Percoll法分离犬骨髓单个核细胞与体外成骨诱导培养的实验研究

目的建立犬骨髓单个核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMNCs)的分离培养、体外扩增和成骨诱导方法,为骨缺损的修复提供理想的骨组织工程种子细胞。方法用1.063g/ml percoll液分离2.5ml Beagle犬骨髓,利用细胞贴壁筛选法进行分离、培养、扩增和成骨诱导。结果采用1.063g/ml percoll液可获得纯度较高的BMNCs,接种细胞生长良好,平均倍增周期为1d,经成骨诱导培养后可定向分化为成骨细胞。结论采用1.063g/ml percoll液能够较好的进行Beagle犬BMNCs的分离培养和体外扩增,分离得到的细胞具备骨髓基质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的特性。     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

骨髓单个核细胞移植治疗缺血性心脏病的进展

骨髓单个核细胞包括间充质干细胞、造血干细胞和内皮祖细胞,这些细胞移植到缺血心肌后可分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞;并且可通过旁分泌和自分泌一些细胞因子促进血管新生,防止宿主细胞和移植细胞凋亡,并使内源性修复细胞归巢,修复受损的心肌。目前国内外已进行了大量应用于缺血性心脏病的试验,这些研究采用多种途径将骨髓单个核细胞植入到冠状动脉或心肌内,包括冠状动脉内注射、静脉输入、直接室壁注射、心外膜或心内膜下输入,并通过将细胞制成碎片而提高其滞留率,或应用一些细胞因子提高治疗效果。虽然目前这些临床试验结果尚存在争议,但这些方法在治疗缺血性心脏病方面仍有前景。现对骨髓单个核细胞移植治疗缺血性心脏病的机制、移植途径、骨髓单个核细胞的滞留、归巢、存活和展望等进行综述。     

纳米组织工程骨与兔骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的探讨纳米组织工程骨(NHAC)与兔骨髓基质干细胞(RMSCs)体外生物相容性,为应用组织工程方法修复骨缺损提供依据。方法将RMSCs与NHAC体外复合培养,进行形态学和功能测定。结果骨髓基质干细胞能在纳米组织工程骨上良好地粘附、增殖、生长。细胞的活性和碱性磷酸酶活性未受到纳米组织工程骨的影响。结论NHAC具有良好的生物相容性,可作为骨组织工程理想的生物材料。     

体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展

体外构建组织工程软骨的首要问题是种子细胞的来源,目前获得种子细胞的可能途径主要有以下几种:(1)培养扩增自体获得的软骨细胞;(2)同种异体软骨细胞;(3)骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞;(4)胚胎干细胞;(5)基因修饰细胞。本文就当前体外构建组织工程软骨的种子细胞研究进展综述如下:1自体软骨细胞自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分,是终末分化细胞,具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天…     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。     

人骨髓基质细胞接种珊瑚构建组织工程骨

目的：观察体外培养的人骨髓基质细胞与珊瑚复合物植入体内后的成骨能力。方法：穿刺抽吸入髂骨区骨髓基质细胞，体外培养扩增、诱导，将其与珊瑚复合后植入裸鼠体内，以单纯珊瑚作为对照。术后4、8周取材，通过大体、组织学、扫描电镜观察植入物体内成骨情况。结果：术后4周，复合物中有少量新骨形成；术后8周，复合物中出现大量成熟骨组织。而对照组无骨组织形成。结论：人骨髓基质细胞复合珊瑚在无免疫动物体内具有成骨能力，穿刺抽吸的人骨髓基质细胞可作为骨组织工程的种子细胞。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨组织的实验研究

