肺炎链球菌溶血素经死亡受体/Fas途径和线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡

目的:探讨肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,Ply)对小鼠RAW264.7细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及机制。方法:Ply蛋白加入RAW264.7细胞培养上清与细胞共孵育。倒置显微镜观察Ply对RAW264.7细胞形态的影响。MTT法检测Ply对RAW264.7细胞的增殖抑制。Annexin V法检测细胞凋亡率。分光光度法检测Caspase-3、8、9活性。免疫细胞化学法检测到Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达。结果:Ply对小鼠RAW264.7细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞24小时后,可见典型的凋亡形态学改变;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞1小时和3小时后,细胞凋亡率分别为32.90%和51.56%(P<0.05);1μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞24小时,Caspase-3、8、9活性均比对照组升高(P<0.05);免疫细胞化学法检测到Bax、Fas表达较对照组增强,Bcl-2表达减弱(P<0.01)。结论:Ply可诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡,诱导凋亡的机制可能是通过死亡受体/Fas途径和线粒体途径双重机制的介导实现。     

沉默CXCL12抑制ox-LDL诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡

目的 探讨CXC趋化因子配体12(CXCL12)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7泡沫化和凋亡的作用及其机制.方法 用60 mg/L的ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化,记为ox-LDL组,不添加ox-LDL的作为对照(NC)组;将si-con和si-CXCL12转染至RAW2...     

载阿霉素聚合物微泡影响多发性骨髓瘤癌干细胞增殖凋亡的研究

制备载阿霉素(DOX)的PLGA微泡(PLGA-MB),观察载药微泡联合超声(US)辐照体外作用于多发性骨髓瘤(MM)癌干细胞(CSC)的效应。采用声振法与乳液法制备载DOX的PLGA微泡,镜下观察其形态,检测其粒径、电位、载药量和包封率。采用免疫磁珠分选法从MM JJN3细胞株分选获得CD138ˉCD34ˉCSC。以不同声强的超声联合空白微泡作用于MM CD138ˉCD34ˉCSC 30s,筛选最佳超声辐照条件。设对照组(I组)、DOX组(II组)、DOX+US组(III组)、DOX-MB组(IV组)、DOX-MB+US组(V组),细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞的存活率,流式细胞术检测细胞的凋亡,透射电镜观察细胞超微结构,Western blotting法检测Bcl-2的表达。DOX-MB粒径均一,分散性好,平均粒径461.6±85.6nm,zeta电位-11.4±2.35mv,包封率(56.51±9.82)%,载药率(7.10±1.04)%。1.0 W/cm2的超声作用30s能大量破泡而对细胞增殖无明显影响。各实验组中,V组的细胞存活率[(41.89±1.11)%]较其他组[I组(98.71±1.16)%,IV组(92.56±3.49)%,II组(73.69±3.24)%,III组(71.13±4.03)%]明显降低(P0.05),V组的细胞凋亡率[(29.05±3.21)%]较其他组[I组(2.33±1.09)%,IV组(3.72±1.58)%,II组(15.14±1.11)%,III组(15.03±3.09)%]明显增强(P0.05)。V组的Bcl-2蛋白表达(灰度值比率0.23±0.06)较其他各组(I组0.82±0.11,II组0.51±0.08,III组0.58±0.12,IV组0.77±0.05)显著降低(P0.05)。PLGA微泡是良好的DOX传递载体,联合超声辐照体外作用于多发性骨髓瘤癌干细胞可通过诱导凋亡产生明显的细胞增殖抑制作用。     

卡介苗诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化与上调CD36表达有关

目的探讨卡介苗(BCG)感染对小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响以及引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的相关机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞, 40μg/mL氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)预处理30 min,按BCG∶RAW264.7巨噬细胞=1∶1、 5∶1、 10∶1、 20∶1比例感染RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色法检测不同感染比例的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响,以确定BCG感染诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的最适感染比例。接着分别用热灭活和未灭活的BCG以最适感染比例感染RAW264.7巨噬细胞,感染24h后分别对各组细胞进行油红O染色和提取RNA,探讨不同活力的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响和对RAW264.7巨噬细胞脂质摄入相关受体清道夫受体A1(SR-A1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、 CD36的mRNA表达水平的影响。结果不同感染比例的BCG均可诱导RAW264.7巨噬细胞发生泡沫样改变,其中以10∶1的感染比例最为明显。灭活BCG与未灭活BCG均引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化,其中未灭活的BCG感染组RAW264.7巨噬细胞泡沫化更为显著。与未感染组相比, BCG感染24 h后, CD36 mRNA的表达显著上调,且上调程度与RAW264.7巨噬细胞泡沫化程度相关。结论 BCG诱导巨噬细胞泡沫化形成可能与CD36的表达上调有关。     

