Src 羧基末端激酶结合蛋白过表达及棕榈酰化对裸鼠T 系白血病Jurkat 细胞增殖作用影响的研究

目的:建立Src羧基末端激酶结合蛋白(Cbp)过表达及棕榈酰化的T系白血病Jurkat细胞裸鼠模型,研究Cbp过表达及棕榈酰化对Jurkat细胞增殖作用的影响。方法:利用neg-EGFP、Cbp-EGFP、Cbp-m-EGFP融合蛋白慢病毒载体转染的Jurkat细胞构建动物模型,24只5周龄雌性BALB/c-nu小鼠随机分为空白对照组、空病毒对照组、Cbp过表达组和Cbp棕榈酰化位点突变组,每组6只。接种前和接种后0、1、2、3、4、5周裸鼠称重,取外周血计数白细胞总数。利用病毒本身携带的EGFP绿色荧光蛋白在激光共聚焦显微镜下观察Jurkat细胞在外周血中的增殖情况;HE染色观察肝脏的病理变化;流式细胞仪检测Jurkat细胞在小鼠骨髓和外周血中的增殖水平。结果:Cbp过表达组小鼠体重低于空白对照组,高于空病毒对照组和Cbp棕榈酰化位点突变组,Cbp棕榈酰化位点突变组小鼠体重低于空白对照组、空病毒对照组和Cbp过表达组。Cbp过表达组小鼠外周血白细胞总数和肝脏、骨髓、外周血中Jurkat细胞增殖水平高于空白对照组、低于空病毒对照组和Cbp棕榈酰化位点突变组。Cbp棕榈酰化位点突变组小鼠外周血白细胞总数和肝脏、骨髓、外周血中Jurkat细胞增殖水平高于空白对照组、空病毒对照组和Cbp过表达组。结论:成功建立了Cbp过表达及棕榈酰化的T系白血病Jurkat细胞动物模型,Cbp过表达可抑制Jurkat细胞增殖,Cbp棕榈酰化位点突变可促进Jurkat细胞增殖。     

LAT介导GPI锚固蛋白CD59对Jurkat细胞的生物学效应研究

目的探讨在T系急性白血病的Jurkat细胞中,GPI类锚固蛋白CD59通过LAT介导的细胞增殖、活化、凋亡等相关的生物学效应,研究GPI锚固类膜蛋白分子对细胞调控的作用方式。方法分别构建LAT-EGFP、neg-EGFP融合蛋白慢病毒载体,转染Jurkat细胞,建立稳定表达株(LAT-EGFP作为实验组,neg-EGFP转染空病毒组作为对照组)。利用CD59单克隆抗体刺激实验组及对照组细胞后,通过CCK-8检测细胞的增殖活性,利用流式细胞术检测细胞凋亡状况,并通过激光共聚焦显微镜观察LAT与CD59分子在细胞中的定位表达。最后利用免疫印迹技术检测细胞内相关信号转导蛋白的表达情况。结果 CD59单抗交联刺激后,细胞增殖活性增加。实验组细胞出现明显晚期凋亡甚至坏死现象。而免疫荧光显示LAT-EGFP组细胞中LAT分子高亮聚集于脂筏区,相较于对照组细胞呈现明显的戒指环状。Western blot显示,CD59抗体交联后,ZAP70、Fyn、LCK的表达均下降且LATEGFP组蛋白表达量低于对照组。结论 GPI锚固蛋白CD59通过T细胞活化连接蛋白LAT对T细胞信号转导发挥正向调控作用,转染LAT-EGFP的Jurkat细胞处于活化状态,LAT呈戒指环状定位于脂筏。     

