bFGF对hBMSCs增殖及成软骨能力影响的实验研究

目的探索碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)增殖和成软骨能力的影响,并确定适用于hBMSCs体外软骨构建的细胞代次。方法获取hBMSCs,分别用DMEM和DMEM+bFGF培养基进行培养。两组细胞均传代至第4代,比较两组各代次hBMSCs的形态变化、细胞得率;取第3代细胞,用pellet法体外成软骨诱导培养3周,观察两组pellet大体观并进行Ⅱ型胶原染色。在上述实验基础上,取hBMSCs用DMEM+bFGF培养基进行培养,1∶3传代培养至第8代,观察各代次细胞的形态变化;对各代次pellet体外成软骨诱导培养3周后,行大体观察并进行Ⅱ型胶原染色。结果 DMEM+bFGF培养体系下的细胞形态、细胞得率及成软骨能力等方面均优于DMEM组。DMEM+bFGF培养体系下,按照1∶3传代的细胞传至第6代仍能维持较好的细胞形态;第1~4代细胞均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,第5及后续代次的细胞成软骨能力较差。结论 bFGF可明显促进hBMSCs增殖,并可更好地维持hBMSCs的成软骨能力,在该培养体系下的第1~4代细胞适用于体外软骨构建。     

三种亚型软骨组织来源干细胞的分离培养及鉴定

目的分离培养猪不同亚型软骨组织(弹性软骨、透明软骨以及纤维软骨)来源干细胞并鉴定,为软骨组织工程提供理想种子细胞。方法利用纤维连接蛋白黏附法分别从猪耳软骨、关节软骨以及椎间盘软骨中分离培养干细胞,并进行传代。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达水平(阳性标志物CD29、CD90及阴性标志物CD34、CD45),单克隆形成实验鉴定软骨干细胞单克隆形成能力。三向诱导分化鉴定软骨来源干细胞的成软骨、成骨及成脂多向分化潜能。RT-PCR检测成骨(Ⅰ型胶原、Ⅹ型胶原)、成软骨[蛋白聚糖(Aggrecan)、II型胶原]、成脂[脂联素(Adiponectin)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)]相关基因表达,并以猪BMSCs作为对照。结果通过纤维连接蛋白黏附法分别从耳软骨(弹性软骨)、关节软骨(透明软骨)、椎间盘软骨(纤维软骨)分选出一群细胞,细胞高表达干细胞表面阳性标志物CD29、CD90,几乎不表达干细胞表面阴性标志物CD34、CD45。经过体外2周培养,单个细胞均能形成细胞克隆。三向诱导分化显示软骨来源的干细胞具备成软骨、成骨和成脂分化能力。RT-PCR结果显示,成骨诱导后关节和椎间盘来源软骨干细胞的Ⅰ、Ⅹ型胶原基因相对表达量明显高于BMSCs(P0.05),耳软骨来源干细胞与BMSCs比较差异无统计学意义(P0.05);成软骨诱导后,3种亚型软骨组织来源干细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原基因相对表达量均高于BMSCs(P0.05);成脂诱导后,3种来源软骨干细胞Adiponectin及FAS基因相对表达量均低于BMSCs,但比较差异无统计学意义(P0.05)。结论不同亚型的猪软骨组织中均存在软骨干细胞,具有干细胞的典型特征。     

诱导人孤雌胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的实验研究

目的探索人孤雌胚胎干细胞在体外向类间充质干细胞诱导分化的方法 ,并鉴定所得细胞的生物学特性。方法人孤雌胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养,形成拟胚体,10d后在含血清条件下使拟胚体贴壁生长,7d后胰酶消化,所得细胞在含血清的培养液中传代、扩增。观察传代、扩增后细胞的形态学变化;用免疫荧光染色和流式细胞技术进行细胞表型分析;取第9代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,9～28d后行特殊染色及RT-PCR分析。结果人孤雌胚胎干细胞在诱导分化后,形态与骨髓间充质干细胞相似,多次扩增传代后仍保持细胞形态和扩增能力。免疫荧光染色发现,细胞表达中胚层标志波形蛋白(Vimentin)。流式细胞分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166、CD44等间充质干细胞表面标志。特殊染色及RT-PCR分析显示:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶和茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后,细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强;成脂诱导后,细胞油红染色阴性,脂蛋白酶和Leptin无表达。结论人孤雌胚胎干细胞可以诱导、分化为间充质干细胞,并具有成骨、成软骨分化潜能。     

