蛋白激酶C亚型在原代培养神经元生长中的作用

目的　探讨PKC不同亚型在原代培养脊髓神经元突起生长中的作用。　方法　采用免疫组织化学技术研究蛋白激酶C(PKC) 4种亚型 (α、βⅠ、βⅡ和ε)在胎鼠脊髓原代培养神经元突起生长过程中的表达与分布 ,借助计算机图像分析系统同步测定突起长度和胞体面积。　结果　原代培养神经元生长过程中 ,7d前随着PKC 4种亚型的表达逐渐增加 ,神经元胞体逐渐长大及突起逐渐延长 ;7d以后无论在胞体还是突起中 ,PKC 4种亚型的表达均下降 ,突起开始萎缩 ,胞体内出现空泡。相关分析发现 βⅡ亚型与突起生长关系最密切 (r =0 73,P <0 0 1)。 　结论　PKC可能参与了神经元的生长过程 ;βⅡ型PKC在培养脊髓神经元突起生长中的作用较为重要     

中药髓复康对损伤后的脊髓神经元的保护作用

为了研究“髓复康”在体外培养中是否具有一定的神经元保护作用 ,本研究采用原代培养胎鼠脊髓神经元 ,分别将高浓度的髓复康 ( 10μl/ ml)、低浓度的髓复康 ( 5μl/ ml)与体外培养 5 d的原代脊髓神经元共同孵育 2 4h,空白对照组不加中药只加入等量的培养液。选用 10 0 μmol/ L的谷氨酸作用于细胞 1h,建立谷氨酸诱导原代脊髓神经元凋亡的细胞培养模型 ,采用酶学方法( MTT法 )评价神经元损伤程度。结果表明 ,髓复康组神经元线粒体内的琥珀酸脱氢酶的活性明显地高于空白对照组 ,组间有极显著的差异 ( P<0 .0 0 1)。提示 ,“髓复康”可以部分地抑制谷氨酸的兴奋性神经毒性作用     

5-HT受体亚型在原代培养大鼠脊髓背角神经元的表达

为探讨脊髓背角内 5 -HT发挥作用的受体类型及其胞内信号转导机制 ,本研究首先利用免疫荧光技术对胎鼠脊髓背角神经元的产率进行了观察 ,再利用反转录 PCR方法观察了 5 -HT受体 14种亚型 m RNAs在原代培养神经元中的表达。原代培养的背角神经元生长状态良好 ,存活时间达到 14～ 2 1d。对培养的背角细胞用神经元特异性标志物—神经细胞核蛋白 (Neu N)进行免疫荧光检测的结果表明 ,神经元的产率超过 90 % ;用 PCR方法在培养的背角神经元中检测到了 5 -HT1 A、5 -HT1 B、5 -HT1 D、5 -HT1 F、5 -HT2 A、5 -HT2 C、5 -HT3、5 -HT4 、5 -HT5A、5 -HT5B、5 -HT6 和 5 -HT7等受体亚型 m RNAs的表达。但上述各受体亚型的表达水平存在差异 ,未检测到 5 -HT1 E和 5 -HT2 B受体亚型 m RNAs的表达。结果表明 ,本研究建立的实验方法可满意地获得原代培养脊髓背角神经元 ;这些神经元不但表达多种受体亚型 ,而且表达类型与以往在成年大鼠脊髓背角观察到的表达状况基本一致。上述结果为进一步开展 5 -HT作用机制的体外研究奠定了基础。     

用BrdU标记技术观察大鼠脊髓上胸段灰质细胞的分化发育

目的 观察脊髓灰质细胞的分化发育,寻找脊髓移植时胎鼠脊髓取材的最佳时间。方法 用５－溴－２脱氧尿嘧啶（ＢｒｄＵ）标记ＤＮＡ,ＡＢＣ免疫细胞化学方法观察大鼠上胸段脊髓灰质细胞的增殖分化情况。结果 孕鼠于Ｅ１０ｄｅ腹腔注射ＢｒｄＵ,胎刀脊髓上胸段ＢｒｄＵ免疫反应神经元主要集中在脊髓后角,脊髓侧角的ＢｒｄＵ免疫反应神经元较少,前角仅有少量的ＢｒｄＵ免疫反应神经元;孕鼠于Ｅ１１ｄ腹腔注射ＢｒｄＵ,胎鼠脊髓     

肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧时p53表达的影响

本研究目的是观察缺氧时肌源神经营养因子(MDNF)对体外培养的大鼠脊髓运动神经元p53蛋白表达的影响。从成鼠和胎鼠骨骼肌中提取MDNF。在胎鼠脊髓运动神经元培养第7 d时将其分成对照组和实验组(包括成鼠MDNF组和胎鼠MDNF组),取100μl MDNF(0.1μg/ml)加入培养大鼠脊髓运动神经元的培养液中,对照组加入等量的PBS。然后用液体石蜡封闭液面造成神经元缺氧损伤,缺氧3 d后,应用Nissl染色、原位末端标记、免疫组化方法,对损伤的大鼠脊髓运动神经元进行检测。结果表明:培养的大鼠脊髓运动神经元缺氧3 d后,经MDNF孵育可使脊髓运动神经元TUNEL、p53表达均较对照组明显减弱,神经元损伤程度减轻,神经元存活数明显高于对照组,且胎鼠MDNF的效果更好。提示:大鼠脊髓运动神经元缺氧后可出现神经细胞凋亡,但胎鼠MDNF较成鼠MDNF更能减弱缺氧时脊髓运动神经元p53的表达,抑制缺氧后神经元的死亡。     

人胎脊髓内源性物质对脊髓中GABA神经元的营养作用

目的:从人胎脊髓提取液中寻找对脊髓GABA神经元有神经营养作用的成分。方法:用四月龄人胎制备脊髓提取液,加人体外培养的胎鼠脊髓细胞中,观察提取液对神经元活性、突起生长和分化的影响。结果:人胎脊髓中有提高GABA神经元活性的营养成分,并且小于10kD组分还可以诱导GABA神经元的分化,但是提取液对GABA神经元的突起生长没有影响。结论:实验结果揭示人胎脊髓中可能存在不止一种神经营养活性成分,对GABA神经元的活性和分化起营养作用。     

中药补阳还五汤对脊髓神经元的保护作用

目的 研究“补阳还五汤”在体外培养中是否具有一定的神经元保护作用。方法 本研究采用原代培养胎鼠脊髓神经元，分别将高浓度的补阳还五汤（20μl／ml）、低浓度的补阳还五汤（10μl／ml）与体外培养5d的原代脊髓神经元共同孵育24h，空白对照组不加中药只加入等量的培养液。选用100μmol／L的谷氨酸作用于细胞1h，建立谷氨酸诱导原代脊髓神经元调亡的细胞培养模型，采用酶学方法（MTT法）评价神经元损伤程度。结果 补阳还五汤组神经元线粒体内的琥珀酸脱氢酶的活性明显地高于空白对照组，组间有极显著的差异（P〈0．001）。结论 “补阳还五汤”可以部分地抑制谷氨酸的兴奋性神经毒性作用。     

蛋白激酶C的活性改变对脊髓原代培养神经元突起生长影响的研究

本实验利用神经细胞培养技术 ,在培养基中加入影响蛋白激酶 C活性的因素 ,用同位素和免疫组化方法观察蛋白激酶C总活性以及其亚型分布改变后大鼠脊髓原代培养神经元突起生长状态所发生的改变。结果表明 :蛋白激酶 C活性变化与神经突起生长之间呈正相关关系     

胎鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定

为了建立SD大鼠大脑皮质神经元的分离、培养及免疫细胞化学鉴定技术,本研究通过分离孕15 d SD胎鼠大脑皮质组织,经机械吹打后,加入含有5％马血清、5％小牛血清的MEM培养基接种在24孔培养板中进行原代培养,并于第3 d在培养基中加入阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长,于第9 d将细胞固定后采用免疫细胞化学技术检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果表明从孕15 d SD胎鼠大脑皮质分离的神经元纯度高,生长旺盛,形态典型,90％以上表达NSE免疫阳性。该结果提示我们建立的培养大鼠大脑皮质神经元的方法易于标准化操作,结果稳定,值得推广应用。     

胚鼠大脑皮层神经元培养方法的改进

目的建立一种简单、高效的胚鼠大脑皮层神经元原代培养的方法。方法17d胎鼠大脑皮质,直接机械切碎后经200目滤网研磨过滤,得到细胞悬液进行培养。结果神经元生长良好。相邻细胞的突起交错形成网络,鉴定神经元纯度为（94．7±5．6）％。结论本方法简单可行。可以获得高纯度的胚鼠大脑皮层神经元。     