目的 探讨利用软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质细胞(BMSC)在体外构建软骨组织的可行性.方法 将分离出的猪骨髓基质细胞和软骨细胞进行体外培养,收集软骨细胞培养上清液,作为骨髓基质细胞诱导液从第2代开始进行诱导分化.7 d后取出标本,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达.体外分离培养的骨髓基质细胞与软骨细胞,扩增后两者以8∶2比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC以及20%上述浓度(1.0×107/ml)的单纯软骨细胞作为对照组.标本于8周后取材,行大体观察、湿重、蛋白多糖(GAGs)含量测定、组织学及免疫组化等相关检测.结果 经诱导后的骨髓基质细胞的Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.混合细胞组及阳性对照组体外培养8周后形成了单一成熟的软骨组织,并保持了支架材料的大小和形状,两组新生软骨在外观及组织学特征上也基本相同,免疫组化结果 表明两组均大量表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,共培养组的平均湿重和蛋白多糖(GAGs)含量均达到阳性对照组的70%以上.而单纯骨髓基质细胞组仅在局部形成了极少量幼稚的软骨样组织,且材料支架明显皱缩变形.低软骨细胞浓度组虽新生软骨湿重量能达阳性对照组的30%,但材料支架明显皱缩变形,仅在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组.结论 软骨细胞能在一定程度上提供软骨形成的微环境,有效地诱导BMSC向软骨细胞分化,并在体外形成组织工程化的软骨组织.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of chondrogenesis in vitro with bone marrow stromal cells (BMSCs) induced by the co-cultured chondrocytes. Methods The BMSCs and chondrocytes were separated from pig and cultured. The supernatant of chondrocytes was used as the inducing solution for BMSCs from the 2nd generation. 7 days later, samples were taken and underwent immunohistochemistry and RT-PCR for detection of the expression of specific type Ⅱ cartilage collagen,type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA. The cultured BMSCs and chondrocytes were mixed at a ratio of 8:2(BMSC: cartilage cell) and were inoculated into a polyglycolic acid/polylactic acid (PGA/PLA) scaffold at the final concentration of 5.0 × 107/ml. The cartilage cells and BMSCs were also inoculated seperately at the same concentration as the positive and negative control. Pure cartilage cells at 20% of the abovementioned concentration (1.0 × 107/ml) were used as the low concentration cartilage cell control group. Samples were collected 8 weeks later. General observations, wet weight, glycosaminoglycans (GAGs) determination and histological and immunohistochemistry examinations were performed. Results The expression of type Ⅱ collagen, type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA were positive in induced BMSCs.In the co-cultured group and the positive control group, pure mature cartilage was formed after 8 weeks of culture in vitro, and the size and shape of the scaffold were maintained. The newly formed cartilage in the two groups were almost the same in appearance and histological properties. The immunohistochemistry results indicated that the cartilage cells of the two groups all expressed ample cartilage-specific type Ⅱ collagen. The average wet weight and GAG content in the co-cultured group reached more than 70% of those in positive control group. Only an extremely small amount of immature cartilage tissues was formed in local regions in pure BMSC group, and the scaffold was obviously shrunk and deformed. Although the wet weight of newly generated cartilage tissue in the low concentration cartilage cell group reached 30% of that in positive control group, the scaffold was obviously shrunken and deformed. Only regional and discontinuous cartilage tissues were formed, and the amount of newly formed cartilage was obviously less than that in the co-culture group and the positive control group. Conclusions Chondrocytes can provide a micro-environment for the formation of cartilage, and also effectively induce BMSC to differentiate into chondrocytes and form tissue-engineered cartilage in vitro.     

体外构建与体内构建组织工程骨的血管化研究

目的比较骨髓基质干细胞(BMSCs)与生物衍生骨体内、体外复合所构建的组织工程骨修复山羊胫骨大段骨-骨膜缺损的血管化进程以及血管化与成骨的关系,以探讨修复大段负重骨缺损的最佳途径。方法22只山羊制备成胫骨中段20mm的骨-骨膜缺损,随机分为2组,分别植入BMSCs与生物衍生骨体外构建和体内构建的组织工程骨,常规钢板螺钉内固定,在2、4、6、12周时间点分别用墨汁灌注透明标本、血管面积图像分析和X线片观察血管化过程及成骨情况。结果体外构建组与体内构建组血管化进程无明显区别,各时间点血管面积差异无显著性意义(P>0.05),12周均能达到完全血管化,但X线片见体外构建组新骨形成较快,缺损区密度高,体内构建组以上各变化较前者慢大约2～4周。结论BMSCs与生物衍生骨体外构建和体内构建的组织工程骨均能快速血管化并成骨,但是体内构建方式成骨较体外构建慢。     

骨髓基质细胞体外培养骨发生潜能及条件研究

目的：建立一种骨髓基质细胞（ＢＭＳｃ）向成骨细胞转化的体外培养方法,观察其成骨过程,并探讨部分因子在ＢＭＳｃ转化及增殖中的作用。方法：将兔ＢＭＳｃ悬液进行体外培养,进行形态学观察和组织学检测;检测ｂＦＧＦ对ＢＭ－Ｓｃ的促增殖作用。结果：传代培养的细胞ＡＬＰ阳性率达８０％以上,细胞逐渐分化散在致密的岛状结构并分泌细胞外基质形成钙结节;ｂＦＧＦ能刺激ＢＭＳｃ的增殖。结论：培养的ＢＭＳｃ在体外仍具有成骨     

骨髓间充质干细胞体外构建组织工程化半月板

目的探索以骨髓间充质干细胞（BMSCs）为种子细胞,在体外构建具有完整内侧半月板形态的软骨样组织的方法。方法运用模具制备内侧半月板形的PGA/PLA支架。抽取犬骨髓,分离培养BMSCs,将其接种于支架材料上,5 d后使用软骨诱导液培养。体外培养6周后,行大体观察、组织学检测及生物力学检测。结果细胞材料复合物能够较好地维持半月板三维立体结构,形成了表面光滑、触之有弹性的瓷白色软骨样组织。 HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织的形成。Safranine O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学检测显示,新生组织弹性模量达正常半月板组织的12.7%。结论 BMSCs通过体外诱导,可在体外分化为较成熟的软骨组织,并构建出组织工程化半月板。     