Y-27632 对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨Rho A/ROCK通路特异性阻断剂Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法自小鼠股骨、胫骨骨髓腔分离培养小鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪细胞表面标记检测及细胞成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定小鼠骨髓单个核细胞。将第3代小鼠骨髓间充质干细胞随机分为2组,单纯成骨诱导液对照组、Y-27632干预组。分别于细胞培养后1d、2d、3d、4d收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;成骨诱导后7 d、14 d收集细胞,可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)变化;成骨诱导后24h收集细胞,western blot法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil-containing protein kinases1,ROCK1)的表达。结果流式细胞术细胞表面标志检测及成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定均证实我们所获细胞为BMSCs。与对照组相比,Y-27632能促进BMSCs增殖,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能降低ALP表达,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能明显阻断ROCK1的表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Y-27632阻断Rho A/ROCK信号通路可以促进BMSCs增殖,抑制BMSCs成骨分化。     

人增生性瘢痕成纤维细胞的间充质干细胞表型及多向分化潜能

目的 探讨人增生性瘢痕来源的成纤维细胞的细胞表型及分化潜能,以进一步研究其在增生性瘢痕形成中的作用.方法 从手术切除的增生性瘢痕中提取并分离培养成纤维细胞,以倒置显微镜观察其细胞形态及生长特点.待细胞培养传代至第3代,采用Vi-CELL细胞计数仪检测细胞生长情况,流式细胞仪检测成纤维细胞间充质干细胞表型标志CD73、CD44、CD105、CD90、CD34、CD45、CD14的表达情况;通过免疫细胞化学检测该细胞CK19、Oct 4、Vementin的表达情况及免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白;诱导分化检测细胞向成骨、成软骨和成脂细胞方向分化能力.结果 细胞原代培养初期贴壁散在分布,生长曲线显示细胞1 ～2d生长较慢,从3～5d左右细胞生长较快,6～7d细胞进入平台期;第2代第5天细胞多为长梭形,呈放射状、漩涡状排列.细胞流式结果显示细胞表型CD90、CD44、CD105、CD73呈高表达,CD45、CD34、CD14不表达;免疫细胞化学检测间充质细胞标记物Vementin、多能干细胞标志物Oct 4均呈阳性表达,免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白呈阳性表达,上皮细胞标志物CK19呈阴性表达,多向诱导分化实验该细胞可向成骨、成软骨和成脂细胞分化,具有多向分化潜能.结论 人增生性瘢痕来源成纤细胞具有间充质干细胞样生物学特性,该生物学特性可能在增生性瘢痕的形成以及创面修复中发挥至关重要的作用.     

碱性成纤维细胞因子对猪弹性软骨细胞增殖和成软骨能力的影响

目的　研究碱性成纤维细胞因子 (b FGF)对体外培养的弹性软骨细胞增殖和成软骨能力的影响 ,探讨b FGF对软骨组织工程的意义。方法　细胞取自猪耳软骨 ,用含 1 0、2 5、50 μg/L3种浓度b FGF的培养液 ,体外培养至第 3代 ,从细胞形态、数量和基质分泌等方面进行研究。结果　含b FGF组细胞贴壁呈类成纤维细胞样 ,撤去b FGF ,细胞形态可恢复正常 ;含b FGF各组在第 3代 ,细胞总数是无b FGF组的 60～ 70倍 (P <0 .0 1 ) ,但 3种不同浓度b FGF对细胞增殖差异无显著性 ;培养液氨基糖氨多糖 (GAG)含量测定各组差异无显著性 ;免疫组织化学和原位杂交示各组第 3代软骨细胞仍有Ⅱ型胶原表达。结论　应用b FGF能在 3周内从少量软骨组织获取大量软骨细胞 ,且未改变细胞表型和功能 ,对软骨组织工程有重要意义 ;在 1 0、2 5、50 μg/L 3种浓度中 ,1 0μg/L为b FGF在软骨组织工程应用中的最佳浓度     