过表达Src羧基末端激酶结合蛋白的Jurkat细胞荷瘤小鼠模型的建立与鉴定

目的建立过表达Src羧基末端激酶结合蛋白(CBP)的T系白血病Jurkat细胞动物模型。方法 5周龄雌性BALB/c-nu小鼠随机分为空白对照组、正常Jurkat细胞对照组、空病毒Jurkat细胞对照组、病毒转染过表达CBP模型组,每组5只。小鼠腋窝皮下注射Jurkat细胞1×107个/0.1 m L。建模成功后取出完整瘤体组织称质量、HE染色观察小鼠皮下肿块的病理变化;流式细胞术检测小鼠外周血Jurkat细胞增殖水平;ELISA检测小鼠血清中白细胞介素2(IL-2)水平。结果病毒转染过表达CBP模型组小鼠瘤体组织块体积和质量小于对照组,HE染色瘤体内有Jurkat细胞增殖,外周血Jurkat细胞增殖水平低于正常Jurkat细胞对照组和空病毒Jurkat细胞对照组,血清中IL-2水平低于正常Jurkat细胞对照组和空病毒Jurkat细胞对照组。结论成功建立了过表达CBP的Jurkat白血病细胞小鼠荷瘤模型,CBP可抑制Jurkat细胞IL-2分泌和增殖。     

跨膜衔接蛋白PAG1棕榈酰化位点突变对CD59介导的Jurkat细胞信号转导的影响北大核心

为探讨跨膜衔接蛋白——富含鞘磷脂的脂膜微区结合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphing-olipid-enriched microdomains 1,PAG1)棕榈酰化位点突变对CD59介导的Jurkat细胞活化、增殖等生物学效应的影响,通过慢病毒转染技术建立PAG1棕榈酰化位点突变的Jurkat细胞株,用CD59单克隆抗体刺激试验组和阴性对照组。用免疫荧光检测PAG1、CD59在细胞上的表达及定位关系;CCK-8法及FACS检测细胞的增殖、凋亡情况;Western blotting检测Jurkat细胞信号转导通路中相关信号蛋白的变化。结果显示,PAG1、CD59分子均定位于细胞膜上且表达位置重叠。棕榈酰化位点突变后,PAG1与CD59分子虽出现点簇状聚集现象,但二者并不重叠。位点突变不影响细胞增殖和凋亡(P>0.05),但CD59单克隆抗体刺激后,细胞凋亡水平显著下降(P<0.05),且TCR活化通路下游分子非受体酪氨酸激酶Fyn、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck)、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLC-γ1)表达均下降。该研究提示,PAG1棕榈酰化位点突变后不能抑制CD59介导的Jurkat细胞增殖。     

T细胞衔接活化因子-绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及其在Jurkat细胞的定位

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与T细胞衔接活化因子(Linker for activated ofT cells,LAT)融合蛋白的真核表达载体,观测LAT-EGFP在Jurkat细胞中的定位表达.方法:利用RT-PCR技术提取并扩增LAT除去终止密码子外的全部序列,克隆到真核表达载体PEGFP-N3,酶切鉴定并测序.瞬时转染到Jurkat细胞中进行表达,荧光共聚焦显微镜观察LAT-EGFP在Jurkat细胞中的表达及细胞定位.提取转染后细胞总RNA,通过RT-PCR的方法检测LAT-EGFP在转录水平的表达.利用Western blot法进一步鉴定融合蛋白的表达.结果:重组载体经酶切鉴定,切出片段长度在750 bp左右与插入序列长度相符,并进一步进行测序鉴定证实连接完全正确.共聚焦显微镜观察表达的LAT-EGFP融合蛋白定位在细胞膜上,并呈点簇状聚集状态.RT-PCR扩增证实了LAT和EGFP的融合蛋白在Jurkat细胞中在转录水平的表达,Western blot分析进一步证明了LAT和EGFP融合蛋白构建成功,并在蛋白水平上有明显的融合表达.结论:成功构建真核表达载体LAT-EGFP,且融合蛋白LAT-EGFP与野生型LAT在Jurkat细胞中的定位一致,具有功能表达效应,这为后续准确研究具有棕榈酰化位点的跨膜接头蛋白的信号转导作用提供了一种良好的研究载体和方法.     

