重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列，设计、合成、筛选特异性引物和探针，建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测敏感性；分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增，评价其检测特异性；通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增，初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法，其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板，该方法最低检出限为10 拷贝/μL；以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板，该方法最低检出限为3 pg/μL；以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板，检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本，具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

重组酶介导的华支睾吸虫特异性核酸等温扩增方法的建立及初步评价

目的　建立一种可用于华支睾吸虫检测的重组酶介导的等温核酸扩增方法（RAA）。方法　以华支睾吸虫18S rRNA基因序列作为靶序列,设计、合成、筛选特异性引物和探针,建立快速检测华支睾吸虫的荧光RAA检测方法。分别以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒和不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩虫、曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性;通过抽提含华支睾吸虫虫卵的粪便及含囊蚴的淡水鱼肉样本DNA并进行荧光RAA扩增,初步评价其检测现场样本的能力。结果　成功建立了华支睾吸虫检测荧光RAA法,其可在39 ℃ 20 min内实现对华支睾吸虫DNA的特异性扩增。以含不同拷贝数DNA片段的重组质粒为模板,该方法最低检出限为10 拷贝/μL;以不同浓度华支睾吸虫基因组DNA为模板,该方法最低检出限为3 pg/μL;以似蚓蛔线虫、细粒棘球绦虫、日本血吸虫、十二指肠钩蚴及曼氏血吸虫基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。该方法可成功检出感染华支睾吸虫的人体、大鼠粪便样本以及麦穗鱼样本,具备较好的现场样本检测能力。结论　成功建立了一种简便、快速、敏感、特异的可用于华支睾吸虫检测的RAA法。     

淡水鱼华支睾吸虫囊蚴 LAMP 检测方法的建立

目的 建立一种高效灵敏的环介导等温扩增(LAMP)方法检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴。 方法 以华支睾吸虫 ITS2 基因序列为靶序列,合成 Cs-1、Cs-2、Cs-3 三组 LAMP 引物体系。 以华支睾吸虫囊蚴 DNA 样本为模板,日本血吸虫成虫、带绦虫成虫、蛔虫虫卵及其他吸虫囊蚴 DNA 样本为参考,比较三组引物体系的特异度;以不同浓度的华支睾吸虫成虫基因组 DNA 为模板,比较三组引物体系的灵敏度;用 LAMP 法及 PCR 法平行检测 16 份华支睾吸虫囊蚴样本和 23 份其他吸虫囊蚴样本,评价 LAMP 法的敏感性和特异性。 结果 三组引物体系的灵敏度及特异度以 Cs-3 为最优,以其建立的 LAMP 法反应体系,检测华支睾吸虫成虫 DNA 的最低检出浓度可达到 3. 33×10^-4ng / μL,敏感性和特异性与 PCR 法一致,均为 100%。 结论 成功建立了一种可用于检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的 LAMP 方法,为淡水鱼寄生虫病监测工作提供了便捷高效的检测手段。     

基于重组酶介导等温扩增技术的细粒棘球绦虫核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的细粒棘球绦虫核酸检测方法。方法　针对细粒棘球绦虫12S rRNA基因序列片段,设计、筛选并合成RAA特异性扩增引物和荧光检测探针,构建细粒棘球绦虫荧光RAA检测方法。分别以含靶序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度细粒棘球绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;分别以细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了细粒棘球绦虫荧光RAA检测法,在39 ℃条件下20 min内可以实现对细粒棘球绦虫基因组DNA特异性扩增,最低可以检测出10拷贝/μL含靶序列的重组质粒DNA和0.1 ng/μL细粒棘球绦虫基因组DNA样本,具备较高敏感性;对多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩虫、华支睾吸虫、牛带绦虫、曼氏迭宫绦虫、猪带绦虫基因组DNA均无阳性扩增,具备较高特异性;且该荧光RAA法可成功检出细粒球绦虫包囊中DNA。结论　成功建立了一种快速、灵敏、特异的可用于细粒棘球绦虫核酸检测的荧光RAA法。     

江门地区两种淡水鱼华支睾吸虫感染情况调查

目的了解江门地区鲩鱼和鳙鱼两种常见食用淡水鱼华支睾吸虫囊蚴的感染情况。方法用人工消化法对鱼肉进行处理,显微镜下检查和计数鱼肉中的华支睾吸虫囊蚴。结果在江门市的蓬江区、新会区和鹤山市三地共检查鲩鱼484条,阳性232条,华支睾吸虫感染率47.93%,阳性鱼平均感染度为6.69个/尾;在蓬江区和新会区共检查鳙鱼286条,阳性45条,华支睾吸虫感染率15.73%,阳性鱼平均感染度为2.27个/尾。结论江门地区的鲩鱼和鳙鱼华支睾吸虫感染严重,鲩鱼感染率高于鳙鱼。蓬江区、新会区和鹤山市三地间淡水鱼的华支睾吸虫感染率也存在差异。     

