pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞后对血管内皮生长因子表达的影响

目的 克隆构建绿色荧光蛋白(GFP)-Akt表达载体,观察其在鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达和定位及其对(VEGF)mRNA和蛋白表达的影响.方法 采用酶切法将Akt重组于GFP表达载体pEGFP-C1中,经酶切序列鉴定后,将该重组质粒GFP-Akt及GFP空质粒通过脂质体法转染骨髓MSCs.荧光显微镜观察其转染率及在细胞中分布.分别采用用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测pEGFP-C1和pEGFP-C1/Akt转染MSCs后蛋白和VEGF mRNA的表达.结果 GFP-Akt基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在鼠MSCs中表达.荧光显微镜下pEGFP-C1转染后,绿色荧光均匀分布于细胞中,而pEGFP-C1/Akt转染后,绿色荧光分布于胞质中;与未转染组比较,pEGFP-C1转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05);而pEGFP-C1/Akt转染组Akt mRNA和蛋白及VEGF mRNA和蛋白表达显著增加(P＜0.05).结论 成功构建GFP-Akt融合基因表达载体在鼠MSCs中表达;并可诱导AktmRNA及蛋白和VEGF mRNA和蛋白的表达.     

MSCs调节炎症反应研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有自我更新和多谱系分化能力的多能干细胞。其除了拥有多向分化潜能外,还具有较强大的免疫调节能力。近年来大量的研究发现,MSCs能够通过迁移至炎症部位或远距离分泌细胞因子等多种机制来调节免疫细胞,进而调节炎症反应。在炎症环境下,MSCs能够通过直接接触、旁分泌以及转移线粒体等方式与免疫细胞相互作用而发挥免疫调节作用,具有良好的临床应用前景。现就MSCs对免疫细胞调控的可能机制作一综述。     

汗腺细胞与骨髓间充质干细胞共培养过程中基因表达变化及意义

目的建立人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与人汗腺细胞（hSGCs）共同培养模式，检测融合细胞的基因表达变化，探讨hMSCs的可塑性分化机制。方法分离纯化并体外扩增hSGCs和hMSCs；采用在47℃环境下热休克hSGCs 40min建立hMSCs与hSGCs共培养模式并观测细胞形态学变化；免疫细胞化学双染和RT-PCR等方法检测融合细胞的基因和蛋白表达特征。结果共培养后镜下可见产生融合细胞，细胞形态发生渐变，表现为细胞体积增大，形状不规则，多核和异型核，胞核相互靠近，约占细胞总数的约10％左右。采用抗癌胚抗原（CEA）和抗BrdU免疫细胞化学双染法，检测BrdU标记的hMSCs与hSGCs共培养后的融合细胞，证实该类细胞具有两种细胞的独特的免疫特性；与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高丰度的表达（P〈0．05）。结论热休克共培养后hMSCs具有在形态学和分子水平上向hSGCs分化的潜能，细胞融合现象丰富了皮肤创面修复和汗腺再生理论。     

Real-Time PCR检测间充质干细胞源性内皮细胞eNOS、Tie-2基因表达

[目的]检测骨髓间充质干细胞(BMSCs)源性内皮细胞功能基因表达水平,为骨组织工程血管化奠定基础。[方法]采用全骨髓贴壁法对BMSCs进行体外培养、纯化和扩增,用含有VEGF(10 ng.ml-1)和bFGF(2 ng.ml-1)的诱导培养液对其进行体外诱导分化3周,通过透射电镜观察内皮细胞特异性W-P小体鉴定细胞性质。以主动脉内皮细胞(VECs)为阳性对照,采用实时定量PCR(RT-qPCR)检测BMSCs源性内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)与酪氨酸激酶受体(Tie-2)mRNA的相对表达量。[结果]分化后的细胞在光镜下具有内皮细胞的形态学特征;透射电镜观察显示诱导后的细胞内出现内皮细胞特异性W-P小体。RT-qPCR检测显示:实验组Tie-2mR-NA的相对表达量为0.785,eNOS mRNA的相对表达量为0.747,二者与阳性对照组目的基因的表达量没有明显差异(P0.05)。[结论]BMSCs能够成功体外分化为内皮细胞,且具有成熟内皮细胞功能基因的表达,是构建血管化组织工程骨的理想种子细胞。     

MSCs治疗慢性创面的临床研究进展

目的 综述MSCs在慢性创面治疗中的临床研究进展.方法 广泛查阅近年来MSCs治疗慢性创面的相关文献,对MSCs治疗慢性创面的可能机制及其在临床慢性创面治疗中的应用情况、面临问题进行总结.结果 MSCs可参与到慢性创面愈合各个环节来促进创面愈合,在临床试验中展现出广阔应用前景.目前临床研究常用的MSCs包括骨髓来源MS...     