骨髓基质细胞修复颅骨缺损的实验研究

目的为验证三维打印研究中动物模型的可靠性，采用骨髓基质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）修复裸鼠颅骨缺损。方法共10只裸鼠，其中实验组（n=5只）：颅骨缺损区植入BMSCs／脱钙骨；材料对照组：颅骨缺损区植入单纯脱钙骨，采用实验组自身对照（n=5只）；空白对照组（n=5只）：双侧颅骨区造成缺损后旷置。术后3个月取材进行大体观察、组织学和免疫组化（骨钙蛋白）检查。结果术后3个月，实验侧组织质地较硬，组织学表现为骨结构，骨钙蛋白免疫组化阳性；对照侧质地较软，组织学表现为结缔组织，骨钙蛋白免疫组化阴性；空白对照组仍表现为颅骨缺损。结论采用BMSCs可修复裸鼠颅骨缺损，验证了三维打印研究中动物模型的可靠性。     

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Form Ectopic Woven Bone In Vivo Through Endochondral Bone Formation

Abstract:  Autologous vascularized bone grafts, allografts, and biocompatible artificial bone substitutes each have their shortcomings. Bones regenerated using recombinant human bone morphogenetic proteins, demineralized bone powder, or combinations of these are generally small and do not meet the need. The current trend is to use tissue engineering approaches with bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) to generate bones of a desired size and shape. A suspension of osteogenically induced MSCs (CD11a−, CD29+, CD44+) was added to 2% alginate, gelled by mixing this combination with calcium sulfate (CaSO₄ 0.2 g/mL), and injected into the subcutaneous pocket in the dorsal aspect of nude mice. Cells of various concentrations (0, 10, 50, and 70 million/mL) were used. These implanted constructs were harvested at predetermined times up to 30 weeks for histology. The doubling time of bovine MSCs is 3.75 ± 1.96 days and the proliferation is rapid. Histological evaluation revealed signs of endochondrosis with woven bone deposition. The equilibrium modulus increased with time in vivo, though less than that of normal tissue. Implants seeded with 70 million cells/mL for 6 months resulted in the best formation of equilibrium modulus. This approach has several advantages: (i) obtaining MSCs is associated with low donor morbidity; (ii) MSCs proliferate rapidly in vitro, and a large number of viable cells can be obtained; and (iii) the MSC/alginate constructs can develop into bone-like nodules with high cell viability. Such a system may be useful in large-scale production of bony implants or in the repair of bony defects. The fact that endochondral bone formation led to woven bone suggests its potential feasibility in regional cell therapy.     

胎猪BMSC体外构建软骨的实验研究

目的比较胎猪骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）和成年猪BMSCs构建软骨能力的差异,寻找合适的同种异体组织工程软骨种子细胞来源。方法通过剖腹产手术获得胎龄为70 d的胎猪,胎猪骨髓液贴壁培养获得胎猪BMSCs;抽取成年猪骨髓液,经贴壁培养法获得成年猪BMSCs。两种细胞体外扩增培养后,观察第3代细胞形态,并进行成骨、成脂和成软骨诱导。分别取两种细胞以1×108 cells/mL的细胞终浓度,接种于聚乳酸包埋的聚羟基乙酸支架,体外诱导培养8周后取材。通过大体观察、糖胺聚糖（GAG）含量测定、总胶原含量测定、组织学,以及免疫组化等方法,对两种细胞构建的组织工程软骨的相关生物学特性进行比较。结果胎猪BMSCs比成年猪BMSCs具有更好的增殖和成骨、成脂和成软骨能力。胎猪BMSCs构建的软骨有良好的软骨外观,而且GAG含量和总胶原含量均高于成年猪BMSCs构建的软骨（P<0.01）。组织学和免疫组化显示,胎猪BMSCs构建的软骨组织结构致密,基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于成年猪BMSCs构建的软骨。结论胎猪BMSCs是组织工程软骨较好的种子细胞来源。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为血管平滑肌样细胞的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为构建小口径血管种子细胞的可行性及其诱导机制。方法取体重100 g左右雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用原代全骨髓培养法,多次传代纯化,体外扩增后,观察细胞形态,并用免疫荧光及流式细胞仪检测CD34、CD90、CD105细胞因子,鉴定是否为BMSCs。将BMSCs分为实验组和对照组：实验组使用含全反式维甲酸及二丁酰环磷酸腺苷（db-cAMP）的低糖基本培养基（DMEM-LG）培养;对照组采用普通的DMEM-LG培养。观察诱导后细胞形态,检测诱导后第5代细胞平滑肌α-肌动蛋白（SM--αactin）、钙结合蛋白（calponin）、平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）的表达情况。结果原代培养所获取的细胞经过多次传代培养后呈长梭形,呈现特征性的漩涡状生长,检测CD34阴性,CD90、CD105阳性。实验组经诱导后的BMSCs生长较缓慢,略呈椭圆形,检测SM--αactin、calponin、SMMHC显著表达;对照组的细胞形态及生长速度和实验组BMSCs相似,但不表达SM--αactin、calponin和SMMHC。结论 BMSCs在全反式维甲酸的诱导下可向血管平滑肌样细胞表型分化,可为组织工程构建小口径血管提供平滑肌种子细胞。     