急性髓系白血病干细胞NOD/SCID小鼠白血病模型的建立

目的探讨用非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠和经流式细胞仪分选出的KG1a中CD34＋CD38-的干细胞亚群建立白血病干细胞（LSCs）动物模型,为靶向治疗LSCs的药物筛选奠定体内实验基础。方法 18只雌性NOD/SCID小鼠,体质量18～20 g,鼠龄6～8周龄。实验组12只,应用流式细胞仪分选KG1a细胞中具有LSCs特性的CD34＋CD38-亚群,以2×106个/只尾静脉注射经全身X射线照射2Gy的NOD/SCID小鼠;正常对照组6只,只注射磷酸盐缓冲溶液。观察两组小鼠的一般情况和白血病发生情况,应用形态学、组织病理检查、流式细胞术、骨髓染色体检查等检测实验组小鼠的外周血、骨髓、肝脏、脾脏的白血病细胞标志。结果接种2周后实验组小鼠外周血可见白血病细胞,接种30 d实验组小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解;外周血、骨髓、肝、脾中均可发现大量的白血病细胞浸润;实验组小鼠骨髓细胞中CD13抗原阳性率15.47%～23.66%,并可见KG1a细胞的核型特征。结论尾静脉接种流式细胞仪分选后的CD34＋CD38-KG1a细胞于全身亚致死量X射线照射后的NOD/SCID小鼠,能成功建成全身播散的白血病模型,为进一步研究LSCs的靶向治疗药物奠定实验基础。     

干扰HMGA2基因表达抑制HL60细胞的增殖及浸润

目的:探索干扰高迁移率族蛋白A2(high mobility group protein A2,HMGA2)基因的表达对HL-60白血病细胞体外增殖、浸润的影响.方法:实验分为3组,实验组为稳定转染慢病毒干扰HMGA2基因表达载体的HL-60细胞;阴性对照组为稳定转染慢病毒空载体HL-60细胞;空白对照组为未转染的HL60细胞.3组分别接种BALB/c裸鼠建立种植瘤模型,检测接种后各个时间点裸鼠外周血和骨髓中白血病细胞的比例(肿瘤负荷)、生活质量,计算接种40 d后各组小鼠的肝脾指数.结果:RT-PCR及Western印迹证明干扰RNA慢病毒表达载体可明显降低HL-60细胞靶基因的表达.接种后骨髓涂片结果显示裸鼠白血病模型成功建立.接种后21,28,40 d,实验组HL-60细胞在小鼠外周血和骨髓中的比例均明显低于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),其白血病细胞比例随接种时间延长而增加的速度亦明显变缓;且实验组小鼠萎糜少动、腹部膨隆、皮下结节等并发症出现时间明显较空白对照组及阴性对照组延迟;接种40 d后实验组小鼠肝脾指数分别为66.76±5.56和20.57±0.75,均明显低于其余两组,差异有统计学意义(P<0.05).结论:干扰HMGA2基因表达,可明显抑制HL60白血病细胞在小鼠体内增殖、浸润.     

人T细胞活化衔接因子基因真核表达载体的构建

目的构建人T细胞活化衔接因子（LAT）基因的真核表达载体。方法以人外周血单个核细胞的cDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增LAT基因编码区的全部序列,克隆人真核细胞表达载体pCMV—Myc中,测序鉴定目的基因并运用核转染的方法转染人外周血T淋巴细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为729bp,以此构建重组质粒pCMV—Myc—LAT,测序结果与Genbank中的人LAT基因cDNA序列一致。转染人外周血T淋巴细胞后可检测到LAT蛋白的表达。结论成功构建了pCMV—Myc—LAT重组真核表达载体。     

