脑膜炎大肠埃希菌侵袭素IbeA结合多肽的初步研究

目的脑膜炎大肠埃希菌（E．coli）侵袭素IbeA通过与脑微血管内皮细胞表面受体结合,从而介导细菌穿透血脑屏障引起新生儿细菌性脑膜炎。为通过肽库筛选获得与IbeA蛋白结合的多肽,建立噬菌体随机肽库筛选IbeA结合多肽模体的方法。方法首先制备靶分子,用PCR扩增出全长ibeA基因序列,克隆至表达载体pET28a中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）．经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白,经变性复性后通过Ni^2＋-NTA亲和层析柱得到纯度达90％的重组蛋白。然后以固相化IbeA重组蛋白为靶亲和筛选噬菌体线性12肽库。结果经过3轮淘选,得到能和IbeA结合的24个重组噬菌体克隆;挑选15个亲和力高的克隆进行DNA测序,对比分析所得的短肽序列。固相Fmoc法合成短肽,并进行结合实验、阻断实验和竞争抑制实验。绪论以重组表达的IbeA融合蛋白为靶筛选得到的重组噬菌体十二肽克隆,能够和IbeA蛋白结合,为IbeA蛋白结合多肽。结果提示所筛选的阳性噬菌体克隆及其合成肽可能模拟IbeA受体表位的结构。     

EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒（EBV）LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽。方法利用亲和层析柱加酶切的方法纯化CTAR23蛋白．并用其筛选噬菌体12肽库。通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力。通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析。结果对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果。ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS。结论噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础。     

人67 LR噬菌体结合肽的筛选与功能分析

目的 为了获得能够与人67 ku层黏连蛋白受体(67 ku laminin receptor,67 LR)特异性结合的噬菌体呈现肽.方法 以重组人67LR蛋白为诱饵,分别对噬菌体12肽库和环7肽库进行亲和凝胶筛选,ELISA测定所筛选噬菌体克隆与靶蛋白的亲和力,经测序分析得到67 LR特异性结合噬菌体克隆,并通过293细胞侵袭转移实验测定阳性噬菌体呈现肽对67LR促细胞侵袭作用的抑制效果.结果 经4轮筛选共筛到2类新的67LR结合肽,分别具有DXCETCT(X可变)和YRPMXEY(X可变)一致序列.其中DX-CETCT噬菌体呈现肽可显著抑制67 LR所诱导的细胞侵袭,且这种抑制作用与YIGSR 5肽具有一定互补性.结论 成功筛选到2类新的67 LR结合肽,其中DXCETCT噬菌体呈现肽可针对性抑制67LR所诱导的细胞侵袭作用.     

P-糖蛋白结合肽的筛选及合成肽鉴定

目的 筛选人膀胱癌P-糖蛋白特异性结合肽并合成鉴定.方法 利用表达获得的P-糖蛋白胞外段融合蛋白为靶蛋白,采用酶联板法筛选噬菌体随机12肽库,化学合成该特异性肽序列,免疫细胞化学方法进行鉴定.结果 从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P-糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆,测序获得特异性结合肽序列.免疫细胞化学结果显示特异性合成肽可与耐药细胞BIU-87/ADM结合,而与敏感细胞BIU-87不结合.结论 筛选获得的结合肽具有一定的亲和力,可与特定的肿瘤细胞结合,表现出一定的肿瘤特异性;P-糖蛋白结合肽的筛选,为人膀胱癌多药耐药的靶向治疗结论提供实验依据.     

从噬菌体随机肽库中筛选拮抗IL-5的抑制多肽

目的　通过噬菌体随机肽库筛选与白细胞介素 5 (IL 5 )高亲和力结合的相关多肽 ,观察这些多肽是否能够抑制IL 5的生物功能。方法　以重组人IL 5作为筛选分子 ,应用M13噬菌体PⅢ呈现随机 7肽库进行筛选 ,经ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与IL 5的亲和力。阳性噬菌体克隆呈现多肽和人工合成多肽对IL 5介导的嗜酸细胞 (Eos)存活的影响。结果　经过 3轮淘筛后 ,经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL 5呈高亲和力结合 ,其中 3个具有抑制IL 5介导的Eos存活延长作用。选择抑制作用最强的呈现多肽进行人工合成 ,发现其中一个合成多肽能够诱导Eos凋亡 ,抑制IL 5介导的存活延长作用 ,但作用强度不如噬菌体呈现多肽。结论　通过噬菌体肽库能够筛选到抑制IL 5功能的相关多肽 ,为进一步研究抗IL 5的分子药物奠定了基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白1羧基端活化区域2蛋白特异性结合短肽的筛选

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒潜伏膜蛋白1(LMPl)羧基端活化区域(CTAR)2蛋白特异性结合的短肽.方法 用纯化的CTAR2蛋白筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与CTAR2蛋白的亲和力.利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 CTAR2蛋白对噬菌体12肽库进行3轮筛选,第3轮的产率是第1轮的143倍[(3.0×10-6)/(2.1×10-8)],噬菌体克隆得到较好的富集.ELISA方法提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR2蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％.测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列:GLKHHSPGLLLY.结论 筛选出与CTAR2蛋白特异性结合的短肽序列GLKHHSPGLLLY,为研究LMP1致瘤机制和开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物提供实验依据.     