小鼠脊髓前角运动神经元的分离、培养和鉴定

目的:探讨一种分离小鼠脊髓前角运动神经元的方法,为运动神经元相关的研究提供依据。方法:分离13 d的C57BL/6胎鼠脊髓,利用Optiprep分离液经密度梯度离心获得脊髓前角运动神经元,培养后观察神经元细胞形态的变化,免疫荧光双标法对分离运动神经元的纯度进行判定。结果:将分离到的运动神经元进行培养,能够观察到典型的神经元细胞形态及轴突生长。免疫荧光双标证明培养的细胞为运动神经元细胞,纯度约95%。结论:Optiprep分离液用于小鼠运动神经元的分离,可获得良好的分选效果。Optiprep分离液可用于运动神经元相关的研究。     

一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定

目的 通过将海马、皮层细胞共培养的方式建立一种低密度、高纯度、高稳定性的大鼠胎鼠原代海马神经元体外培养方法,以获取纯度更高、活力更好的原代海马神经元。方法 分离孕16～18 d SD大鼠胎鼠的海马和皮层并分别剪碎,经0.125%胰蛋白酶消化后用200目细胞筛过滤,将获得的细胞悬液以包围的形式分别接种于培养板的内层和外环上,于含10%马血清的DMEM/F12培养基中进行共同培养,4～6 h细胞贴壁后更换培养基为维持培养基培养(Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺)。通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,利用免疫荧光染色检测海马神经元纯度。结果 海马神经元在5 d后形成纵横交错的神经网络,生长状态较好,经鉴定海马神经元的纯度高达98%,且能够稳定存活3周。结论 利用海马、皮层细胞共培养的方法可以获取高纯度、高活性、高存活率、高稳定性的胎鼠原代海马神经元,可为神经系统中海马神经元相关疾病研究提供一定的实验条件。     

人胎脊髓内源性神经营养物质的分离纯化

人胎脊髓存在神经营养物质,在以往的研究中已发现它们对脊髓神经元的存活、生长及分化有营养作用。本文采用Superdex－30、反相C18HPLC以及毛细管电泳对于4月龄和8月龄人胎脊髓的神经营养物质进行了分离纯化,活性检测采用体外培养脊髓神经元-MTT方法。分离过程中发现脊髓中有远不止一种神经营养成分可以提高脊髓神经元的活性,最终分离得到一个P1为8．08的蛋白成分,对脊髓神经元的活性有显著的促进作用。     

肌萎灵注射液对大鼠原代培养运动神经元生长的影响

为了观察中药制剂肌萎灵注射液对大鼠原代培养脊髓运动神经元生长的影响,本研究采用MTT方法观察神经元活力,并通过免疫组织化学技术进行NF 200染色后图像分析测定突起长度。结果表明:浓度为0. 5% ~5%的肌萎灵注射液能增加培养神经元活力,浓度为0. 5% ~1%的肌萎灵能促进神经元突起生长。本研究结果提示:肌萎灵注射液对培养的大鼠脊髓运动神经元生长有促进作用。     

备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

目的　进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配 (手术侧 )的脊髓后角组织提取液 ,以获得某种神经营养活性物质。　方法　用 Superdex G- 75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱 (HPL C)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。　结果　手术侧脊髓后角组织提取液经 Superdex G- 75 prep grade凝胶层析和 HPL C层析后 ,得到的 A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节 (DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 ,A峰洗脱液呈现一条分子量约为 6 0 k D的蛋白质主带。　结论　结合生物活性检测结果 ,分子量约 6 0 k D的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质     

乳鼠原代成骨细胞的培养优化

目的 探讨适宜培养乳鼠原代成骨细胞的培养基配比及培养时间,为体外成骨细胞原代培养提供改良实验方案。方法 用间断酶消化法消化CD1乳鼠颅骨提取原代成骨细胞,差速离心获得纯化成骨细胞。制定诱导时间、胎牛血清、β-甘油磷酸钠盐、地塞米松浓度梯度实验,用Western blot与免疫荧光测定成骨细胞成熟标志物,通过碱性磷酸酶、茜素红染色、超微结构鉴定其成骨活性。结果 (1)间断酶消化法可从乳鼠颅骨中获得原代细胞进行增殖及传代扩增,细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。(2)成骨细胞成熟标志物表达与诱导培养时间、胎牛血清浓度成平行关系,使用10%血清培养14 d即可获得成熟成骨细胞。(3)分别在不同浓度含β-甘油磷酸钠盐及地塞米松培养液中诱导原代成骨细胞分化,于10 mmol/L β-甘油磷酸钠盐及5 nmol/L地塞米松培养条件下成骨细胞成熟标志物表达较高(P<0.01),碱性磷酸酶及茜素红染色明显,成骨活性良好。结论 CD1乳鼠颅骨提取的原代成骨细胞在含10%胎牛血清、10 mmol/L β-甘油磷酸钠盐溶液及5 nmol/L地塞米松的诱导培养基中培养,于14 d即有良好的成骨活性,...     