抗人CD28激发性单抗对T细胞淋巴瘤的抑制作用研究

目的:研究鼠抗人CD28单克隆抗体(克隆号:2F5)对T淋巴细胞瘤的抗肿瘤效应,为抗体介导肿瘤靶向治疗提供新的方法和思路。方法:流式细胞术检测鼠抗人CD28单克隆抗体2F5对人T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞表面膜型CD28分子的识别;MTT法检测2F5对Jurkat细胞体外增殖的影响;将Jurkat细胞株接种于裸鼠腋下,建立Jurkat细胞荷瘤裸鼠模型;经瘤内多点注射2F5(注射剂量1μg/mm3),逐日观察肿瘤的大小和裸鼠的生存状态。结果:2F5能够识别Jurkat细胞表面CD28分子,阳性结合率可达93.37%;2F5与Jurkat细胞共培养后,显微镜下观察可见胞质中出现黑色颗粒,胞膜破裂,细胞的折光性和立体感减弱;MTT法分析结果显示,抗CD28单抗对Jurkat细胞的体外增殖具有明显的抑制作用;将Jurkat细胞接种35只裸鼠(成瘤率达70%);经瘤内多点注射2F5,35天后荷瘤小鼠体内肿瘤的生长速率明显降低;而生理盐水对照组肿瘤生长无明显改变。结论:鼠抗人CD28单克隆抗体2F5通过与Jurkat细胞表面膜型CD28分子结合对其增殖具有明显的抑制作用,提示CD28分子可作为治疗T淋巴瘤的一个潜在靶点,抗体对治疗CD28分子阳性的肿瘤具有潜在临床应用价值。     

RNAi沉默CD59对急性T系白血病Jurkat细胞株增殖的影响

目的运用RNAi慢病毒沉默CD59的表达,观察其对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株增殖、凋亡的影响。方法构建CD59 RNAi-EGFP融合蛋白慢病毒载体,转染急性T系白血病Jurkat细胞株,筛选出稳定转染的细胞系,空病毒组为阴性对照,未处理的Jurkat细胞系作为空白对照;荧光显微镜和流式细胞仪观察各组的细胞转染效率;ELISA检测各组细胞CD59的表达情况;RT-PCR检测各组CD59基因以及凋亡相关基因Bcl-2/Bax m RNA的表达;CCK8表达检测细胞增殖效率的改变;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。结果荧光显微镜和FCM观察转染效率在90%以上;ELISA结果显示实验组细胞CD59蛋白表达降低;RT-PCR结果显示实验组CD59、Bcl-2 m RNA表达水平降低(P0.05),Bax m RNA表达水平升高(P0.05);CCK8结果显示实验组细胞增殖效率明显降低(P0.05);流式细胞仪结果显示沉默CD59的表达能够促进细胞凋亡(P0.05)。结论沉默D59基因表达可抑制急性T系白血病Jurkat细胞株的增殖能力并诱导细胞凋亡,为临床急性T系白血病的治疗提供了新靶标、新思路。     

阿魏酸通过调节PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制急性T淋巴细胞白血病进展

目的 探究阿魏酸是否可通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路在体内外抑制急性T淋巴细胞白血病进展。方法将急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞分为对照组、阿魏酸处理组和LY294002处理组进行体外实验,对照组正常培养;阿魏酸处理组分别给予不同浓度（1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μmol/L）阿魏酸,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,筛选实验浓度;LY294002处理组给予50μmol/L PI3K/AKT抑制剂LY294002,采用克隆形成实验、流式细胞术、Transwell实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭情况,采用Western blot检测核蛋白Ki67、增殖细胞核抗原（PCNA）、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT蛋白相对表达量。使用30只雄性BALB/c裸鼠建立移植瘤裸鼠模型,平均分为正常组和阿魏酸处理组进行体内实验,正常组接种Jurkat细胞后以生理盐水灌胃,阿魏酸处理组接种Jurkat细胞后以75 mg...     

CD59锚定蛋白对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导中的增强效应

目的用前期构建好的CD59pSUPER-RNAi质粒转染Jurkat细胞,探讨CD59特异性沉默前后CD59对CD3介导Jurkat细胞活化信号转导的相关作用。方法采用Lipofectamine2000转染Jurkat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系,利用RT-PCR检测转染后CD59在基因水平的表达抑制效果。实验分为未转染的Jurkat细胞组(A组),转染空质粒pSUPER组(B组)和转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组(C组),用噻唑蓝(MTT)比色法,Western blot技术和激光共聚焦扫描显微镜分别检测交联CD59单抗与固相化CD3单抗联合作用对3组Jurkat细胞的增殖效应,ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平及细胞浆内钙离子的变化。结果重组载体转染后,经G418筛选得到稳定转染细胞系,RT-PCR结果表明转染CD59pSUPER-RNAi质粒的Jurkat细胞组CD59分子的表达受到抑制。转染干扰质粒Jurkat细胞组CD59与CD3联合作用后细胞增殖能力,ZAP-70酪氨酸磷酸化水平及钙离子浓度均明显低于未转染组和转染空质粒组(P<0.05);但未转染组和转染空质粒组之间无差异。结论 CD59对CD3介导T细胞活化信号转导有增强效应。     