RIP3对BCG感染后小鼠巨噬细胞凋亡的调控作用研究

目的:探讨受体相互作用蛋白3(RIP3)在卡介苗(BCG)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡过程中的调控作用。方法:构建RIP3腺病毒干扰载体并感染巨噬细胞,并用BCG进行感染。采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;利用流式细胞术对细胞凋亡率、线粒体膜电位及活性氧含量进行检测;通过Western blot检测RIP3及凋亡相关蛋白的表达水平。结果:BCG感染RAW264.7细胞后,细胞活力下降且RIP3蛋白表达量显著上调(P0.01)。而与BCG单独感染组相比,BCG感染结合RIP3干扰处理组细胞凋亡率及活性氧含量降低,线粒体膜电位升高,同时促凋亡蛋白Bax与cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低(P0.01)。结论:在BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的过程中,RIP3参与了BCG诱导的RAW264.7细胞的凋亡,且该过程可能是通过线粒体途径实现的。     

黄连素抗Tg和Fuc诱导的小鼠巨噬细胞凋亡的实验研究

目的 研究黄连素抗小鼠巨噬细胞凋亡的作用,初步确定其抗凋亡的浓度,探讨其治疗动脉粥样硬化(athemsclemsis,As)的机制.方法 以0.5 μmol/L的毒胡萝卜素(Tg)和50 μg/ml的墨角藻聚糖(Fuc)诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡为实验模型,通过细胞毒性试验(MTT)法检测细胞存活率,Annexin V-FITC/P1流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 浓度为800 μg/ml的黄连素组与正常对照组细胞存活率相比差异有统计学意义(P<0.01);随着黄连素浓度的下降,细胞凋亡率旱现下降的趋势,黄连素(0.02～0.63 μg/ml)能有效抑制Tg和Fuc诱导的小鼠巨噬细胞凋亡.结论 黄连素对RAW267.4细胞的增殖影响不大.黄连素能有效抑制Tg和Fuc诱导的小鼠巨噬细胞凋亡.     

Krüppel样因子4基因干扰对RAW264.7细胞凋亡和吞噬的影响

目的 应用RNA干扰技术沉默小鼠RAW264.7巨噬细胞Krüppel样因子4(KLF4)基因,建立稳定干扰细胞株,观察其对细胞增殖、凋亡和吞噬活性的影响.方法 针对小鼠KLF4基因设计合成重组KLF4 shRNA质粒,脂质体法将重组质粒转染至RAW264.7细胞,经G418筛选后获得稳定表达细胞株.Western blot法检测细胞中KLF4蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;AnnexinV-FITC/PI双染色法检测细胞的凋亡情况;荧光素标记的大肠杆菌结合流式细胞仪检测细胞的吞噬活性.结果 KLF4 shRNA能明显抑制RAW264.7细胞的KLF4蛋白的表达,抑制率76％以上;从第3天开始,shKLF4组细胞的生长速度明显低于NC组(转染阴性质粒pGPU6/GFP/Neo-NC)(P ＜0.05);WT组(野生型RAW264.7)、NC组和shKLF4组的细胞凋亡率分别为:1.73％、6.85％和12.76％,shKLF4组明显高于NC组(P＜0.05);各组细胞的平均荧光强度分别为:WT组(122.0±2.80)、NC组(48.97±5.69)和shKLF4组(80.10 +4.61),与NC组相比,shKLF4组的细胞吞噬活性明显增高(P＜0.05).结论 成功构建了稳定干扰KLF4基因表达的RAW264.7巨噬细胞株,KLF4下调能够明显抑制RAW264.7细胞增殖,促进细胞凋亡,增强细胞的吞噬活性.     

胰高血糖素样肽-1受体激动剂减轻高糖诱导的巨噬细胞炎性反应的机制

目的 探究胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)激动剂(exendin-4)减轻高糖诱导的巨噬细胞炎性反应的机制.方法 小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)分为3组分别做以下处理:对照组(RAW264.7细胞正常培养基培养)、 高糖诱导组(RA...     

