新生鼠皮肤细胞以小室法移植后构建毛囊发育模型

目的 构建一种简便、可靠、直观的毛囊发育模型以检测毛囊细胞的毛发诱导能力,探讨毛囊形态发生和周期循环的分子机制.方法 于裸鼠背部植入一开放小室,将新生C57BL/6鼠皮肤中的真皮和表皮细胞分离,并按一定的比例混合移植至小室内,1周后拆除小室,观察毛发形成及毛发拔除后的再生情况.结果 细胞移植后1周,创面湿润无明显收缩,中间有淡红色半透明组织形成.移植后2周,创面完全愈合.移植后3周有黑色毛发长出皮肤.移植后4周,浓密黑色毛发垂直于皮肤表面生长,石蜡切片HE染色见毛囊结构发育完整.毛发拔除后1周能够再生出新的毛发.细胞以不同的比例移植,真皮细胞数量为1 × 107、表皮细胞数量降至1 ×106时,毛囊重构的效率并无明显改变.表皮细胞数量为1×107、真皮细胞数量降至5×106或者更少时,再生毛发的数量明显减少,两者单独移植均无毛发生长.结论 新生鼠皮肤细胞以小室法移植后可以构建毛囊发育的完整模型,并可用于检测毛囊细胞的诱导能力,以研究毛囊形态的发生和周期循环的分子机制.     

胚鼠真皮细胞辅助毛囊重建的实验研究

目的 探讨胚胎期真皮信号对体外扩增后的新生鼠真皮细胞毛发诱导能力的影响.方法 将胎龄14 d的胚鼠真皮细胞,加入到由体外扩增3d的新生鼠真皮细胞与新鲜分离的新生鼠表皮细胞在裸鼠背部构建的小室中,将其毛发再生情况与未添加胚鼠真皮细胞时做比较.同时,分别以下列细胞构建小室作为对照:胚鼠真皮细胞+新生鼠表皮细胞；新鲜分离的新生鼠真皮细胞+新生鼠表皮细胞；扩增的新生鼠真皮细胞；胚鼠真皮细胞；新鲜分离的新生鼠真皮细胞；新生鼠表皮细胞.结果 在胚鼠真皮细胞辅助下形成的毛发数量为(207±15.948)根,明显高于缺乏胚鼠真皮细胞辅助时形成的毛发数量(67±8.963)根,差异有统计学意义(n=3,t =7.653,P=0.002).结论 胚胎期真皮信号可使体外扩增后的新生鼠真皮细胞的毛发诱导能力得到更充分的发挥.     

毛囊细胞移植治疗秃发疾病的实验基础研究

目的:探索细胞移植诱导毛发再生模式,为毛囊细胞移植奠定实验基础。方法:利用酶消化法分离培养绿色荧光蛋白转基因鼠的表皮细胞和真皮细胞,分别进行体外培养扩增至第三代后注射移植入裸鼠皮下,观察其毛囊诱导能力。结果:表皮细胞移植无法诱导毛囊发育;真皮细胞移植仅诱导形成毛囊样结构;混合细胞移植能够诱导毛囊及毛干发育。结论:混合细胞培养可作为毛囊细胞体外培养模型,为毛囊细胞移植提供良好供体。     

外源性骨髓细胞在体诱导形成毛囊上皮细胞的研究

目的 观察外源性骨髓细胞能否在体诱导形成皮肤的上皮细胞.方法 获取转增强型绿色荧光蛋白基因的C57BL/6J小鼠原代骨髓细胞和野生型C57BL/6J小鼠原代表皮干细胞,植入野生型C57BL/6J小鼠背部创面并打包.分A、B两组各10只,A组每只植入1.0×107个单纯骨髓细胞,B组每只植入混合骨髓细胞、表皮干细胞各1.0×107个.创面痊愈后应用荧光法和免疫组织化学技术检测新生皮肤内EGFP的表达.结果 两组动物3个月后创面痊愈并有完整的毛发生长.A组新生皮肤内未见EGFP的表达;B组所有新生皮肤(100%)均可见EGFP阳性细胞群,多分布在毛囊内.结论 创伤后小鼠毛囊的再生过程中,骨髓细胞-表皮干细胞接触诱导对骨髓来源细胞向毛囊上皮细胞转化至关重要.     