缺氧诱导因子-1α基因转染人间充质干细胞的体内促血管生成作用

目的研究将缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因转染人间充质干细胞（hMSCs）的体内促血管生成作用，为促进组织工程骨血管化提供新的方法和策略。方法构建pIRES3／HIF-1α逆转录病毒载体，制备含目的基因的重组逆转录病毒，感染hMSCs。用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测转基因hMSCs表达HIF-1α的水平，用免疫组织化学法检测转基因hMSCs在缺氧和常氧条件下HIF-1α蛋白的存在情况。体内促血管生成的实验分为两组：实验组采用转基因hMSCs，对照组采用未转基因的hMSCs。两种细胞分别接种到13d的鸡胚绒毛尿囊膜（CAM），3d后将CAM制片，在显微镜下观察并摄像。用图像分析方法测量并分析血管面积。结果转基因hMSCs中HIF-1α mRNA表达较未转基因的hMSCs明显增高。转染HIF-1α基因的hMSCs，缺氧条件下细胞核内HIF-1α能稳定存在；常氧条件下细胞核内HIF-1α不能稳定存在。图像分析结果显示实验组CAM较对照组CAM血管面积明显增多，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α基因能稳定转染到hMSCs并得到强制表达。转染HIF-1α基因的hMSCs有明显的促血管生成作用，对于促进组织工程骨的血管化有重要作用。     

MAPKs通路在MSCs的增殖及向成骨细胞分化过程中的作用

间充质干细胞（MSCs）是一种多潜能成体干细胞,在体外诱导剂的作用下能向成骨细胞分化。在MSCs向成骨细胞分化过程中,受到MAPKs、BMPs、Notch和Wnt等多种信号通路的调控。其中MAPKs信号通路研究比较深入,近年来研究表明在MAPKs信号通路的五种途径中,ERKs、p38MAPK和JNKs途径参与了成骨细胞增殖和分化的信号转导。现对MAPKs通路与其参与的MSCs增殖和成骨分化过程简要综述。     

细胞外基质对大鼠MSCs生物学活性的影响

目的：观察细胞外基质多聚赖氨酸对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）生长特性的影响，以寻求体外培养扩增MSCs更理想的方法。方法：用贴壁法分离获得大鼠MSCs，分别氨酸的培养器皿上，显微镜下观察细胞贴壁速度、生长和形态特点，流式细胞仪分析细胞生长周期。结果：MSCs在用多聚赖氨酸处理过的培养器皿E贴壁、增殖都较普通组快，细胞形态好，细胞活力和长势较普通组活跃。结论：细胞外基质多聚赖氨酸能明显促进MSCs的贴壁和增殖，有助于MSCs的体外扩增培养。     

人血管内皮细胞生长因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及在骨髓间充质干细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子(VEGF)165腺病毒表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞研究其相关特性。方法利用细菌内同源重组技术快速构建Ad-VEGF165腺病毒重组质粒,经酶切及测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK293包装成为重组Ad-VEGF165腺病毒,并进行电镜观察及滴度测定。感染大鼠骨髓间充质干细胞观察VEGF165基因的转录和表达。结果酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒含有hVEGF165cDNA,电镜显示包装细胞中有大量病毒颗粒存在,测定包装的病毒滴度为6.3×1010TCID50/ml。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学及免疫印迹检测骨髓间充质干细胞内有VEGF165的转录和表达。结论构建的VEGF腺病毒表达载体可有效感染骨髓间充质干细胞,并在体外高效表达,为将表达VEGF基因的骨髓间充质干细胞用于基因治疗提供了实验依据。     

大鼠MSCs体外分离培养及骨向分化的实验研究

目的:建立骨髓MSCs体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导,以证实其多向分化潜能,为骨髓MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法:用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,并能够向成骨细胞分化。     

糖尿病与非糖尿病冠心病患者骨髓间充质干细胞基因表达差异的初步研究

目的体外培养糖尿病与非糖尿病冠心病患者的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),采用Affymetrix基因芯片技术对糖尿病与非糖尿病冠心病患者的MSCs功能基因表达谱进行比较。方法冠心病合并糖尿病组纳入1例患者,男,53岁;诊断:冠心病、2型糖尿病。非糖尿病冠心病组纳入1例患者,男,51岁;诊断:冠心病。将两组患者的骨髓淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法和贴壁法进行分离、提纯MSCs,再用Affymetrix全基因组芯片检测MSCs特异性功能蛋白基因表达的差异。结果冠心病合并糖尿病组功能蛋白表达基因中涉及细胞凋亡、细胞因子、细胞内信号传导系统的基因有27个,其中13个基因表达明显上调,分别为TNFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5;有14个基因表达明显下调,分别为EPR1、BIRC5、HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6、RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。结论糖尿病合并冠心病患者的MSCs在功能基因表达方面存在显著变化。     