IL-18基因转染对小鼠卵巢癌OVHM体外增殖及体内成瘤的影响

目的:分析转染IL-18基因后,对小鼠卵巢癌OVHM细胞体外增殖、凋亡及体内成瘤的影响,初步探讨IL-18基因转染治疗卵巢癌的应用价值.方法:将逆转录病毒携带的小鼠IL-18基因成功转染至OVHM(OVHM/IL-18),以空载体转染的OVHM(OVHM/LXSN)和野生型(OVHM)作为对照.分别采用MTT、FCM检测体外培养细胞的增殖、凋亡及周期分布.于裸鼠皮下分别接种细胞,观察各组种植瘤生长情况,计算成瘤率;RT-PCR检测瘤组织中IL-18 mRNA表达;FCM和电镜分析肿瘤细胞增殖、凋亡状况.结果:3组细胞的体外增殖未见明显差异,均无明显凋亡现象,增殖指数、细胞周期分布均无明显差异(均P>0.05).接种后,3组裸鼠的成瘤率相同,但OVHM/IL-18组成瘤时间较晚,随瘤龄增长肿瘤生长缓慢,瘤组织中IL-18 mRNA阳性表达.OVHM/IL-18组裸鼠种植瘤细胞可见典型的凋亡现象,G0/G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少,增殖指数明显降低,凋亡指数明显增高(P<0.01).结论:IL-18基因成功转染后,虽对体外卵巢癌细胞无直接毒性,但可能在体内借助非直接杀伤的其他途径,通过阻断细胞周期、促进肿瘤细胞凋亡等抑制体内成瘤.     

应用含标记基因K562细胞制备的小鼠白血病模型

背景:文献报道应用NOD/SCID及SCID小鼠可以建立移植性人白血病小鼠模型,但由于小鼠存在免疫缺陷,使得在自体干细胞移植及移植后相关过继免疫治疗方面的研究受到限制和影响。目的:探索用SPF级Balb/c小鼠和转染GFP及NeoR基因的K562细胞株制备白血病模型的方法。方法:实验分为5组,A、B组和C、D组分别经X射线照射2Gy和3Gy,24h后取对数生长期的K562(GFP+/Neo+)细胞,A、C组尾静脉注射2×106个/只;B、D组尾静脉注射5×106个/只;E组为正常对照组。观察小鼠生存时间,进行骨髓细胞及外周血白细胞分类,采用流式细胞仪测定GFP阳性细胞及PCR方法测定Neo基因。结果与结论:实验各组在接种5~7d时发病,分别于30,23,24,17d内全部死亡;生存天均显著短于正常对照组(P0.01)。体质量均较正常对照组显著下降(P0.05)。小鼠的白血病发病率为100%,无自发缓解。随接种细胞数量的增加和照射剂量的增加,小鼠的存活时间缩短,且外周血及骨髓中白血病细胞所占比例增加。流式细胞仪测定及PCR方法也证实了GFP+细胞和NeoR基因在肝、脾中的存在。结果证实Balb/c小鼠经照射后从尾静脉注射K562细胞株可以制备获得白血病小鼠模型。     