大鼠骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化成平滑肌细胞

目的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并体外定向诱导分化成平滑肌细胞,为BMSCs移植治疗勃起功能障碍(ED)大鼠模型提供种子细胞。方法分离培养大鼠BMSCs,取第3~4代细胞,流式细胞术检测BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106、造血干细胞表面分子CD34和CD45、血管内皮细胞特异性表面分子CD31表达情况,采用平滑肌细胞诱导培养基诱导分化,通过免疫荧光检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(Desmin)进行鉴定细胞分化。结果培养细胞阳性表达BMSCs表面分子CD49d、CD73、CD90、CD105和CD106,同时造血干细胞表面分子CD34和CD45及血管内皮细胞表面分子CD31阴性表达,且经过平滑肌细胞诱导培养基诱导分化后α-SMA和Desmin免疫荧光检测均阳性反应。结论成功从大鼠骨髓中分离培养BMSCs,为BMSCs和基因修饰BMSCs移植治疗ED提供种子细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子在大鼠BMSCs向睾丸Leydig细胞分化中的作用研究

目的 :研究碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化为睾丸Leydig细胞过程中的作用,探讨BMSCs定向分化为Leydig细胞的适宜方法。方法:将经纯化鉴定的SD大鼠BMSCs第3代细胞接种于6孔板,随机分为对照组(A)、人绒毛膜促性腺素(h CG)+血小板源性生长因子(PDGF)诱导组(B)、h CG+PDGF+5.0 ng/ml b FGF诱导组(C)、h CG+PDGF+10.0 ng/ml b FGF诱导组(D)、h CG+PDGF+20.0 ng/ml b FGF诱导组(E),分别于第7、14、21天进行形态学观察、培养液睾酮水平及3β-羟化类固醇脱氢酶(3β-HSD)免疫荧光检测。结果:B、C、D、E组细胞诱导后体积变大,互相连接呈长梭形或不规则形,贴壁生长,核大、较圆,符合Leydig细胞的特点。随着时间和b FGF浓度的增加,B、C、D、E组睾酮水平逐渐升高,3β-HSD阳性表达细胞逐渐增多,C、D、E组与B组,D、E组与C组间差异有统计学意义(P均<0.05);D、E组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:b FGF在大鼠BMSCs向Leydig细胞体外诱导分化过程中有明显促进作用。     

5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究

[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响。[方法]SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3 d后成骨诱导分化14 d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达。[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达。第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P<0.05)。[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能。     

大鼠椎间盘巢源性干细胞的体外分离、培养和特性鉴定

目的:对大鼠椎间盘干细胞巢来源的干细胞(ISN-SCs)进行体外分离、培养和特性鉴定。方法:以10周龄雄性SD大鼠作为研究对象,按照解剖区域分离椎间盘干细胞巢组织(骺板外周软骨膜部分),用Ⅱ型胶原酶消化获取细胞后进行体外培养,选用第四代细胞进行干细胞相关特性的鉴定:采用流式细胞技术测定细胞周期;MTT法测定增殖曲线;流式细胞技术检测干细胞相关表型;q PCR检测干细胞相关基因的表达水平;细胞三系诱导分化培养后采用茜素红染色及钙钴染色检测成骨分化能力,阿利新蓝染色检测成软骨分化能力,油红O染色检测成脂肪分化能力,q PCR检测多向分化相关基因的表达水平。结果:大鼠ISN-SCs呈成纤维样细胞,多触角,具有贴壁能力,是一种慢周期细胞,高表达干细胞相关阳性表面抗原分子CD29、CD90、CD44,低表达干细胞相关阴性表面抗原分子CD34、CD45、CD19、CD11b;成骨诱导分化后茜素红染色和钙钴染色均为阳性,成软骨分化后阿利新蓝染色阳性,成脂肪分化后油红O染色阳性,且各分化相关基因(成骨:Runx2、OPN、OCN;成软骨:SOX-9、COL2a1、ACAN;成脂肪:PPARγ、C/EBPα)表达水平较对照组显著增高,其与骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有相似的干细胞相关基因(NANOG、SOX-2、OCT-4)表达水平。结论:ISN-SCs具备干细胞的生物学特性,在体外经诱导后可以向软骨细胞及脂肪细胞转化,可为椎间盘的自体生物学修复研究提供良好的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及体外诱导分化为成骨细胞