利用噬菌体随机肽库筛选IL-5结合的相关多肽

目的：采用噬菌体随机肽库筛选人IL-5，以获得能高亲和力结合IL-5的相关多肽。方法：以重组人IL-5作为筛选分子，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选。经过三轮淘筛后，经夹心ELISA、竞争ELISA法进一步鉴定噬菌体克隆与IL-5的亲和力，对阳性克隆进行了扩增和DNA测序，据此推导结合随机多肽的氨基酸序列。结果：经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL-5呈高亲和力结合。通过测序和序列比较分析，发现CX1-2AS为相对保守的结合表位。结论：研究表明通过噬菌体肽库能够筛选到IL-5结合的相关多肽，为进一步研究IL-5结合表位及抑制剂奠定了基础。     

麻痹性贝类毒素GTX2,3模拟表位的初步研究

目的:利用噬菌体展示随机肽库筛选可模拟麻痹性贝类毒素GTX2,3抗原表位的噬菌体,初步鉴定人工合成的GTX2,3抗原表位肽的特异性。方法:以抗麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体(mAb)为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行3轮免疫亲和筛选,以夹心ELISA方法鉴定噬菌体克隆,竞争ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的特异性。对阳性克隆进行DNA测序并推导噬菌体所展示的氨基酸序列。竞争ELISA鉴定模拟GTX2,3表位的合成肽的特异性。结果:经过3轮筛选获得20株能与靶分子高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。序列分析表明DXLXPP为保守序列(X为任意氨基酸)。竞争ELISA检测表明,麻痹性贝类毒素GTX2,3可抑制阳性噬菌体克隆phage2与抗GTX2,3mAb结合。根据阳性序列合成的短肽可以抑制phage2与抗GTX2,3mAb的结合(IC50=13μg/mL)。结论:通过噬菌体肽库筛选技术,成功地获得麻痹性贝类毒素GTX2,3的模拟表位,并初步证实以此为基础合成的短肽能够准确和特异的模拟GTX2,3的表位。     

大肠杆菌脂多糖2630模拟位的研究

目的 :利用纯化的抗大肠杆菌L2 6 30多抗筛选噬菌体环七肽库 ,以获得可模拟脂多糖 (LPS)表位的短肽克隆。方法 :以亲和层析纯化的抗大肠杆菌L2 6 30多克隆抗体为靶分子 ,筛选噬菌体随机环七肽库 ,用双夹心ELISA和竞争抑制ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的抗原性。结果 :对噬菌体环肽库进行 3轮筛选后 ,随机挑选 2 0个克隆 ,经鉴定其中 12个可与抗L2 6 30抗体结合 ,即为阳性克隆 ;其中有 5个阳性噬菌体克隆表现出与抗鼠伤寒沙门氏菌LPS多抗结合的活性 ,提示这 5个噬菌体展示的短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的性质。经DNA序列分析显示 ,其中 8个克隆的氨基酸序列具有X DGLL XX或X EDGLL X保守序列 ,其余 4个克隆的序列均不相同。结论 :筛选获得的噬菌体环七肽克隆具有模拟大肠杆菌LPS表位的活性 ,为大肠杆菌L2 6 30多表位模拟短肽。其中 5个阳性噬菌体克隆短肽具有模拟大肠杆菌LPS及鼠伤寒沙门氏菌LPS共同表位的活性     

基于人HMGB1-B box的抑制性小肽筛选及其抗炎功能分析

目的 从噬菌体构象型7肽库中筛选人HMGB1-B box的抑制性小肽.方法 以重组人HMGB1-B box为靶分子对噬菌体构象型7肽库进行6轮亲和筛选,获得B box结合的克隆,并经ELISA验证.选取亲和力高的克隆进行DNA测序,并推导出呈现的多肽序列,通过IL-6 ELISA检测噬菌体呈现的小肽对人HMGB1-B box致炎功能的抑制作用.结果 经过6轮亲和筛选,噬菌体的回收率增加,阳性克隆得到富集.挑选15个结合力强的克隆进行测序,推导出2个多肽序列.所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制人HMGB1-B box刺激THP-1细胞产生炎症因子的能力.结论 获得了噬菌体呈现的能够抑制人HMGB1-B box的两个小肽.     