TLR4在铜绿假单胞菌上清液诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡中的作用

目的研究Toll样受体4(TLR4)在铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa,PA)上清液诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7凋亡中的作用。方法 RAW264.7巨噬细胞分为control组(不做任何处理)、MOD组(体积分数为0.10、0.20、0.30的PA上清液处理)、control+TAK-242组(TLR4阻断剂处理)、MOD+TAK-242组(体积分数为0.10、0.20、0.30的PA上清液处理+TLR4阻断剂处理),采用Hoechst染色法观察细胞凋亡后细胞核形态学变化,MTT检测细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测TLR4蛋白的表达。结果与control组相比,MOD组呈现不同程度的细胞凋亡(P0.05),且随着PA上清液体积分数的逐渐增加,细胞凋亡率不同程度逐渐增加(P0.05);加入TLR4阻断剂后,细胞凋亡率比MOD组明显降低(P0.05)。同时随着PA上清液体积分数逐渐增加,TLR4蛋白的表达不同程度逐渐增加(P0.05);加入TLR4阻断剂后,TLR4蛋白的表达水平降低(P0.05)。结论 PA上清液可以诱导TLR4表达,同时促进巨噬细胞的凋亡。然而加入TLR4阻断剂能够明显抑制TLR4的表达和巨噬细胞凋亡,可见TLR4在PA上清液诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡中具有促进作用。     

雪胆素甲通过破坏微丝结构诱导LPS活化的RAW264.7细胞凋亡

目的分析雪胆素甲(CuIIa)对脂多糖(LPS)活化的RAW264.7巨噬细胞的影响,探讨其潜在的抗炎效应及作用机制。方法MTS法检测CuIIa对RAW264.7细胞增殖的作用,相差显微镜观察CuIIa对LPS活化的细胞形态的影响,荧光显微镜观察CuIIa对细胞骨架的影响,流式细胞仪检测亚二倍体(凋亡)峰的变化,免疫印迹检测Cleaved caspase-3、生存素以及G-actin与F-actin的变化。结果 CuIIa能明显抑制RAW264.7细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性,但单独CuIIa不能有效诱导细胞凋亡。CuIIa使LPS活化的伸展细胞收缩变圆,伪足突起消失,G-actin水平下降,细胞内发生严重的Actin聚集,说明微丝结构被破坏。随着CuIIa浓度的增加,其诱导LPS活化的RAW264.7细胞处于sub-G0/G1(凋亡峰)的数量明显增加。免疫印迹分析显示CuIIa使Caspase-3明显活化,生存素急剧下降。结论 CuIIa可能通过引起Actin聚集而破坏微丝细胞骨架,诱导LPS活化的RAW264.7细胞发生凋亡,从而发挥其抗炎效应。     

分枝菌酸诱导巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定

目的探讨分枝菌酸(MA)包被聚苯乙烯微球诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫细胞化的条件及特性。方法将RAW264.7细胞分为空白对照组和分别包被(0、25、50、75、100)μg/mL MA的聚苯乙烯微球实验组,分别将细胞与聚苯乙烯微球混匀、共同孵育24、48、72 h、5 d和8 d后,油红O染色后显微镜下观察细胞形态,采用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定各组泡沫细胞内胆固醇酯的含量,采用MTT法检测细胞增殖水平。结果当包被MA浓度为75μg/mL、吞噬时间为24 h时,RAW264.7能形成典型的泡沫细胞,其细胞内胆固醇酯相对含量为60.98%±1.32%;随着吞噬时间延长,形成泡沫细胞所需的MA的浓度逐渐递减;且随着细胞泡沫化程度增加,细胞增殖活力逐渐减弱。结论 MA包被聚苯乙烯微球可快速诱导巨噬细胞形成泡沫细胞,MA浓度与细胞泡沫化程度呈正相关,且有时间依赖性。     