人胰腺导管上皮细胞的原代和传代培养

目的　完成胰腺导管上皮细胞的原代及传代培养 ,建立能够体外长期培养的胰腺导管上皮细胞系。　方法　用含有胶原酶 IA型的消化液消化分离胎儿胰腺组织为细小、均匀的细胞团进行接种 ,接种的细胞团用含10 %胎牛血清、4.0 m mol/L谷氨酰胺、0 .0 1%大豆胰酶抑制剂、0 .0 2 %牛血清白蛋白、5 .0 m g/L牛脑垂体提取物、2 .5× 10 - 3m g/L表皮生长因子、2 5 .0× 10 - 2 m g/L霍乱毒素、5 .0 mg/L胰岛素、10 .0 mg/L转铁蛋白、1.0 m g/L地塞米松、5 0 m g/L庆大霉素的完全培养基培养 2 4h后 ,换含 2 %胎牛血清的完全培养基继续培养 ,在细胞团达到 80 %～ 90 %的细胞汇合时 ,1∶ 2传代培养。　结果　获得的原代培养细胞不含有淀粉酶 ,表达细胞角蛋白 ,可初步认定为胰腺导管上皮细胞。原代培养的胰腺导管上皮细胞已传代培养到第 3代。　结论　我们的原代培养和传代培养的方法、条件适宜于胰腺导管上皮体外细胞培养。     

骨形态发生蛋白2对14 d胎鼠端脑神经干细胞分化为胆碱能神经元的影响

背景：骨形态发生蛋白2可能是参与胆碱能神经元前体细胞分化的细胞外调控因子。 目的：观察骨形态发生蛋白2在孕14 d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元过程中的作用。 方法：取孕14 d胎鼠端脑,用含EDTA的胰酶和Ⅰ型胶原酶消化,无血清培养基培养细胞,种植于涂有多聚赖氨酸的培养板,细胞原代培养24 h后半量换液,加入10 μg/L骨形态发生蛋白2继续培养。 结果与结论：胶原酶消化得到的神经干细胞呈单层贴壁生长;Nestin免疫荧光鉴定细胞为阳性,获取的神经干细胞纯度大于99%;ChAT免疫荧光鉴定骨形态发生蛋白2可以将孕14 d胎鼠端脑神经干细胞诱导成胆碱能神经元,细胞纯度大于97%。     

嗅神经鞘细胞在体外培养时对GABA能神经元的作用

目的　研究嗅神经鞘细胞 (OECs)在培养状态下对GABA能神经元的存活及突起生长的影响。　方法　用原代培养的方法 ,分别进行OECs和脊髓神经元的培养 ,培养 6d后 ,将OECs接种在Millipore细胞培养板的内嵌培养皿中 ,然后置入脊髓神经元的培养板中 ,使两者进行不接触的联合培养 ,培养进行至 6d ,分别作GABA免疫细胞化学染色 ,观察突起生长情况以及GABA阳性细胞计数。　结果　与OECs联合培养组 (实验组 )GABA能神经元存活为 39 7± 6 3,对照组为 2 7 6± 2 7(P <0 0 5 ) ,并且实验组GABA能神经元染色较对照组深 ,突起长度(6 30± 112 μm)较对照组长 (2 70± 97μm) (P <0 0 1)。 　结论　在体外培养状态下 ,OECs对GABA能神经元有明显的促进作用。     

肝细胞生长因子延长原代培养大鼠脊髓神经元的生存时间

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对原代培养脊髓神经元的保护作用。方法原代培养脊髓神经元转染不同滴度的绿色荧光蛋白或肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-GFP or Ad-HGF),用流式细胞仪检测转染率,PI-Hoechst双染色观察神经元生长状况。用ELISA、中性红、MTT和NSE-ELISA等方法分别检测Ad-HGF转染脊髓神经元后HGF的表达,以及HGF对神经元的保护和迁移作用。结果在转染复数(MO I)为50时,Ad-GFP可高效转染脊髓神经细胞,且细胞生长状态好。转染Ad-HGF后,HGF能有效表达,同时HGF作用后的神经元活性明显高于对照组(P<0.05)。并观察到HGF对脊髓神经元有明显促迁移作用。结论HGF对体外培养的脊髓神经元有保护和迁移作用。