人腹膜中间充质干细胞生物学特性的初步研究

目的探讨人腹膜中是否含有间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC),并研究其生物学特性。方法腹膜取自接受胃大部切除及腹腔淋巴结清扫术的胃癌患者。将腹膜剪碎,Ⅰ型胶原酶消化后以低密度接种,2周后计算细胞群中成纤维细胞集落形成单位(Colony-forming unit-fibroblast,CUF-F)数量;流式细胞分析贴壁细胞表型;定向诱导2周后,碱性磷酸酶和油红O染色,观察细胞体外成骨和成脂肪能力。结果贴壁的细胞呈成纤维细胞样,消化的腹膜细胞群中,CFU-F比例平均为0.574‰(0.26‰～0.84‰)。流式分析显示,细胞均一表达CD29、CD44和CD73,不表达CD31、CD34和CD45。成骨细胞定向诱导后,细胞呈现碱性磷酸酶活性;成脂诱导后细胞内出现脂肪滴,油红O染色阳性。结论人腹膜中富含MSC,可作为一个含有生物支架的干细胞来源。     

间充质干细胞成骨性能的影响因素

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)因高度的自我增殖与多向分化能力在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景。目前,MSC成骨分化的研究很多,但体外、内的成骨效率仍然较低。因此,提高MSC的成骨性能成为关注热点。MSC成骨性能受多方面因素的影响,我们从细胞来源、分离纯化、诱导策略及血管化等4个方面对影响MSC成骨性能的因素进行综述。     

诱导人孤雌胚胎干细胞向类间充质干细胞分化的实验研究

目的探索人孤雌胚胎干细胞在体外向类间充质干细胞诱导分化的方法 ,并鉴定所得细胞的生物学特性。方法人孤雌胚胎干细胞在无血清条件下悬浮培养,形成拟胚体,10d后在含血清条件下使拟胚体贴壁生长,7d后胰酶消化,所得细胞在含血清的培养液中传代、扩增。观察传代、扩增后细胞的形态学变化;用免疫荧光染色和流式细胞技术进行细胞表型分析;取第9代细胞进行成脂、成骨和成软骨诱导,9～28d后行特殊染色及RT-PCR分析。结果人孤雌胚胎干细胞在诱导分化后,形态与骨髓间充质干细胞相似,多次扩增传代后仍保持细胞形态和扩增能力。免疫荧光染色发现,细胞表达中胚层标志波形蛋白(Vimentin)。流式细胞分析显示,细胞表达CD29、CD105、CD166、CD44等间充质干细胞表面标志。特殊染色及RT-PCR分析显示:成骨诱导后,细胞碱性磷酸酶和茜素红染色阳性,碱性磷酸酶和Cbfa-1表达增加;成软骨诱导后,细胞Ⅱ型胶原染色阳性,Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达增强;成脂诱导后,细胞油红染色阴性,脂蛋白酶和Leptin无表达。结论人孤雌胚胎干细胞可以诱导、分化为间充质干细胞,并具有成骨、成软骨分化潜能。     

锌离子促进人骨髓间充质干细胞增殖并增强其纤黏连蛋白表达的实验研究

目的 探索适宜的锌离子浓度,以促进人间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)在无血清培养基中的黏附和增殖.方法 将人骨髓MSC培养于含胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠的α-MEM中,体系中加入不同浓度硫酸锌.培养72 h后,MTT实验测定490 nm光密度值,观察细胞增殖状态.蛋白印迹杂交比较含锌离子(1×10-5 M)培养体系与未加锌离子培养体系两组细胞纤黏连蛋白含量的差异.结果 MTT结果显示,在一定浓度范围内,锌离子促进人骨髓MSC增殖,作用呈浓度依赖性,适宜浓度为1×10-5 M;蛋白印迹实验表明,在该浓度刺激下细胞培养72 h后,纤黏连蛋白表达量显著升高.结论 锌离子可作为人无血清培养基中的一个成分,可提高入骨髓MSC的贴壁生长能力.     

