、G2/M期和PI均显著低于CON组、APS组和DDP组细胞（均P<0.05）,G0/G1期和凋亡率均显著高于CON组、APS组和DDP组细胞（均P<0.05）;APS组和A+D组细胞MDR1和MRP基因mRNA表达无明显差异（均P>0.05）,且均显著低于CON组和DDP组（均P<0.05）。结论:黄芪多糖可显著改善A549/DDP肺腺癌细胞对顺铂耐药性,可能与黄芪多糖显著降低MDR1和MRP有关。     

核酶对人肺腺癌细胞多药耐药的逆转

目的 探讨针对多药耐药基因（ｍｄｒｌ）的核酶对肺腺癌细胞多药耐药的逆转作用。方法以ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ ８８０位点为靶位点,通过脂质介导,将抗ｍｄｒｌ核酶表达质粒（ｐＨ β Ａｐｒ－ｌ ｎｅｏ／ｍｄｒｌ－Ｒｂ）导入肺腺癌耐药细胞株Ａ５４９／Ｒ。分别采用ＲＴ－ＰＣＲ、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及ＭＴＴ方法,观察细胞的ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ、Ｐ糖蛋白（Ｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ,Ｐｇｐ）表达和对阿霉素敏     

非小细胞肺癌端粒酶催化亚基hTERT mRNA测定及其临床意义

[目的]阐明非小细胞肺癌(NSCLC)端粒酶催化亚基hTERT与TNM分期的关系并探究其与多药耐药相关基因蛋白MRP,LRP的关系。[方法]对50例NSCLC手术切除标本进行以下测定 :以RT_PCR和免疫酶标法(ELISA)检测肺癌手术标本中端粒酶活性 ;应用PCR和定量放射端粒扩增法 (TRAP)检测hTERT活性 ,并对其灰度扫描以定量测定hTERT;以RT-PCR检测冰冻肺癌组织的MRP和LRP的mRNA水平。[结果]50例NSCLC中端粒酶阳性率为84% (42/50) ,hTERT阳性率为78%(39/50) ,两者之间呈较好的相关性 (P<0.001)。端粒酶阳性组hTERT定量值为136.98±53.63;端粒酶阴性组定量值为15.50±43.84,有显著性差异(P<0.05)。MRP的阳性率为42% (21/50) ;LRP为68% (34/50)。hTERT定性 ,定量表达与MRP呈强相关而与LRP无关。不同的肿瘤细胞病理类型或T分期之间 ,hTERT的定性和定量表达无显著差异。不同N分期者hTERT定量值有显著差异。而hTERT阳性率定性测定差异未达到统计学意义。不同TNM分期的hTERT的定量表达有明显差异。不同分化程度之间端粒酶活性、hTERT的定性和定量表达差异均无统计学意义。[结论]NSCLC的hTERT定量和定性表达与端粒酶之间均有很好的相关性和一致性。hTERT表达水平的高低与NSCLCTNM分期及淋巴结转移有关。hTERT与MRP有相关性     

丙戊酸对耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡作用的实验研究

目的:探讨丙戊酸(valproic acid,VPA)抑制肺癌耐药细胞株A549/DDP增殖和凋亡的作用.方法:0-4mmol/L丙戊酸作用于A549/DDP细胞48h,观察细胞数量和形态的变化,MTT法分析细胞生长抑制,流式细胞仪测定细胞周期动力学变化,细胞免疫组化测定Caspase-3.结果:VPA干预后细胞数量明显减少,形态不规则,细胞核固缩,胞质减少;与对照组比较,VPA可造成A549/DDP细胞生长抑制,且随着VPA浓度的增加,抑制率增加;G1期比例明显升高,S期明显降低;与对照组比较,各实验组细胞胞质中Caspase-3表达明显增加,Caspase-3表达与VPA的浓度成正相关.结论:VPA可明显抑制A549/DDP的生长,诱导凋亡和G1期阻滞作用,在肺癌耐药方面具有重要理论价值和实践意义.     