[目的]建立人骨髓来源的间充质干细胞( hBMSCs)分离、培养及传代的方法,观察成hBMSCs体外成骨潜能.[方法]采用全骨髓贴壁筛选法分离培养hBMSCs,流式细胞仪检测细胞表型;所得细胞第3代用含100 nmol/L地塞米松、5mmol/Lβ -甘油磷酸钠,50 μg/ml抗坏血酸的条件培养基进行骨诱导,茜素红染色鉴定.[结果]分离培养的细胞流式细胞术检测显示CD44、CD105阳性,而CD34、CD45阴性,符合MSCs特征;hBMSCs经骨诱导后可形成钙结节,茜素红染色显示阳性.[结论]全骨髓贴壁筛选法可分离获得高纯度的hBMSCs,其在体外具有成骨潜能.     

人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达

目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs,取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定;应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90,具有成脂和成骨分化潜能。成骨相关基因在诱导早期部分表达,中期均有表达,基因表达大部分在14天达高峰,与矿化相关的基因表达在21天达高峰。结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达,其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。     

不同微环境对人骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的评价不同微环境对人骨髓间充质干细胞（hBMSC）体外增殖和分化的影响。方法采用全骨髓贴壁分离法培养hBMSC,传至第3代后分别在4种微环境下培养：10％FBS组、10％CS组、1g／L植物源重组人血清白蛋白（OsrHSA）组、单纯DMEM组。采用CCK-8比色法测定细胞一周增殖率。以不加成骨诱导液为对照组,实验组添加成骨诱导液后第1周和第2周行碱性磷酸酶染色,第3周和第4周行茜素红染色,评估不同时段各组细胞成骨分化程度。结果采用单纯DMEM组培养hBMsC,细胞增殖率基本不变,后期下降;10％FBS组、10％CS组和1g／LOsrHSA组均能显著提高hBMSC增殖率（P〈O．05）,以10％FBS组效果最好。碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示,单纯DMEM组和对照组均未发现钙沉积阳性细胞;10％FBS组、10VooCS组和1g／LOsrHSA组在各阶段均出现阳性染色,随着诱导时间延长颜色明显加深;10％CS组和1g／LOsrHSA组各时间段阳性染色程度明显较10％FBS组弱,10％CS组其次,1g／LOsrHSA组最差。结论细胞外基质微环境对hBMsC生长分化至关重要,含血清的微环境能更好地促进hBMSC增殖及维持hBMSC分化特性。     

全反式维甲酸对鼠胚神经干细胞增殖和分化的作用

目的 观察不同浓度的全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)在鼠胚神经干细胞(neural stemcells,NSCs)增殖和分化中的作用,寻找促NSCs分化为神经元的较佳ATRA浓度. 方法 分离孕12～16 d(平均15 d)胚胎大鼠脑皮层,用无血清但含神经生长因子(20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF)的培养液悬浮培养,细胞接种密度为1×106/mL,7 d传代.取第3代NSCs,分别在含0.5、1.0、5.0和10.0 μmol/L ATRA(实验组,分别为A、B、C、D组)及不含ATRA(对照组,E组)的DMEM/F12完全培养基中培养,于培养第1、2、3、4、5、6及7天倒置相差显微镜下计数形成的细胞球数;于培养后1、3、5、7及9 d采用BrdU免疫荧光染色,分析各组细胞增殖效应.另取第3代NSCs,5?S培养基调整细胞密度为1×106/mL,接种至6孔板内,分别加入0.5、1.0、5.0和10.0 μmol/L ATRA,作为各实验组(即A、B、C、D组),对照组不含ATRA(E组),于培养后3、5及7 d采用免疫荧光双标染色和流式细胞仪检测各组细胞分化为神经元的比例. 结果 培养后1、2、3、4、5、6及7 d,各实验组增殖细胞球数目接近(P＞0.05),但均明显少于对照组,且差异有统计学意义(P＜0.05);各实验组在培养后1、3、5、7、9dBrdU阳性细胞球增多,组间差异无统计学意义(P＞0.05);对照组各时间点BrdU阳性细胞球明显多于实验组,差异有统计学意义(P＜0.05).各实验组ATRA促使NSCs分化为神经元的比例明显增高,NSE阳性细胞分化率各组间差异有统计学意义(P＜0.05),其中B组最高,在培养3、5、7 d分别为29.46%±0.47%、47.25%±0.46%、66.81%±0.57%,而E组NSCs主要分化为星形胶质细胞,NSE阳性细胞分化率在培养3、5、7 d分别为11.11%±0.59%、14.10%±0.32%、15.92%±0.70%.流式细胞仪检测显示,培养后3、7 d,促神经元分化比例各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 ATRA具有显著的促NSCs分化为神经元的作用,1.0 μmol/L ATRA诱导分化效果最佳.     