细胞接种密度对间充质干细胞成骨能力的影响

目的　研究初始细胞接种密度对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。方法　将经体外培养扩增后的人骨髓间充质干细胞制成不同浓度的细胞悬液 ,与载体 (人冻干松质骨 )结合后植入裸鼠皮下 ,在植入后 2、 4和 8周对植入物进行组织学观察和骨量的测定。结果　植入物的骨量受初始细胞接种密度影响 ,稳定成骨的最低接种低密度是 1× 10 5cells/ml,植入物的骨量 ,在一定范围内随接种密度的升高而增加 ,接种密度≥ 5× 10 6cells/ml后骨量不再有显著变化。结论　人的骨髓间充质干细胞体内成骨能力受初始细胞接种密度的影响。     

肝细胞生长因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞促进大鼠肢体血管新生

目的评价肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)修饰的人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)体内促血管新生效应,探讨其作用机制。方法结扎Wistar大鼠右侧股动脉,建立局部肢体缺血模型。将hMSC、hMSC/Ad-HGF或PBS,通过肌肉注射接种于缺血区,21d后以对侧肢体为正常对照,进行激光多普勒灌注成像测定、HE染色和免疫组化检查,评价骨骼肌微血管密度。以MTT、Transwell及内皮细胞体外管状结构形成实验,评价hMSC/Ad-HGF对血管内皮细胞的体外增殖、迁移及成管状能力的影响。结果 21d后,hMSC/Ad-HGF和hMSC组血流灌注水平明显高于对照组(P0.01),前者接近PBS组,显著高于hMSC组(P0.05)。组织学分析表明,每高倍视野肌肉组织中,hMSC/Ad-HGF组微血管数量最高,PBS组和hMSC组次之,对照组最低(P0.01)。hMSC/Ad-HGF培养上清可明显促进ECV304细胞的增殖,刺激作用高于表皮生长因子(20ng/mL,P0.001);促进细胞跨膜迁移和管状样结构形成,强于表皮生长因子。结论 hMSC/Ad-HGF可促进血管内皮细胞的增殖、迁移及血管结构重建,从而引发血管新生效应。     

凝血酶活化的富血小板血浆促进人骨髓间充质干细胞增殖

目的探索凝血酶活化的富血小板血浆(Thrombin-activated platelet-rich plasma,tPRP)替代牛血清,进行人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stme cells,MSC)分离及培养扩增的可行性。方法分别用MTT法和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯标记细胞技术,观察人骨髓MSC在含有tPRP和胎牛血清培养体系中的增殖状态:利用流式细胞学技术检测细胞表面表型;细胞化学染色法分析不同培养体系所获细胞的成骨及成脂细胞分化能力。结果tPRP培养的人骨髓MSC呈典型的成纤维细胞样形态,且tPRP促MSC增殖能力优于筛选后的胎牛血清。tPRP培养的MSC均表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC,而不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR。体外分化实验显示,利用tPRP培养的MSC具有体外成骨和成脂能力。结论tPRP可以替代胎牛血清,用于人骨髓MSC的培养。     

不同来源成体干细胞及不同细胞系的微囊化包裹

目的研究不同来源的间充质干细胞以及不同的细胞系在微囊内的存活情况,为促进骨再生微囊化基因给药平台的建立提供实验基础。方法从大鼠骨髓、脂肪和滑膜中分离培养间充质干细胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）,并培养C3H10T1／2、C2C12和NIH／3T3等细胞系．利用高压静电法制作包裹以上细胞的海藻酸-聚赖氨酸-海藻酸（APA）微囊．然后用EB／Calcein-AM染色方法测定细胞在微囊内1周及4周的存活情况。结果不同来源的间充质干细胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1／2、C2C12和NIH／3T3等细胞系在APA微囊内1周及4周的存活率均较高。结论不同来源的间充质干细胞（BMSCs、ADSCs和SMSCs）以及C3H10T1／2、C2C12和NIH／3T3等细胞系可在APA微囊内长期存活．     

自骨密质中分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞

目的介绍一种自Wistar大鼠骨密质中分离培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)的方法。方法应用骨髓密度梯度离心、酶消化骨密质两种方法分离、培养Wistar大鼠MSC,比较其形态学、体外增殖能力差异;并用碱性磷酸酶染色和油红O染色分别鉴定MSC的成骨和成脂分化潜能。结果采用密度梯度离心骨髓或用酶消化后的骨密质,经贴壁培养后均能够成功分离和培养大鼠的MSC,两者在形态学和体外增殖能力方面无明显差异;且两种方法培养的MSC经特异性诱导剂诱导后,均可向脂肪及成骨细胞分化,油红O染色及碱性磷酸酶染色均阳性。结论自骨髓和骨密质中均能够分离培养出较为纯化的大鼠MSC,两种方法培养的MSC体外生物学性能无明显差异。