基于重组酶介导核酸等温扩增反应的曼氏血吸虫 基因检测方法的建立

目的　建立一种可用于曼氏血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法（Recombinase?aided amplification, RAA）。方法　以曼氏血吸虫121 bp高重复基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立并优化荧光RAA法反应体系。分别以不同拷贝数的含121 bp基因片段的重组质粒及不同浓度曼氏血吸虫基因组DNA为模板进行荧光RAA法扩增,评价该方法的敏感性;分别以日本和埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,评价其特异性。结果　建立的荧光RAA法可在39 ℃、20 min内特异性扩增曼氏血吸虫基因组DNA。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/μL;以基因组DNA为模板,荧光RAA法最低可检测浓度为0.1 fg/μL。以日本血吸虫虫卵、埃及血吸虫虫卵、十二指肠钩虫虫卵、华支睾吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA法检测,结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于曼氏血吸虫DNA检测的荧光RAA法,该方法反应快捷、操作简便,敏感性和特异性均较好。     

重组酶介导的等温核酸扩增技术检测多房棘球绦虫方法的建立及初步应用

目的基于重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase-aided isothermal amplification assay,RAA)建立一种快速检测多房棘球绦虫的核酸检测方法,并进行检测效果评价。方法以多房棘球绦虫线粒体基因序列(GenBank登录号:AB018440)作为靶序列,根据RAA反应原理设计并合成引物,利用该引物进行RAA扩增。以聚合酶链反应(PCR)作为平行对照,应用RAA方法扩增不同稀释浓度的多房棘球绦虫基因组DNA及梯度稀释的含不同拷贝数目的基因片段的pMD19-T(Simple)克隆质粒,以评价RAA检测的敏感性。应用此方法检测细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA,以评价其特异性。在对建立的方法进行条件优化后,检测9份感染多房棘球蚴的动物组织样本、3份模拟现场多房棘球蚴感染阳性犬粪样本以及2份现场阳性犬粪样本,以验证所建立的RAA方法的可靠性和实用性。结果所建立的RAA法可在40 min内特异性扩增多房棘球绦虫目的基因片段。以多房棘球绦虫基因组DNA为模板,RAA法最低检测量为10 pg;以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为10^4个。以细粒棘球绦虫(G1型)、牛带绦虫、亚洲带绦虫、多头带绦虫、犬复孔绦虫、犬弓首蛔虫、毛首鞭形线虫、蓝氏贾第虫、肝片吸虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫以及华支睾吸虫基因组DNA为模板,应用所建立的RAA法扩增结果均为阴性。应用本研究建立的RAA法检测感染多房棘球蚴的动物组织样本以及模拟和现场阳性犬粪便样本结果均为阳性,且与PCR法检测结果一致。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA检测方法,其在多房棘球绦虫虫种鉴定以及棘球蚴病基因诊断方面展现出较好应用前景。     

两种检测华支睾吸虫囊蚴方法的比较

目的 比较肌肉压片法和消化法检测野生淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的检出率.方法 从华支睾吸虫病重流行区广西横县旺天塘采集野生淡水鱼样本,分别采用肌肉压片法和消化法检测每尾鱼感染华支睾吸虫囊蚴情况.计算华支睾吸虫囊蚴的检出率,采用配对卡方检验对2种方法的检出率进行比较.结果 共检测了210尾鱼,总检出率为36.67％(77/2...     

黑龙江省佳木斯地区华支睾吸虫第二中间宿主的调查

1986年5月间佳木斯地区绥宾农场船队曾发生华支睾吸虫病爆发流行。1987年7月,作者对该地区敖来河的鱼体囊蚴进行了现场调查,共采集15种378尾淡水鱼,首先进行定性调查,用鱼肉压气法镜检查华支睾吸虫囊蚴,有此囊蚴者为阳性,结果发现麦穗鱼、青鳉、黑龙江鰟鲏、鲈塘鳢、鳉鱼、鲫鱼、船丁子和泥鳅等9种鱼华支睾吸虫囊蚴阳性,阳性率为62.9％(238/378),其中麦穗鱼和青鳉感染率最高为100％;感     

大连市华支睾吸虫感染情况调查

调查大连市华支睾吸虫感染情况。结果淡水鱼华支睾吸虫囊蚴阳性率为14．84％；401人病原学检查和73份血清学检测均为阴性。表明该市大河村复州河流域淡水鱼有华支睾吸虫寄生，未发现人群华支睾吸虫感染。     