C1q结合十二肽的筛选与初步鉴定

目的　从噬菌体十二肽库中筛选结合C1q的短肽并进行初步鉴定。方法　以C1q为钓饵蛋白筛选噬菌体十二肽库 ,利用ELISA、U937细胞配体结合抑制试验、多聚IgG(AIgG)竞争抑制试验鉴定阳性克隆 ,再进行单链DNA测序和分析。结果　经 3轮筛选后 ,随机挑选 2 5个噬菌体克隆做ELISA鉴定 ,14个克隆显示与C1q有较强的结合。经过U937细胞配体结合抑制试验和AIgG竞争抑制试验鉴定后 ,将此 14个阳性克隆测序 ,从其展示肽DNA测序结果推导氨基酸序列 ,获得 9条氨基酸序列 :HWDPFSLSAYFP、WTPVRTNPFLLH、NGHLFSLSAYFP、RTQRNSPFFLCP、SPAFHPEHMGRG、SRAFHPFYRGRA、WYEGPFTLQTWP、LTQHNSPFFLLP和TSNPFFLWYPQP。结论　获得结合C1q的一些抑制性短肽 ,它们可能成为抑制补体经典途径激活的肽类先导化合物     

从噬菌体短肽库中筛选单克隆抗体识别的抗原表位

将随机合成的寡聚核苷酸重组到噬菌体表面单价表达载体，构建了噬菌体随机八肽库。以抗原识别性明确的单克隆抗体９Ｅ１０固相化，对噬菌体短肽库进行了４～５轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，任选多个所获克隆进行ＥＬＩＳＡ检测。发现第４轮后６／２２个克隆可与９Ｅ１０结合，第５轮后１０／１０可与９Ｅ１０结合，此结合反应可被９Ｅ１０所针对的十肽抗原以及游离的９Ｅ１０特异性抑制。对所获阳性克隆进行ＤＮＡ序列测定发现，它们的序列可分为两种，其中一种序列与ｃ－ｍｙｃ十肽具有同源序列ＩＳＥｘｘＬ，而另一种的序列则完全不同。证实噬菌体表面单价表达体系用于构建噬菌体短肽库的有效性，为进一步筛选其它的具有高亲和力的特异性短肽打下了基础。     

噬菌体表达短肽模拟乙脑病毒糖蛋白的研究

为研究日本脑炎病毒 (JEV )E蛋白模拟肽 ,将抗JEVE蛋白的mAb 2H4淘筛噬菌体 15肽库。经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后 ,随机挑取 10个阳性克隆 ,测序并与JEVE蛋白同源比较。将阳性噬菌体免疫小鼠 ,检测血清中特异性抗体。ELISA结果显示筛选到的噬菌体能特异地与mAb 2H4结合 ,并且这种结合可被JEV天然抗原所竞争抑制。 10个阳性克隆的氨基酸序列相同 :—RQDPQWPYANSTIAR— ,同源分析得到的序列STXAR可能为mAb 2H4识别的模拟表位。阳性噬菌体表达的 15肽能够刺激小鼠产生特异性抗体。该噬菌体表达短肽模拟JEVE蛋白的部分抗原性。     

以特异性噬菌体展示肽为靶筛选TNF-α结合肽的研究

目的：建立以特异性噬菌体展示肽为靶从噬菌体肽库中筛选结合表位的新方法。方法：以前期工作中筛选得到的模拟TNF－α表位的环七肽克隆LCS－7（c-RRPAQSG-c)为靶，筛选噬菌体线性十二肽库；用间接ELISA及竞争试验鉴定阳性克隆。结果：对噬菌体十二肽库进行3轮筛选后，挑取20个克隆中有10个为阳性克隆，测序结果氨基酸序列相同：EHMALTYPFRPP。结论：以TNF－α模拟肽克隆为靶筛选得到的噬菌体十二肽克隆，能够与TNF－α结合，为TNF－α结合肽；所测得序列完全一致。上述结果提示了该筛选方法的可行性。     

利用噬菌体肽库筛选HeLa细胞表面与人CD59结合的活性短肽

目的寻找HeLa细胞表面与人CD59特异性结合的短肽序列。方法分别用非转基因HeLa细胞和转染CD59基因的HeLa细胞的裂解蛋白进行5轮亲和筛选,并通过竞争结合实验,然后用ELISA方法筛选噬菌体阳性克隆。提取单克隆DNA测序,并对其进行DNA序列分析推导出短肽序列。结果随机挑选的16个单克隆中有10个克隆对HeLa细胞有特异性结合力,经测序得到一条高度同源的多肽序列。结论通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞蛋白筛选,得到了噬菌体多肽能高特异性与肿瘤细胞结合的短肽序列,为下一步设计肿瘤逃逸相关的CD59活性位点的短肽药物提供了参考依据。     