不同材料人工真皮支架修复猪Ⅲ度烧伤创面比较

目的 比较胶原壳聚糖真皮支架、胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架及脱细胞基质真皮支架移植于Ⅲ度烧伤创面后,真皮支架的血管化及支架上表皮移植修复创面情况.方法 将3种不同真皮支架各移植于6头猪(共18头猪)Ⅲ度烧伤清创后创面,在植入后1、2、3周对真皮支架血管化、创面、支架上表皮移植愈合和修复情况进行观察,同时用免疫组织化学方法,对CD34阳性信号(新生血管数目)进行检测.以无支架植入的Ⅲ度烧伤清创后创面为对照.结果 胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入后2周支架血管化已基本完成,而胶原壳聚糖和脱细胞基质真皮支架至少需要3周.3种不同材料支架垂直于创面的新生微血管均比无支架对照创面多;不同材料支架组与对照组2周创面比1周创面、3周创面比2周创面CD34的表达均明显增多,胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架组植入后1、2、3周CD34阳性信号均明显高于相对应的其他3组;胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入后1周,创面植表皮,移植表皮存活良好,而胶原壳聚糖和脱细胞基质真皮支架植入需要2周,其表面移植的表皮细胞才能成活.结论 3种材料的支架均可修复Ⅲ度烧伤创面,而以胶原磺化羧甲基壳聚糖真皮支架的血管化程度最好.     

小鼠毛囊细胞注射移植实验研究

目的 研究小鼠皮肤毛囊细胞注射移植的再生机制及影响因素.方法 取3～5dC57BL/6J近交系小鼠背部皮肤,Dispase酶消化后剥离表皮,将真皮剪成小块置胶原酶中,过滤、低速离心、密度梯度离心后收集毛囊并制备单细胞悬液,经Dio标记后以不同的浓度和细胞组合进行皮内和皮下注射移植,并于移植后2、4d,以及1、3、6周观察其变化.结果 小鼠毛囊细胞皮内注射移植后4d,注射部位轻微隆起,外表呈灰色,镜下可见大量再生的毛囊,毛球部呈黑色,无明显毛干.移植后1周,注射点均可见明显隆起,外表呈现黑色,镜下可见大量毛囊伴有明显的黑色毛干,局部见密集分布的血管,管径增粗.移植后3周小鼠皮内注射部位形成一个含有灰白色内容物的囊肿,镜下可见密集的黑色毛发,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光.移植后6周,见囊内充满大量毛干,镜下可见大量脱落的杵状毛干及处于生长期的毛囊.而毛囊细胞皮下注射移植3周后,皮下仅散乱分布大小不等的灰白色囊肿,新生毛囊数量少,方向杂乱.毛囊细胞经过培养或移植数目低于1×105个时无新生毛囊形成.结论 毛囊细胞注射移植后能自发聚集,协同发育成新的毛囊.新生毛囊具有正常的生长周期.毛囊重建的效果不仅取决于所移植的细胞类型,同时还受到移植部位和细胞数量的影响.     