槐定碱对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14、P38、iNOS表达的影响

目的 探讨槐定碱不同给药方式对内毒素诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞表达CD14、p38 MAPK及i NOS的影响及意义。方法 采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞建立细胞炎症反应模型;实验细胞分为4组(n=6):空白对照组、LPS组、槐定碱预处理组、槐定碱预混合组;分别利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测RAW264.7巨噬细胞CD14、p38、i NOS m RNA表达量及蛋白表达量。结果 槐定碱2种给药方式(预处理及预混合)均可显著下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞p38、i NOS m RNA及CD14、p-p38、i NOS蛋白表达;槐定碱与LPS预混合可下调LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞CD14 m RNA表达,而槐定碱预处理对CD14 m RNA表达无明显影响。结论 槐定碱可能通过调控CD14、p38、i NOS表达与活化发挥抗内毒素效应。     

甲基莲心碱对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响

目的探讨甲基莲心碱(Nef)对巨噬泡沫细胞形成的作用及机制。方法采用体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,ox-LDL诱导建立泡沫细胞模型,用Nef进行干预。油红O染色观察细胞内脂质堆积情况,酶比色法定量细胞内总胆固醇和胆固醇酯的变化,免疫荧光和流式细胞术分析CD36受体蛋白表达,RT-PCR检测CD36受体mRNA表达。结果与ox-LDL诱导组相比,Nef保护组巨噬细胞的油红O染色阳性细胞数和细胞内脂质含量均显著减少;同时CD36受体蛋白和mRNA表达明显降低。结论Nef可抑制ox—LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞泡沫化,该作用可能与Nef下调巨噬细胞CD36受体表达,从而减弱巨噬细胞对ox—LDL的摄取有关。     

羧胺三唑抑制肿瘤细胞诱导的巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α的释放

目的观察体外培养的肿瘤细胞对巨噬细胞炎症因子——肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的诱导作用;初步探索羧胺三唑(CAI)对肿瘤诱导的巨噬细胞中TNF-α释放的影响。方法利用transwell装置,建立Lewis肺癌细胞(LLC)与RAW264.7巨噬细胞共培养体系,采用荧光定量PCR方法和ELISA方法分别分析RAW264.7中TNF-α的表达和释放;用LLC条件培养基(LCM)诱导RAW264.7,同时给予CAI处理,采用CCK-8方法分析LCM和CAI对RAW264.7活力的影响,采用ELISA方法分析CAI对诱导后的RAW264.7中TNF-α释放的影响。结果与LLC共培养24 h可显著增加RAW264.7中TNF-α相对表达量[单独培养vs共培养,(1.00±0.12)vs(2.23±0.17),P<0.01]和释放[单独培养vs共培养,(65.21±12.76)vs(143.92±19.22)pg/ml,P<0.05];LCM和CAI在1 h和4 h对RAW264.7活力没有影响,CAI可以显著抑制LCM对RAW264.7中TNF-α释放的诱导(4 h,P<0.01)。结论 LLC肿瘤微环境可以诱导RAW264.7中TNF-α的表达增加;CAI对这种诱导的抑制使其在肿瘤环境中表现出一定的抗炎作用,可能是其抗肿瘤作用的机制之一。     

低氧增强巨噬细胞中脂多糖诱导的IL-1β表达

目的探讨低氧对巨噬细胞表达IL-1β的作用及可能机制。方法给予巨噬细胞系RAW264.7常氧(21%O_2)、低氧(2%O_2)、常氧联合脂多糖(LPS)培养和低氧联合LPS培养,RT-q PCR检测Vegf、Nlrp3和Il1b的mRNA水平,Western blot检测HIF-1α、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1、Pro-IL-1β和IL-1β的蛋白水平;Vhlfl/fl/Apoe~(-/-)及Vhl~(ΔMac)/Apoe~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞给予或不给予LPS培养,RT-q PCR检测Vhl、Nlrp3、Il1b和Il6的mRNA水平。结果与常氧组相比,低氧仅显著升高RAW264.7 Vegf、Nlrp3和Il1b的mRNA水平(P0.01)。给予LPS培养后,与常氧组相比,低氧可进一步升高LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中NLRP3和IL-1βmRNA及蛋白水平(P0.01),低氧联合LPS培养不能激活caspase-1及剪切Pro-IL-1β。给予LPS培养后,Vhl~(ΔMac)/Apoe~(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞与Vhlfl/fl/Apoe~(-/-)小鼠相比,Nlrp3、Il1b和Il6的mRNA表达水平升高更显著(P0.05)。结论低氧可以放大巨噬细胞中LPS诱导的IL-1β表达。     