从噬菌体15肽库中筛选乙脑病毒糖蛋白模拟肽

目的 用抗JEVE蛋白的mAb2H4筛选噬菌体15肽库,以研究JEVE蛋白模拟肽。方法 用生物素标记的mAb2H4,对噬菌体随机15肽库进行3轮筛选,经ELISA鉴定后,随机挑战取10个阳性噬菌体克隆测序,并与JEVE蛋白进行同源性比较,结果 筛选到的噬菌体能与mAb2H4特异地结合,并且这种结合可被天然JEV抗原所抑制,10个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列相同,均为RQD-PQWPYANSTIAR,同源分析表明,在JEVE蛋白不同区域有两个同源性较高的序列：STXAR和WXXAXST,阳性噬菌体展示肽了能与抗天然JEV抗原的鼠血清产生特异性反应。结论 筛选的该噬菌体克隆展示肽可模拟JEVE蛋白的部分抗原性。     

丙型肝炎病毒NS5ab区的B细胞模拟表位的确认

目的：用噬菌体展示随机肽库研究丙型肝炎病毒(HCV)NS5ab区的B细胞表位。方法：在原核系统中表达了HCV NS5ab重组蛋白，亲和层析纯化血清中抗HCV NS5ab的特异多抗，用此多抗来筛选噬菌体递呈随机12肽库，获得HCV NS5ab区的B细胞表位。结果：成功地表达了HCV NS5ab重组蛋白，用此蛋白检验了130份HCV阳性血清，阳性率为36％。在筛选的噬菌体展示随机肽库后，挑取13个阳性克隆测序，有9个序列不同，最终通过噬菌体表位表达的方法确认了3个表位。结论：筛选噬菌体展示随机肽库研究HCV的B细胞模拟表位是可行的。     

结核分枝杆菌抗原模拟肽的筛选和鉴定

目的 应用噬菌体随机12肽库免疫淘筛结核分枝杆菌抗原模拟肽.方法 以结核患者血清IgG为靶分子,3轮淘筛噬菌体随机12肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆,并进行测序分析.选择高频出现的阳性克隆用ELISA法初步分析其诊断能力.结果 经3轮免疫筛选,噬菌体得到有效富集,12个阳性噬菌体克隆经测序分析获得6种短肽序列.高频出现的两个阳性克隆诊断结核病的敏感性分别为71.4％ (A2)和55.4％ (A7).结论 结核患者血清IgG筛选噬菌体随机12肽库获得了能结合抗结核抗体的噬菌体展示短肽.     

利用噬菌体随机肽库筛选抗呼吸道合胞病毒多肽的实验研究

目的：采用完整的呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV)颗粒筛选噬菌体肽库，以获得能高亲和力结合并能抑制该病毒复制的特异性多肽，方法：Hep-2细胞培养RSV，采用蔗糖密度梯度（30％、45％、60％）和超滤离心纯化病毒，病毒用生物素标记后，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选，经过3轮淘筛后，ELISA进一步鉴定噬菌体克隆与RSV的亲和力，通过TCID50检测其抗病毒复制能力，选取与RSV具有高亲和力的阳性克隆进行DNA测序，据此推导多肽的氨基酸序列，结果：经鉴定得到13个阳性噬菌体克隆能与RSV呈高亲和力结合，其中3个克隆体外能明显抑制RSV的复制，使TCID50由10^－8．1SFU／ml分别降至10^-4.1、10^-4.3、10^3.8SFU/ml。DNA测序发现各个克隆之间缺乏明显的同源序列，但普遍含有较多的脯氨酸，结论：通过噬菌体肽库能筛筛选到抗病毒作用的阳性克隆，为进一步开发高效RSV的诊断和治疗试剂奠定基础。     

从随机肽库中筛选抗入ANG抗体的模拟小肽

目的从随机噬菌体十二肽库中寻找抗重组人 ANG抗体的模拟肽。方法以重组人 ANG为目标分子 ,对随机十二肽库进行亲合筛选 ,用噬菌体 EL ISA及竞争抑制实验鉴定阳性克隆的结合性和特异性。结果经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率从 2 .0× 10 - 4 %增加到 9.3× 10 - 2 % ,阳性克隆得到富集 ;EL ISA和竞争抑制实验证明 :有 9个噬菌体克隆与靶分子有较强的结合活性 ,其中 6个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制抗人重组 ANG单抗与 ANG的结合。结论该小肽可能是抗人ANG抗体的模拟小肽 ,可作为 ANG的拮抗剂