小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导毛囊再生实验研究

目的探讨绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的C57小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导裸鼠毛囊重建的实验研究。方法取C57-GFP新生及成年小鼠分离表皮与真皮,分别制备成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(按1∶1比例混合)、成年小鼠原代真皮细胞、新生小鼠第3代真皮细胞,荧光显微镜观察细胞激发绿色荧光情况,免疫细胞化学检测培养的新生小鼠第3代真皮细胞毛囊干细胞标志。取Balb/c裸鼠,分别将成年小鼠原代真皮-表皮混合细胞(A组)、成年小鼠原代真皮细胞(B组)、新生小鼠第3代真皮细胞(C组)及生理盐水(D组)移植至裸鼠皮下,术后4、5、6周行大体观察,6周时取移植部位皮肤行GFP免疫组织化学染色观察各组毛囊形成情况。结果荧光显微镜观察示,分离、培养的C57-GFP新生及成年小鼠表皮及真皮细胞均能激发绿色荧光;免疫细胞化学检测培养的第3代真皮细胞中毛囊干细胞标志,显示波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白强阳性,表明细胞多为真皮鞘细胞;部分细胞表达毛乳头细胞标志CD133、多能聚糖及毛囊隆突部标志角蛋白15。裸鼠皮下移植实验:大体观察示A组可见接种部位皮下呈灰黑色,但未见毛发穿出皮肤表面;B、C、D组裸鼠皮肤均无着色。免疫组织化学染色示,A组形成新的、完整的毛囊结构或参与形成毛囊;B组GFP阳性细胞多表达于毛囊真皮鞘、外根鞘;C组GFP阳性细胞主要分布于毛囊真皮鞘、外根鞘、毛乳头,在汗腺中也有表达;D组GFP染色呈阴性。结论小鼠皮肤的表皮和真皮细胞在裸鼠体内相互作用可形成完整的毛囊结构,而仅移植新鲜分离或培养的真皮细胞则主要参与毛囊形成,无法形成完整的毛囊结构。     

含bFGF和VitC的载体复合膜负载骨髓间充质干细胞修复兔创面的实验研究

目的含bFGF和VitC的载体复合膜负载骨髓间充质干细胞植入兔创面，探讨其对真皮新生、重建速度的影响和促进表皮修复速度的最佳阶段。方法抽取24只新西兰大耳白兔的骨髓间充质干细胞，体外分离、培养。每只兔的背部脊柱两侧做3个创面，深度直达深筋膜，面积约为3．14cm^2，随机分为A、B、C三组。A组创面置入含有MSCs、bFGF和VitC的羊膜载体复合膜。B组创面置入只含有MSCs的羊膜载体复合膜。C组创面只置入羊膜载体复合膜。计算出创面愈合率，采用大体观察、常规组织学观察（HE染色、Masson染色、Van Giesonr染色）、Ⅰ型胶原免疫组织化学观察、墨汁灌注法等化学染色动态观察创面愈合情况。结果A组在7d、14d、21d的新生真皮明显较B组相应时间点的厚度、活跃的Ⅰ型胶原阳性细胞数量、血管和胶原纤维均较B组的多。B组比C组的修复效果好：A组术后14d和21d新生真皮表面，表皮再生长入并覆盖真皮修复创面的速度均比B组的快；B组的表皮覆盖速度义比C组的快、对创面愈合率进行统计学处理，A组比B组好，B组比C组好，差异有统计学意义。结论羊膜载体复合膜植入全层皮肤缺损后,添加MSC、bFGF和VitC等因素，能加速真皮的修复和重建，并且在真皮修复过程中可能有表皮新乍和重建的最佳时期。     

胶原-壳聚糖真皮支架原位诱导修复猪全层皮肤缺损的研究

目的 观察胶原-壳聚糖真皮支架移植于猪皮肤缺损创面后支架的血管化及血管化支架上皮肤移植的成活情况.方法 将双层人工皮肤支架移植于10只猪全层皮肤缺损创面,在植入后1、2、3周对真皮支架血管化、创面、血管化支架上皮肤移植愈合情况进行观察;同时用免疫组织化学方法,对CD34阳性信号(新生血管数目)进行检测.结果 支架植入后1周支架内可见细胞浸润和少量新生微血管形成;植入后2周,垂直于创面的新生微血管明显增多;植入后3周,大部分支架被血管化.CD34阳性信号在支架植入后3周比植入后2周明显增多,植入后2周比植入后1周明显增多.在支架植入后1、2、3周创面植中厚皮,植皮2周后皮片存活率分别为10%、70%和100%.在支架植入后1周和2周创面植表皮,1周和2周后移植表皮存活良好.结论 胶原-壳聚糖真皮支架可以诱导血管长入,明显促进创面愈合.在支架上移植表皮,可较好修复创面,在皮肤移植中有良好的应用前景.     