两种细胞因子联合应用对骨髓基质干细胞增殖和成骨活性的影响

目的 研究骨形态发生蛋白融合基因-4/7(BMP-4/7)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合应用对体外培养兔骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖和成骨活性的影响.方法 体外培养BMSCs,在第3代细胞培养液中加入不同浓度的BMP-4/7和bFGF,依据加入不同基因浓度组合的不同分为5个实验组(A组:80 ng/mL BMP-4/7,B组:80 ng/mL bFGF,C组:30 ng/mL BMP-4/7+30ng/mL bFGF,D组:50 ng/mL BMP-4/7+50 ng/mL bFGF,E组:80 ng/mL BMP-4/7+80 ng/mL bFGF)和对照组(不加任何因子),采用绘制生长曲线,甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测细胞增殖活力,碱性磷酸酶(ALP)和降钙素(OC)活性检测法比较各组间差异,观察不同浓度的BMP-4/7和bFGF联合应用对兔BMSCs增殖和成骨活性的影响. 结果 传代后第5天对照组个别单核细胞贴壁,呈长梭形;A组细胞增殖,呈旋涡状排列;B组细胞较为密集,部分融合成片;C组细胞呈集落式生长,生长旺盛;D组细胞生长密集,可见明显的钙结节;E组细胞密集,可见细胞性钙结节形成.各组OD值、ALP含量、OC含量随着作用时间的延长而增加,各组不同培养时间的OD值差异均有统计学意义(P<0.01);且C、D、E组均高于A、B组,差异均有统计学意义(P<0.05).C、D、E组内随着作用浓度的增加,细胞增殖及成骨活性增强,呈浓度依赖关系,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 合理的联合应用BMP-4/7和bFGF可促进BMSCs细胞增殖,促进成骨活性,两者对BMSCs有明显的协同增强效应.     

碱性成纤维细胞生长因子在富集结直肠癌肿瘤干细胞中的作用

目的 研究不同浓度碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作用于结直肠癌细胞不同时间,富集肿 瘤干细胞的效果。方法? 结直肠癌DLD-1细胞分别在含5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL bFGF的无血清培 养基中悬浮培养,分为G1、G2、G3组,设置培养时间梯度为10 d、20 d、30 d,获得球细胞。采用流式 细胞术（FCM）检测细胞球中的CD44+、CD133+及CD44+CD133+双阳性的细胞表达比例,Real-time PCR 检测球细胞中的干细胞基因（KLF4、Nanog）;上皮间质转化基因（E-cadherin、Snail）;Wnt/β-catenine通路 基因（Wnt-3a）的 mRNA表达情况,成球实验检测细胞球的自我更新能力。结果 FCM检测结果：CD44+ 阳性表达的细胞表达以G2组20 d最高,CD133+及CD44+CD133+双阳性的细胞表达均以G2组20 d及G3 组10 d最高,差异有统计学意义（F=98.895、147.641、13.321,P<0.05）。 Real-time PCR检测结果：各组中 KLF4、Nanog、Snail以及Wnt-3a mRNA的表达均以G2组20 d表达最高（F=2.424、7.694、2.951、3.771, 均P<0.05）, E-cadherin基因G2组20 d mRNA表达最低（G2组30 d、G1组10 d除外）（F=10.620,P<0.05）。 成球实验结果：各组比较G1组20 d和G2组20 d成球数量明显多于其他组,差异具有统计学意义（F=14.279, P<0.01）;但 G1组20 d和G2组20 d比较,无统计学差异（t=0.605,P=0.578）。 结论 碱性成纤维细胞生长 因子无血清悬浮培养能够有效富集肿瘤干细胞,其中G2组培养20 d较其余组能更有效地富集结直肠癌肿 瘤干细胞。     