淫羊藿苷(ICA)对化疗后免疫抑制小鼠的免疫促进作用

目的:通过观察淫羊藿苷(ICA)对化疗药环磷酰胺(Cy)所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响,探讨ICA促进免疫功能的作用及机理.方法:除正常组小鼠外,所有小鼠经腹腔注射Cy(300 mg/kg);第二天开始给予实验组小鼠灌胃不同剂量的ICA[150、80、40 mg/(kg·d)],阳性对照组小鼠尾静脉注射参芪扶正注射液(1 ml/d),模型组给予等量生理盐水,连续干预10天.所有小鼠均于末次给药12小时后处死,计算胸腺指数(TI)和脾指数(SI),光镜下计数外周血和脾淋巴细胞数量.MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应.ELISA法检测TNF-α的含量.乳酸脱氢酶实验(LDH)检测小鼠脾脏NK和CTL细胞的活性.流式细胞术(FACS)检测脾淋巴细胞中NKT和CD3+T细胞的比例.结果:模型组小鼠以上各项免疫指标均有所下降.ICA处理组小鼠脾脏指数和胸腺指数均升高(P<0.01),脾淋巴细胞数量显著增加(P<0.01),但未达到正常对照组水平;ICA明显提高小鼠脾淋巴细胞的增殖反应,促进了小鼠脾NK和CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤活性(P<0.01),提高了小鼠脾细胞TNF-α的产生(P<0.01).ICA处理组小鼠脾细胞中CD3+T、NKT细胞比例明显增加(P<0.01).结论:ICA能促进小鼠免疫功能,具有逆转化疗后小鼠免疫抑制状态的作用.     

IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制研究

目的研究IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制,为IL-17基因疫苗进入临床提供实验依据。方法建立稳定转染小鼠IL-17全长基因的小鼠乳腺癌细胞(4T1/IL-17)及相应的对照细胞(4T1/pcDNA3.1、4T1),MTS法检测3种细胞的体外增殖情况;流式法检测3种细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达的变化及3种细胞的凋亡情况。建立荷瘤动物模型,观察3种细胞移植瘤在小鼠体内成瘤性、生长情况及小鼠生存期的变化。接种肿瘤细胞6周后分别检测3组小鼠脾细胞CTL杀伤活性、脾细胞增殖情况。用ELISA法检测小鼠脾细胞经刺激后产生IFN-γ、IL-12的情况;流式细胞技术检测4T1/IL-17细胞接种于小鼠体内的细胞凋亡情况及肿瘤组织细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1等分子表达的变化。结果转染IL-17基因后在体外对4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1细胞的增殖;MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达;细胞凋亡无影响。将4T1/IL-17细胞接种小鼠体内后,荷瘤小鼠的肿瘤生长速度、体积均明显小于4T1/pcDNA3.1细胞组及4T1细胞组,生存时间也明显延长(P<0.05);肿瘤细胞凋亡率明显增高(P<0.05);细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达水平显著性增高(P<0.01);CTL杀伤活性及对ConA刺激的细胞增殖反应性均明显升高(P<0.01);可产生高水平的IFN-γ、IL-12,有显著性差异(P<0.01)。结论 IL-17在体外未显示抗肿瘤作用,IL-17在小鼠体内具有明显的抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用与促进肿瘤细胞细胞凋亡及增强机体免疫应答有关。     

HSP65-PSA融合蛋白的体内外抗肿瘤活性研究

目的:研究热休克蛋白65(HSP65)-前列腺特异性抗原融合蛋白在体外对人树突状细胞的活化作用以及在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用.方法:利用Westernblot方法对融合蛋白HSP65-PSA的特异性进行鉴定;利用共聚焦显微镜、流式细胞术(FCM)检测和斑点杂交的方法对PcDNA3-GFP-PSA稳定转染的B16细胞进行鉴定;用HSP65-PSA融合蛋白刺激来自于人外周血的未成熟树突状细胞,观察融合蛋白对树突状细胞的体外活化作用;用PcDNA3-GFP-PSA稳定转染的B16细胞种植C57BL/6小鼠,继而用HSP65-PSA融合蛋白来免疫小鼠以观察融合蛋白对PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内抑制作用.结果:Western blot检测显示融合蛋白HSP65-PSA具有PSA蛋白特异性.共聚焦显微镜、FCM检测和斑点杂交结果均显示PcDNA3-GFP-PSA转染的B16细胞转染情况良好.体外细胞实验显示,将HSP65-PSA融合蛋白作用于人外周血树突状细胞后可以明显促进树突状细胞表面分子CD86的表达,其上调率为52.93%.动物体内实验显示,HSP65-PSA融合蛋白可以明显抑制PSA阳性B16肿瘤细胞在小鼠体内的生长.10 μg蛋白免疫组的肿瘤体积(4.91±5.21)与对照组(10.56±6.10)相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:HSP65-PSA融合蛋白可以在体外活化树突状细胞,在小鼠体内抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的生长.HSP65-PSA融合蛋白可能具有应用于PSA阳性肿瘤的免疫治疗作用.     