TGF-β对RAW264.7细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨TGF-β对RAW264.7细胞增殖、凋亡的影响。方法采用RANKL和M-CSF诱导RAW264.7细胞培养24 h后,用不同浓度TGF-β分别作用RAW264.7细胞24、48、72 h。使用CCK-8试剂盒、流式细胞术及RT-PCR检测破骨前体细胞增殖、凋亡和特征性基因的表达差异。结果不同浓度(1、2、5 ng/mL)的TGF-β均能抑制RAW264.7细胞增殖,且与时间、浓度有关。TGF-β(5 ng/mL)处理组培养72 h后与其他浓度处理组相比,细胞增殖明显降低,细胞总凋亡率及线粒体凋亡通道相关基因Caspase-3、Caspase-8表达升高,差异具有显著性(P0.05)。结论 TGF-β抑制RAW264.7细胞增殖,促进其凋亡,表明TGF-β在骨改建中发挥重要作用。     

超声微泡联合脂质体介导双自杀基因杀伤MCF-7细胞的实验研究

目的探讨超声辐照微泡联合脂质体介导双自杀基因(CD/TK)对MCF-7细胞的体外杀伤作用。方法将培养的MCF-7细胞分为5组:裸质粒组、脂质体组、超声辐照微泡组、超声辐照脂质体组、超声辐照微泡联合脂质体组。转染pEGFP-KDRp-CD/TK质粒于MCF-7细胞,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。转染后,再分为空白对照组、未转染组、转染组;未转染组和转染组又各分为3个亚组,给予前药丙氧鸟苷(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-Fc)、GCV+5-Fc。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测双自杀基因对MCF-7细胞的体外杀伤作用。结果超声辐照微泡联合脂质体组绿色荧光蛋白(GFP)表达最多、最强。超声辐照微泡联合脂质体组转染率(39.59%±1.19%)最高(P0.05)。MTT检测细胞抑制率结果显示,转染组细胞抑制率明显高于未转染组(P0.01),转染组中联合用药组细胞抑制率明显高于单一用药组(90.77%±2.68%vs 64.75%±2.27%、67.81%±2.43%;P0.05)。转染组各前药组细胞抑制率均显著高于超声辐照微泡联合脂质体对MCF-7细胞的转染率(P0.05)。结论超声辐照微泡联合脂质体能明显提高基因转染效率,是较理想的乳腺癌基因治疗策略。     

葫芦素E对脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的影响及作用机制

分析葫芦素E(CuE)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症反应的影响,研究其抗炎作用的分子机制。采用改良MTT法检测RAW264.7细胞的增殖;以碘化丙锭染色检测CuE对细胞周期的影响;采用细胞内细胞因子染色法分析肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达;免疫荧光染色分析胞内Actin的结构;应用免疫印迹法检测CuE对G-肌动蛋白(G-ac-tin)及核转录因子NF-κB核转位的影响。实验结果显示CuE对RAW264.7细胞的增殖具有剂量依赖性抑制作用,并降低细胞内G-actin的水平;CuE明显阻止LPS诱导的细胞伸展和伪足形成,使细胞周期阻滞于G2/M期。同时,CuE还明显抑制LPS活化的RAW264.7细胞表达促炎因子TNF-α,并显著降低LPS诱导的转录因子NF-κB的核转位作用。这些结果表明,CuE通过破坏RAW264.7巨噬细胞的肌动蛋白细胞骨架,引起细胞周期阻滞,并抑制LPS诱导的NF-κB核转位以及TNF-α的表达,从而发挥抗炎作用。     

对甲苯磺酰维达列汀抑制巨噬细胞焦亡和促进其凋亡的研究

目的:探讨对甲苯磺酰维达列汀(PV)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞焦亡和凋亡的影响,及其可能的抗炎机制.方法:MTT法检测RAW264.7的细胞活力;细胞流式术检测RAW264.7细胞的凋亡;Western blot检测caspase-3和caspase-1蛋白的表达;ELISA检测细胞培养上清液中肿...     

多壁碳纳米管对单核巨噬细胞的毒性作用

目的:研究多壁碳纳米管(p-MWCNTs)与牛磺酸修饰的多壁碳钠米管(tau-MWCNTs)在体外对小鼠的单核巨噬细胞RAW264.7细胞的毒性作用.方法:p-MWCNTs与tau-MWCNTs作用于RAW264.7细胞后,观察RAW264.7细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率、细胞形态、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和凋亡...