不同人工真皮支架在修复Ⅲ度烧伤创面中创面收缩和细胞凋亡差异的实验研究

目的 探讨不同真皮支架血管化对Ⅲ度烧伤创而修复中创面收缩和细胞凋亡影响的差异.方法 将胶原-磺化羧甲基壳聚糖、胶原-壳聚糖及脱细胞基质三种真皮支架分别移植于猪Ⅲ度烧伤清创后创面,观察植入创面的修复情况,并通过免疫组化、末端脱氧核苷酸介导的生物索化的脱氧尿嘧啶DNA切口末端标记等方法对不同时间小同支架创面中表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的血管和肌成纤维细胞数量及细胞凋亡情况进行检测.结果 植入不同真皮支架的创面与无支架植入的肉芽创面不同.支架植入创面1～3周α-SMA表达阳性的血管数持续增加,支架植入2周加植表皮2周后创面血管数减少,不同时间点以胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入创面最多,无支架植入创面最少.α-SMA表达阳性的肌成纤维细胞以胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架植入创面最少且表达高峰为2周,其他创面表达高峰为3周,以无支架植入创面最多.不同支架植入后2～4周,创面内细胞凋亡持续大幅增多;而无支架植入创面中,3～4周才开始增加;细胞凋亡以胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架创面最多,无支架创面最少.结论胶原-磺化羧甲基壳聚糖真皮支架可增强修复细胞的迁移,获得良好的血管化,较好较快地修复皮肤全层烧伤缺损创面.     

毛乳头细胞和表皮细胞构建带附属器的组织工程皮肤

目的根据毛囊形成原理,以人毛乳头细胞和表皮细胞为种子细胞,构建带附属器的组织工程皮肤替代物。方法分实验组和对照组,实验组皮肤替代物真皮层接种人毛乳头细胞和表皮细胞;对照组真皮层不接种任何细胞。在裸鼠背部作一圆形全层皮肤缺损,将两组皮肤替代物气-液界面培养5 d后移植到裸鼠背部。观察创面愈合情况,并在移植后第4、6、8周取材,进行组织学观察。结果皮肤替代物移植后2周,实验组创面已完全愈合,移植后4周对照组创面才完全愈合,并且对照组创面收缩比实验组明显。移植后6周,实验组真皮层内见到毛囊样结构和皮脂腺结构,对照组未见毛囊样结构和皮脂腺样结构。结论将人的毛乳头细胞和表皮细胞共同种植在皮肤替代物的真皮层,可以构建出带附属器的组织工程皮肤替代物,这种替代物对创面的修复能力更强。     

Induction of hair follicle regeneration in rat ear by mi-croencapsulated human hair dermal papilla cells

Objective: To induce hair follicle regeneration in rat ear by microencapsulated dermal papillae (DP) cells.Methods: Intact dermal papillae were obtained from human scalp follicles which were digested with collagenase I. The human hair DP cells were encapsulated with alginate-polylysine-alginate (APA) by a high-voltage electric field droplet generator. The diameters of the DP cell microcapsules were optimized by regulating the voltage, the distance be-tween the needle head and the solution surface and the injection speed. Then DP cell microencapsulations were xenotransplanted into ears of 20 SD rats with a novel method. One rat was killed every week at the postoperative 2-12 weeks and the implantation sites were biopsied for histo-logical observation.Results: The DP cell microencapsulations were found in a group of round, smooth and transparent microcapsules under a phase-contrast microscope. The optimal combina-tion of parameters to obtain 0.4 mm DP cell microcapsules was voltage 7.0 kV, injection speed 55 mm/h, and distance 10mm. After 4-12 weeks, 18 of 20 DP cell microcapsule implan-tations had produced high-density hair. Histological obser-vation indicated that both large follicles and sebaceous gland structures were formed in the rat ear within 3-12 weeks.Conclusions: These findings show that the DP cell microencapsulation maintain the capacity for initiating the follicle regeneration and can be considered as a substitute for fresh isolated dermal papillae.     