干扰Itk表达抑制CVB3感染小鼠的炎症反应

目的 研究在病毒性心肌炎小鼠模型上敲减Itk蛋白的表达对小鼠炎症反应的影响.方法 BALB/c小鼠尾静脉注射表达Itk-shRNA的质粒后感染CVB3,第4天后观察Itk基因的抑制情况、小鼠存活率,PBMC增殖率及部分炎症性细胞因子的分泌水平.结果 Itk-shRNA转染至小鼠体内后脾细胞中Itk基因的mRNA水平与空白对照组及转染shRNAnon的对照组相比,敲减率约40％(P＜0.05).与转染shRNAnon组相比,Itk-shRNA组中Itk基因表达的抑制导致小鼠PBMC增殖活性降低约41％,小鼠的存活率提高(P＜0.05).Itk-shRNA组血清中细胞因子水平降低.结论 抑制Itk表达能有效降低小鼠PBMC的增殖,同时减少炎症相关细胞因子的分泌,提高小鼠的存活率.     

转染人BTLA基因细胞株的建立及其生物学功能的初步研究

目的:构建B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因转染的细胞作为免疫原,并探讨该基因转染细胞在体外的生物学功能。方法:通过RT-PCR法从经PHA活化的人外周血T细胞中克隆出人BTLA编码区全长基因,经EcoR I和BamHI双酶切后插入逆转录病毒载体pEGZ-Term中构建成重组载体pEGZ-Term/BTLA。用脂质体法以重组逆转录病毒载体转染293T细胞,并用Zeocin抗生素进行长期筛选;流式细胞术分析BTLA在基因转染细胞膜上的表达;通过MTT法和流式细胞术探讨基因转染细胞在体外对T淋巴细胞增殖与活化的影响。结果:流式细胞术检测表明BTLA基因转染的293T细胞膜上能稳定地高表达人BTLA蛋白。BTLA基因转染的293T细胞和T细胞体外共培养显示,与未转染的293T细胞相比,该基因转染的细胞能部分地抑制抗人CD3单克隆抗体(mAb)刺激的T细胞增殖;流式细胞术和ELISA法分析揭示,该基因转染的细胞能够下调T细胞表面活化标志CD25的表达并降低IFN-γ和IL-10的分泌。结论:获得稳定高表达人BTLA基因转染的细胞株。该细胞株在体外对抗人CD3 mAb刺激的T细胞的增殖与活化具有部分地抑制作用。     

转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用

目的 构建转染小鼠可诱导共刺激分子配体(ICOSL)基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株(CHO/ICOSL),探讨其对T细胞体外增殖与活化的促进作用.方法 从小鼠脾脏细胞中抽提总RNA,采用RT-PCR的方法获得小鼠ICOSL基因,经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后装入EGFP-pIRES2真核表达载体中并测序鉴定,用脂质体转染技术将重组载体EGFP-pIRES2/ICOSL转染CHO细胞,经G418加压筛选,流式细胞术和RT-PCR分析其在CHO细胞中的表达.以转染空载体CHO细胞(CHO/Mock)作为对照,将CHO/ICOSL细胞与T细胞体外共培养,通过检测活化T细胞上CD25、CD69的表达及T细胞增殖实验对小鼠ICOSL转基因细胞的生物学功能进行初步研究.结果 CHO/ICOSL基因转染细胞能稳定地高表达小鼠ICOSL分子.与CHO/Mock相比,CHO/ICOSL基因转染细胞能够显著促进T细胞的体外活化与增殖(P＜O.05).结论 成功构建稳定表达小鼠ICOSL的基因转染细胞株,该细胞株能显著促进T细胞的体外活化与增殖,为进一步深入研究该分子生物学功能奠定了基础.