成骨细胞特异性钙黏蛋白基因转染对人骨髓基质干细胞成骨分化影响的研究

目的 观测成骨细胞特异性钙黏蛋白(Cad-Ⅱ)基因转染对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)成骨分化的影响. 方法把脂质体介导的Cad-Ⅱ cDNA转染体外分离培养的hBMSCs,检测Cad-Ⅱ蛋白表达变化,并对比观测转染组和单纯成骨诱导组在培养3,7、14、21 d时,hBMSCs碱性磷酸酶(ALP)和骨钙索的表达变化. 结果 转染组和成骨诱导组3 d后开始有ALP的阳性染色,呈棕黑色,7 d开始有骨钙索的阳性染色并随培养时间延长逐渐增多,但各时间点转染组ALP浓度(P=0.008)和骨钙素染色阳性数(P=0.023)均显著高于单纯成骨诱导组.转染组和成骨诱导组从14 d后开始有红色的刚件染色矿化结节出现,结节数目随时间推移而增多. 结论 Cad-Ⅱ基因转染可促进hBMSCs向成骨细胞的分化.     

红细胞生成素对体外培养许旺细胞的作用

目的 观察促红细胞生成(erythropoietin,EPO)对体外培养许旺细胞分泌胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和细胞周期的影响,探讨EPO促进外周神经再生的可能机制. 方法 将原代培养、纯化的许旺细胞随机分成三组:A组(10%胎牛血清DMEM液)、B组(10%胎牛血清DMEM液加10U/ml EPO),C组(10%胎牛血清DMEM液加50 U/ml EPO),应用ELISA测定培养上清液中的GDNF水平,流式细胞术检测细胞周期分布. 结果 与A组相比,B组和C组培养上清液中的GDNF明显增高,许旺细胞处于S期百分比(S%)和(S+G_2M)%都有明显升高. 结论 EPO可增加体外培养许旺细胞分泌GDNF,并且能提高许旺细胞的增殖活性,这可能是其促进外周神经再生的重要机制之一.     

复方麝香注射液在人脐带间充质干细胞神经分化中的作用

目的 观察复方麝香注射液在体外对人脐带间充质干细胞(hUMSCs)神经分化的影响.方法 取足月妊娠剖宫产健康新牛儿脐带,获取间充质干细胞,采用流式细胞术进行细胞表型鉴定.以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24 h,再以含5、10、15、20、25g/L复方麝香注射液的无血清培养基进行神经分化诱导,采用免疫细胞化学检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微观相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果 流式细胞检测显示hUMSCs表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166和HLA-ABC抗原,不表达CD31、CD34、CD38、CD45、CD133和HLA-DR抗原.经不同浓度复方麝香注射液诱导5 d后,各诱导组中均出现神经样细胞.5、10、15、20、25 g/L组显微镜每随机视野中NSE阳性细胞数分别为19.00±3.61、66.60±5.37、60.20±10.06、44.80±9.44、47.80±10.45,MAP-2阳性细胞数分别为9.20±3.27、53.40±10.92、59.40±10.41、46.60±8.88、46.80±8.93.以10 g/L和15 g/L组中的NSE、MAP-2阳性细胞数为最多.各诱导组中仅极少数细胞呈GAFP弱阳性.结论 人脐带富含问充质干细胞(MSCs),适量复方麝香注射液可有效诱导人脐带间充质干细胞分化为神经元细胞.