用毛囊隆突细胞构建复合皮的实验观察

目的 以人毛囊隆突细胞为种子细胞体外构建组织工程复合皮，在体观察其功能性修复全层皮肤缺损的可行性。方法 胶原酶消化法体外分离培养人毛囊隆突细胞和毛乳头细胞，实验分为A、B两组。A组将毛囊隆突细胞与毛乳头细胞按1：2混合，接种于胶原包被的聚羟基乙酸纤维支架中；B组单纯接种相同数量的毛乳头细胞。而后覆盖角质形成细胞膜片，构成组织工程复合皮，移植于裸鼠全层皮肤缺损创面。观察创面愈合情况，分别于术后2、4、6周在光学显微镜下观察移植物组织学变化。结果 组织工程复合皮能够有效修复A、B两组裸鼠全层皮肤缺损。术后2周，A、B组创面均可见完整的表皮及真皮结构。术后4-6周，A组复合皮表皮层明显增厚并形成基膜的钉突，可见毛囊样结构；B组仅表皮层有所增厚但基膜平整，未见钉突和毛囊结构形成。结论 以聚羟基乙酸真皮基质为支架，用角质形成细胞、毛囊隆突细胞和毛乳头细胞共同构建的组织工程复合皮，可以有效修复裸鼠全层皮肤缺损。其中毛囊隆突细胞参与了创面解剖修复，同时可能引导组织结构和功能的修复。     

微囊化人头皮毛乳头细胞移植诱导毛发形成

目的探索微囊化人头皮毛乳头细胞（以下简称毛乳头细胞）对裸鼠背部皮肤毛囊形成的诱导作用。方法胶原酶消化法体外分离、培养毛乳头细胞，再将毛乳头细胞以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine—alginate，APA）微囊包裹，以胶原凝胶作为载体，植入裸鼠背部皮下；移植空囊、游离毛乳头细胞各作为对照。观察移植部位毛发生长情况，利用组织学方法观测所形成的毛囊结构。结果微囊化毛乳头细胞皮下移植4周后，裸鼠背部移植区有白色、浓密、分布均匀的毛发长出。局部组织切片见大量发育完整的毛囊结构；而空囊及游离毛乳头细胞移植均未能诱导出上述现象。结论聚集性生长的微囊化毛乳头细胞能够保持诱导皮肤毛囊形成的作用，且这种作用无种属特异性。     

微囊化人头皮毛乳头细胞诱导小鼠耳毛囊再生的研究

目的 观察人头皮毛乳头细胞海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠（alginate-polylysine-alginate，APA）微囊是否具备诱导小鼠耳部毛囊再生的功能；寻找理想的微囊直径。方法 以APA微囊包裹体外分离培养的人头皮毛乳头细胞；将毛乳头细胞微囊移植至小鼠耳部皮下，6周后局部取材行组织学检查；共聚焦显微镜下观察葡聚糖-荧光素在APA微囊中的扩散速度和扩散方式，并对比相同时间、不同直径的APA微囊中葡聚糖-荧光素的强度，综合分析确定最佳的微囊直径。结果 组织学检查显示：移植部位皮下有密集的同心圆状毛囊结构形成，其数量、大小、分化程度等与对照组明显不同。荧光素以同心圆状、逐层渗透的方式向APA微囊中扩散；相同时间内荧光强度比较：小囊组〉中囊组〉大囊组。结论 微囊化毛乳头细胞具备诱导毛囊再生的生理功能；微囊理想的直径是400μm。     