苦参碱对人肺腺癌细胞株A549生长抑制和c-myc、hTERT蛋白表达的影响

背景与目的 近年研究发现,端粒酶与人类肿瘤的发生、发展密切相关,并成为肿瘤治疗的共同作用靶点.苦参碱抗肺癌的研究报道对其体外生长抑制作用发生的可能的机制尚未阐明,本研究的目的是探讨苦参碱对肺癌A549细胞生长影响及与端粒酶相关的机制.方法 MTT法测定苦参碱对A549细胞增殖抑制作用,Hoechst33342-PI荧光双染法观察细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率,免疫细胞化学(SP法)测定c-myc、hTERT蛋白表达的变化.结果 苦参碱可明显抑制A549细胞的增殖(P<0.05),呈一定的时间剂最效应关系;荧光显微镜下看到凋亡细胞核染色质凝聚成团,核碎裂形成凋亡小体;流式细胞术分析:C0/C1期细胞比例呈增高趋势,S期细胞比例呈降低趋势,且凋亡率不断增加;处理组细胞c-myc、hTERT蛋白表达减少(P<0.05),c-myc的AOD值与hTERT的AOD值呈正相关(r=0.633,P<0.01).结论 苦参碱对A549细胞生长抑制作用可能与下调c-myc、hTERT的蛋白表达有关.     

基因工程腺病毒H101逆转A549/DDP细胞对顺铂耐药性的实验研究

背景及目的:耐药性产生是化疗失败的主要原因之一,克服耐药性的方法之一是使用逆转剂。目前尚无一种理想的、可应用于临床的顺铂(DDP)耐药逆转剂。本研究探讨基因工程腺病毒H101对DDP耐药性的逆转作用及其机制。方法:体外利用人肺腺癌细胞株A549的DDP耐药模型A549/DDP,采用MTT法检测H101对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用。用流式细胞仪(FCM)测定细胞多药耐药蛋白1(multidrugresistantprotein1,MRP1)、谷胱甘肽鄄S鄄转移酶(GST)及TOPO鄄Ⅱ蛋白表达量,荧光鄄考马斯亮蓝法检测细胞内GSH含量,原子吸收法测定细胞内铂浓度。结果:A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为14.3。加入H101后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(IC50)由352.4μmol/L降至61.6μmol/L,逆转倍数为5.7倍。FCM检测结果显示,A549/DDP细胞的GST和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均较A549细胞高,而两种细胞内均未检测到MRP1的表达,经H101处理后的A549/DDP细胞胞内GST蛋白和TOPO鄄Ⅱ蛋白水平均明显下降。A549/DDP胞内GSH含量比A549高2倍多;H101感染A549/DDP细胞后,胞内的GSH含量下降,随着H101剂量的增加,胞内GSH含量逐渐下降,达A549细胞内GSH水平。原子吸收法测定细胞内铂含量的结果显示,A549细胞内铂含量是A549/DDP细胞内铂含量的3倍,加入H101后,A549细胞内铂的含量无明显变化,但A549/DDP细胞内铂的含量明显增加。结论:H101能逆转A549/DDP对DDP的耐药性,H101逆转DDP耐药性的机制可能是减少A549/DDP细胞内GSH和TOPOⅡ蛋白的水平,增加了A549/DDP细胞内铂的蓄积。     

重组人血管内皮抑素逆转人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性研究

目的探讨重组人血管内皮抑素(rh-ES)对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用.方法采用人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP作为研究对象,以顺铂(DDP)与重组人血管内皮抑素两者联合及单独给药的方式分别作用于人肺腺癌细胞株A549及耐药细胞株A549/DDP,作用时间72 h,观察不同给药方式造成的同株细胞之间耐药性的不同及不同株细胞间耐药性的差别,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测重组人血管内皮抑素对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用.结果DDP对A549细胞半数抑制浓度(IC50)为(0.72±0.05)μg/ml,对A549/DDP的IC50为(11.54±0.64)μg/ml.rh-ES联合DDP对A549/DDP的IC50为(2.0±0.1)μg/ml.逆转倍数(RF)为5.77,相对逆转率(RRR)为88.2%.结论重组人血管内皮抑素能逆转A549/DDP对DDP的耐药性.     