基于重组酶介导等温扩增技术的广州管圆线虫 核酸检测方法的建立

目的　建立一种基于重组酶介导等温扩增技术（RAA）的广州管圆线虫核酸检测方法。方法　选择广州管圆线虫内转录间隔区1（ITS1）基因序列作为靶基因序列,设计、合成并筛选出特异性最强的引物和探针,构建用于广州管圆线虫核酸检测的基础及荧光RAA检测方法。分别以含检测靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒以及不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测敏感性;分别以广州管圆线虫、曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测特异性。结果　成功建立了用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,该方法可在37 ℃ 20 min内对广州管圆线虫特异性DNA片段实现实时扩增。以含靶基因片段序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度广州管圆线虫基因组DNA为模板时,该法最低检出限分别为10拷贝/μL重组质粒和100 pg/μL基因组DNA;以曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫及小管福寿螺和藁杆双脐螺螺体基因组DNA为模板,检测结果均为阴性。结论　成功建立了一种可用于广州管圆线虫核酸检测的荧光RAA法,其检测简便快速,具备较好的敏感性和特异性。     

安徽省部分地区淡水鱼华支睾吸虫感染状况调查分析

目的 了解安徽省部分地区淡水鱼华支睾吸虫感染状况,为华支睾吸虫病的防控提供参考。方法 2019—2021 年,在安徽省当涂县、和县、泾县、寿县、濉溪县、太和县及灵璧县等 7 个县的养殖、流通及餐饮环节中采集淡水鱼样本。在不同采样环节,每个采样地点每次采集所获得某一种淡水鱼的总和即为1份样本,每份淡水鱼采样重不少于500 g。通过消化镜检法、聚合酶链式反应(PCR法)及环介导等温扩增技术(LAMP法)平行检测每份样本中的华支睾吸虫,计算阳性份数检出情况。结果 2019—2021年在安徽省39个淡水鱼华支睾吸虫感染调查点共采集淡水鱼样本 298 份,涉及淡水鱼 51 种,包括麦穗鱼、棒花鱼、餐条等小型鱼种及鲢鱼、鳙鱼、草鱼等大型鱼种。2019—2021 年,安徽省淡水鱼华支睾吸虫调查点阳性份数检出率分别为 8.16%(8/98)、3.65%(5/137)和 7.93%(5/63);7 个调查县中有 6 个县淡水鱼样本检出华支睾吸虫,阳性份数检出率以当涂县和灵璧县较高,分别为 11.54%(3/26)和 11.11%(2/18)。养殖、流通及餐饮环节淡水鱼样本均检出华支睾吸虫,其中流通环节样...     

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。     

PCR和实时荧光PCR法检测华支睾吸虫的比较研究

目的 利用PCR技术建立快速、灵敏、特异的检测华支睾吸虫的方法,并比较PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性,探讨其在华支睾吸虫检测中的应用价值.方法 根据华支睾吸虫的特异性基因序列,设计了PCR引物及实时荧光PCR的特异性引物和探针,分别进行灵敏性和特异性实验.结果 设计的引物能够扩增华支睾吸虫DNA,而且探针的特异性很高.实时荧光PCR对华支睾吸虫的检测阈值为3 fg/μl,灵敏度比PCR高两个数量级.结论 PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性均很高,操作简便,为华支睾吸虫的检测提供了有效的技术手段和方法.     

咸宁市淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴情况调查

目的了解目前咸宁市常见食用淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的情况,为华支睾吸虫病的预防和健康教育工作提供依据。方法从咸宁市区不同的方位随机选取4个集贸市场,在每个市场购买市民经常食用的淡水鱼进行检测,包括:鳙鱼、鲫鱼、团头鲂(武昌鱼)、麦穗鱼,用胃蛋白酶消化法检测鱼肉中华支睾吸虫囊蚴。结果共检查鳙鱼76尾、鲫鱼87尾、团头鲂(武昌鱼)92尾、麦穗鱼189尾,华支睾吸虫囊蚴阳性率分别为23.68%、43.68%、39.13%和75.13%,阳性鱼平均感染度(个/尾)分别为15.11、9.97、10.06和48.25。结论咸宁市区的淡水鱼中存在一定程度的华支睾吸虫感染,其中麦穗鱼的感染情况较严重。     