毛乳头细胞诱导毛囊形成的研究

目的 探讨培养的毛乳头细胞在体内外条件下诱导毛囊形成的可能性。方法 采用酶消化法获得毛乳头细胞、真皮鞘细胞、毛囊上、下段及球部细胞，进行毛囊组织工程重建，或用游离细胞混合移植于棵鼠，组织学观察毛囊形成情况。结果 毛囊间表皮细胞、毛囊上段上皮细胞、下段上皮细胞和球部细胞在间质细胞凝胶上均可形成双层结构的组织工程皮肤，在真皮鞘细胞胶原凝胶上毛囊的上、下段上皮细胞形成了毛囊结构，移植于棵鼠后8周毛乳头细胞胶原凝胶诱导毛囊上、下段细胞形成了毛囊。低代毛乳头细胞与毛囊上皮细胞混合移植形成了数量较多、结构典型的毛囊，并有肉眼可见的毛发纤维产生。结论 毛囊的真皮成分细胞即毛乳头细胞、真皮鞘细胞在体内、外均具有诱导毛囊形成的能力，通过与毛囊上皮细胞之间的相互作用，可诱导毛囊形成。     

MSCs seeded on bioengineered scaffolds improve skin wound healing in rats

Growing evidence has shown the promise of mesenchymal stromal cells (MSCs) for the treatment of cutaneous wound healing. We have previously demonstrated that MSCs seeded on an artificial dermal matrix, Integra (Integra Lifesciences Corp., Plainsboro, NJ) enriched with platelet‐rich plasma (Ematrix) have enhanced proliferative potential in vitro as compared with those cultured on the scaffold alone. In this study, we extended the experimentation by evaluating the efficacy of the MSCs seeded scaffolds in the healing of skin wounds in an animal model in vivo. It was found that the presence of MSCs within the scaffolds greatly ameliorated the quality of regenerated skin, reduced collagen deposition, enhanced reepithelization, increased neo‐angiogenesis, and promoted a greater return of hair follicles and sebaceous glands. The mechanisms involved in these beneficial effects were likely related to the ability of MSCs to release paracrine factors modulating the wound healing response. MSC‐seeded scaffolds, in fact, up‐regulated matrix metalloproteinase 9 expression in the extracellular matrix and enhanced the recruitment of endogenous progenitors during tissue repair. In conclusion, the results of this study provide evidence that the treatment with MSC‐seeded scaffolds of cutaneous wounds contributes to the recreation of a suitable microenvironment for promoting tissue repair/regeneration at the implantation sites.     

Improved skin wound epithelialization by topical delivery of soluble factors from fibroblast aggregates

Introduction

Timely coverage of an excised burn wound with a split-thickness skin graft, and efficient epithelialization at the donor site wound are key components in the treatment of burn patients. Prompt healing is dependent on paracrine support from underlying dermal connective tissue fibroblasts.

Study aim

Using the skin graft donor site in pig as a model for epithelialization, our aim was to evaluate if dermal signals, derived from cultured dermal fibroblast aggregates (Finectra), can promote epidermal regeneration.

Materials and methods

Partial-thickness skin wounds were made with a dermatome on the backs of three domestic pigs. After randomization, topical treatment was initiated by application of Finectra (n = 6) or factors from standard fibroblast monolayer cultures (n = 6) trapped in a slow-clotting fibrin matrix. Saline was applied to contralateral wounds to serve as corresponding untreated controls (n = 12). After 3 days, full-thickness skin samples representing the whole wound area were obtained. Histological sections of these samples were analyzed for epithelialization, cell migration from lateral wound edges and hair follicles, as well as for formation of granulation tissue.

Results

In response to topical delivery of Finectra, a significant acceleration of epithelialization (p < 0.001) across the wound surface as well as from the wound edges was evident. Marked increase in thickness of granulation tissue (p < 0.001) was noted in wounds treated with Finectra. Epihelialization originated from adnexal structures in which epithelial islets showed positive staining for cytokeratin-14 and PCNA.

Conclusion

These data show that the fibroblast aggregate-derived paracrine mediators, Finectra, stimulate epidermal regeneration in vivo.