克隆肺腺癌亲代细胞A_(549)与耐顺铂细胞A_(549)~(DDP)耐药相关基因的差异表达片段

目的　克隆肺腺癌耐药相关基因。方法　以mRNA差异显示技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A54 9DDP及其亲代细胞A54 9基因表达的差异。差异表达基因片段被克隆并经Northernblot证实。结果获得 4个基因表达的差异cDNA片段 ,经测序、同源性分析 ,其中 2个片段 (A1、D1)在GeneBank中未发现同源序列 ,一个片段 (A2 )与白介素 1β转化酶 (Interleukin 1βconvertingenzyme ,ICE) 89%同源性 ,一个片段 (D2 )与MM45srRNA(Mousemusculus 45spre rRNA)基因 10 0 %同源。A1、A2 cDNA片段仅表达于A54 9细胞 ,D1、D2 cDNA片段仅表达于A54 9DDP细胞。结论　应用mRNA差异显示技术获得 4个肺腺癌A54 9与A54 9DDP间的基因差异表达片段。 2个新的差异表达片段以及与ICE、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

胰腺良恶性病变组织中hTERT表达及临床病理意义

 目的　研究胰腺良恶性病变组织中人端粒酶反转录酶hTERT表达意义。方法　石蜡包埋切片ABC免疫组化法。结果　慢性胰腺炎阳性率和评分明显低于癌旁上皮和胰腺癌 ,癌旁上皮也明显低于胰腺癌 ,阳性表达慢性胰腺炎或癌旁上皮呈不典型增生。高分化腺癌和未转移癌阳性率和评分均明显低于低分化腺癌和转移癌。结论　hTERT表达与胰腺癌发生及生物学行为存在密切关系 ,检测良性病变hTERT表达对预防和早期发现胰腺癌可能有临床应用价值     

肺腺癌细胞系耐药及凋亡相关基因的表达和逆转

目的 探讨顺铂耐药肺腺癌细胞系Ａ５４９＾ＤＤＰ的耐药,凋亡相关基因的表达及其与亲代细胞Ａ５４９的差异,观察差异表达基因的反义寡核苷酸的逆转作用。方法 将人工合成的反义,正义硫代脱氧寡核苷酸（Ｓ－ｏｌｉｇｏｄｌｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,Ｓ－ＯＤＮ）经脂质体包后转染Ａ５４９＾ＤＤＰ细胞,应用ＲＴ－ＰＣＲ检测耐药及凋亡相关基因ｍＲＮＡ水平,免疫细胞化学及流式细胞－抗体检测相应蛋白及增殖抗原Ｋｉ－６７     

骨肉瘤端粒酶逆转录酶的定性与定量检测及其意义

目的 对骨肉瘤中人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达进行定性及定量检测,探讨hTERT在骨肉瘤中的表达及意义.方法 用免疫细胞/组织化学法分别定性检测人宫颈癌细胞株HeLa、人骨肉瘤细胞株U2-OS、MG-63、SAOS-2及15例骨肉瘤组织中hTERT的表达情况;用蛋白印迹法(Western-blot,WB)定量检测上述细胞株及7例骨肉瘤组织中hTERT的表达情况.结果 免疫细胞/组织化学显示,HeLa细胞hTERT表达率最高(95.16%);MG-63、SAOS-2、U2-OS细胞系中hTERT阳性率分别为8.75%、5.26%、2.33%;骨肉瘤组织中hTERT表达阳性率26.7% (4/15).蛋白印迹法显示,Hela、MG-63及两个骨肉瘤样本(OS1和OS2)有hTERT表达,U2-OS及SAOS-2中几乎没有hTERT表达.结论 hTERT在骨肉瘤中表达很低,可能无法成为骨肉瘤的临床治疗靶点.     

肺癌组织端粒酶活性的定量研究及其临床意义

目的 研究肺癌组织中端粒酶活性的表达及其临床意义。方法 采用定量放射端粒重复序列扩增法（ＴＲＡＰ）检测７４例肺组织中（４５例为ＮＳＣＬＣ,１５例ＳＣＬＣ,结核７例,炎性假瘤７例）端粒酶的活性。结果 ＮＳＣＬＣ端粒酶阳性率为７３．３％,且活性较弱（１７２ＴＰＧ）,ＳＣＬＣ端粒酶的阳性率为９３．３％,且活性较强（２８８ＴＰＧ）。结核与炎性假瘤端粒酶 性全为阴性,ＳＣＬＣ端粒酶活性显著高于ＮＳＣＬＣ（Ｐ