唐山市淡水鱼华支睾吸虫囊蚴感染状况调查

目的了解唐山市淡水鱼华支睾吸虫囊蚴感染情况。方法用直接压片法和人工消化法对唐山市集贸市场的7种淡水鱼进行检查。结果共调查陡河水库淡水鱼563条,阳性267条,感染率为47.42%,其中以麦穗鱼感染率最高,为83.41%(191/229),白条鱼感染率为40.00%(70/175),褐菖蚰为12.82%(5/39),鲫鱼为2.20%(1/45),黄颡鱼、鲤鱼和银飘鱼未检出华支睾吸虫囊蚴感染。结论唐山市淡水鱼有不同程度的华支睾吸虫囊蚴感染。     

江西省信丰县华支睾吸虫病和防治相关知识知晓情况调查

目的 了解江西省信丰县华支睾吸虫病和防治相关知识知晓情况,为开展华支睾吸虫病防治工作提供科学依据。方法 以吃“鱼生”习惯为线索调查信丰县华支睾吸虫病潜在流行区,2016年开展人群粪检,并检测淡水鱼囊蚴及淡水贝类雷蚴、尾蚴,同时检查猫、犬和猪等保虫宿主粪便。对华支睾吸虫病防治知识知晓情况进行问卷调查。 结果 信丰县26个村的居民有生食淡水鱼习惯,吃“鱼生”者占调查人数的19.51%,其人群平均华支睾吸虫感染率为21.56%,纹沼螺华支睾吸虫感染率为0,淡水鱼华支睾吸虫感染率为8.24%,保虫宿主华支睾吸虫平均感染率为2.27%。人群华支睾吸虫感染率随年龄升高而呈现上升的趋势,吃“鱼生”与人群华支睾吸虫感染率呈正相关（r = 0.88,P < 0.01）。仅有11.46%的调查对象了解吃“鱼生”会感染华支睾吸虫,知道华支睾吸虫对身体有危害者仅占5.28%。 结论 信丰县5个乡（镇）26个村为华支睾吸虫病流行区;加强华支睾吸虫病危害和感染途径的健康教育、逐步改变居民吃“鱼生”的习惯是控制当地华支睾吸虫病流行的根本措施。     

PCR和实时荧光PCR方法检测华支睾吸虫

目的利用PCR技术建立快速、灵敏、特异的检测华支睾吸虫的方法，比较PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的灵敏性和特异性，探讨其在华支睾吸虫检测中的应用。方法根据华支睾吸虫的特异性基因序列，设计了PCR引物及实时荧光PCR的特异性引物和探针，分别进行灵敏性和特异性试验。结果设计的引物能够扩增华支睾吸虫，而且探针的特异性很高。实时荧光PCR对华支睾吸虫的最低检测浓度为3fg/ul，实时荧光PCR的灵敏性比常规PCR高2个数量级。结论PCR和实时荧光PCR检测华支睾吸虫的准确性和特异性均高，操作简便，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。     

山东省金乡县华支睾吸虫动物宿主感染调查

华支睾吸虫属后睾科，支睾吸虫属，人体感染是因食生或未煮熟的含有其囊蚴的鱼、虾而引起。淡水螺与淡水鱼、虾分别是华支睾吸虫的第一、二中间宿主，已报告有8种螺、132种鱼和3种虾可充当华支睾吸虫的中间宿主；猫、狗、猪、狐狸、獾等哺乳动物系华支睾吸虫常见的保虫宿主。金乡县曾有华支睾吸虫病流行，1987年后人群感染率大幅下降。为掌握金乡县华支睾吸虫病传播因素，     

华支睾吸虫不同发育阶段miRNA表达谱分析北大核心CSCD

目的检测华支睾吸虫不同发育阶段微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱,分析其生物学特征,探索其在华支睾吸虫发育过程中的潜在作用。方法使用高通量测序技术系统分析华支睾吸虫虫卵、嚢蚴和成虫3个不同发育阶段miRNA的表达情况,鉴定阶段特异性的miRNA,并经RT-qPCR对测序结果进行分析和验证。结果本研究在成虫中总共鉴定出53个已知miRNAs,虫卵55个已知miRNAs,嚢蚴53个已知miRNAs,其中在3个阶段中均表达的已知miRNAs有52个,只有1个已知miRNA(new_miR-006)仅在虫卵中表达。成虫、虫卵、嚢蚴3个阶段分别预测出99、92、108个新miRNAs,其中在3个阶段均表达的新miRNAs有66个。成虫,虫卵、嚢蚴3个阶段特异性表达的miRNAs分别是7、10、26个。随机选择10个miRNAs进行RT-qPCR验证,均与测序结果相一致。结论华支睾吸虫成虫、虫卵和嚢蚴miRNA表达谱不同,均存在期特异性表达的miRNAs,这些miRNAs可能在华支睾吸虫的不同发育阶段发挥调节作用。