人骨髓间充质干细胞与脐静脉内皮细胞体外共培养的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs）与脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）体外共培养对hBMSCs成骨作用及hUVECs成血管功能的影响。方法分离鉴定hBMSCs和hUVECs,将hBMSCs及hUVECs按1∶1比例直接共培养,倒置相差显微镜观察细胞的生长特性和细胞相容性,Matrigel实验观察共培养对hUVECs体外血管形成能力的影响。将hBMSCs成骨诱导7 d后,茜素红染色观察共培养对其成骨分化能力的影响。结果 hBMSCs与hUVECs体外共培养细胞相容性良好,Matrigel实验显示共培养组形成的毛细血管状结构较单一细胞组多。成骨诱导的hBMSCs中,共培养组茜素红染色阳性,单一细胞组茜素红染色阴性。结论 hBMSCs与hUVECs具有良好的细胞相容性,在共培养体系中,未诱导的hBMSCs能促进形成毛细血管状结构,已成骨诱导的hBMSCs成骨矿化能力增强。     

骨髓单个核细胞与骨髓间充质干细胞促进大鼠皮瓣存活率的比较

目的比较来源于等量骨髓的单个核细胞与经扩增的间充质干细胞,促进大鼠随意皮瓣成活率的效果。方法取等质等量的大鼠骨髓,一半直接离心获得骨髓单个核细胞,一半经体外培养获得骨髓间充质干细胞,注射相等数量(n=6)的大鼠随意皮瓣。术后测量并计算皮瓣成活面积,取材,行组织学检测,计数CD31阳性血管数量。结果未经培养的骨髓单个核细胞组皮瓣的平均存活率为(71.6±8.4)%,培养的骨髓间充质干细胞组平均存活率为(66.2±3.1)%,这两组存活率均显著高于注射平衡液的对照组(55.9±3.4)%;注射细胞组之间平均存活率没有统计学差异。组织学血管密度计数显示,骨髓单个核细胞组和骨髓间充质干细胞组的微血管数量分别是(58.2±6.8)和(42.7±5.1),都显著高于PBS对照组(22.8±3.1),而骨髓单个核细胞组也显著高于骨髓间充质干细胞组。结论与不经培养的骨髓单个核细胞相比,通过体外扩增的骨髓间充质细胞,未能显著提高大鼠随意皮瓣的成活率。     

组织工程骨血管化策略的研究进展

骨组织工程的发展为大段骨缺损的修复提供了新的途径,众多的动物实验研究和逐渐兴起的临床应用研究已充分显示出其巨大的应用前景。然而,组织工程骨细胞支架复合物在植入体内后,尤其植入血供不佳的受区时,因不能及时地与机体建立起血供连接,使得成骨效果不稳定。近年来的研究表明,组织工程骨的血管化已成为构建大段组织工程骨的一个关键因素。我们对组织工程骨血管化策略的研究进展进行综述。     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

不同体外诱导时间对BMSCS成软骨分化的组织学特性影响的研究

目的探索体外不同时间的成软骨诱导,对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的组织学特性的影响。方法以猪第2代BMSCs为种子细胞,以聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)为支架,体外构建直径12 mm,厚3 mm的圆盘状复合物,联合应用TGF-β1(10 ng/mL)、IGF-I(50 ng/mL)及地塞米松(40 ng/mL),体外分别诱导1周和4周,并以未经诱导的BMSCs和软骨细胞为对照,分析和比较不同诱导时间对BMSCs体外成软骨分化的影响。结果体外诱导4周的BMSCs-PGA/PLA复合物的组织学结构明显较只诱导1周的致密,软骨特异性基质(如蛋白多糖、Ⅱ型胶原等)表达水平明显高于诱导1周的。结论体外诱导时间对BMSCs软骨定向分化具有重要影响,延长诱导时间可明显促进复合物成熟并增加其软骨基质分泌。