蟾酥中蟾毒配基类成分的分离纯化及其体外抗肿瘤活性的研究

目的:研究蟾酥中蟾毒配基类成分的分离纯化方法,并初步考察其体外抗肿瘤活性。方法:采用硅胶柱层析法纯化蟾酥药材粗提物,高效液相法测定三种蟾毒配基含量,以此确定最佳纯化工艺;MTT比色法测定药物对肿瘤细胞的生长抑制作用。结果:用优化工艺制备得到的纯化产物蟾毒配基类成分平均含量为95.98%;纯化产物具有显著的抑制肿瘤细胞生长作用,在0.001～100μg/mL的浓度范围内,药物对人乳腺癌MDA-MB-435细胞和人肺癌A549细胞有很强的抑制作用。结论:硅胶柱层析法适合于蟾酥中蟾毒配基类成分:脂蟾毒配基、华蟾毒基、蟾毒灵的制备,且纯化产物体外抗肿瘤作用显著。     

干蟾皮中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的纯化及其体外抗结肠癌活性的研究

目的:探讨干蟾皮中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的分离和纯化方法,并考察其体外抗结肠癌活性。方法:采用硅胶柱层析法纯化干蟾皮中的酯蟾毒配基和华蟾酥毒基,考察径高比、上样量及洗脱曲线对酯蟾毒配基和华蟾酥毒基纯化的影响;采用MTT法测定纯化产物对结肠癌细胞CT-26的生长抑制作用,考察其体外抗结肠癌活性。结果:纯化条件径高比为2∶14,上样量为10g(干蟾皮原生药材),洗脱溶剂用量为160m L。在9.32~300μg/m L浓度范围内纯化产物对结肠癌细胞有较强的抑制作用,并且呈时间和剂量依赖关系。结论:硅胶柱层析法适合于干蟾皮中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基的分离、纯化,且纯化产物体外抗结肠癌作用明显。     

蟾酥中蟾毒配基类成分的提取纯化工艺研究

目的优化蟾酥中脂溶性成分华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的提取及纯化工艺。方法以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为考察指标,以乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间为考察因素,采用正交试验确定最佳提取工艺参数;通过单因素考察并结合Box-Behnken响应面法,以展开剂比例、柱高与直径比、吸附剂与上样量的比值为考察因素,筛选并确定最佳纯化工艺。结果确定最佳提取工艺为加入10倍量85%的乙醇提取90min;最佳纯化工艺为展开剂环己烷-氯仿-丙酮(4∶3∶3),柱高与直径比为7∶1,吸附剂-上样量为5.5∶1,2种蟾毒配基纯化后的总量可达66.51%。通过3批放大工艺验证,表明模型拟合度良好,采用硅胶柱色谱分离纯化蟾毒配基,具有操作简便、分离速度快、分离效果好等优点。结论所选工艺合理、可行,为以后该产品的产业化应用提供技术参考和依据。     

蟾酥中3种脂溶性有效成分提取工艺及含量测定方法

目的:优化蟾酥中脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的提取工艺,并建立了测定蟾酥提取物中上述3种成分含量的HPLC方法。方法:以蟾酥中脂溶性成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基含量为指标,采用L9(34)正交试验对蟾酥提取工艺进行了优化;建立的HPLC法,Diamonsil-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-水(55:45),流速1.0mL.min-1,检测波长296 nm。结果:最佳提取工艺条件为A2B3C3D2,即75倍量95%乙醇80℃提取120 min;所建立的HPLC方法蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分离,且重现性、精密度、线性关系良好,最小检测限分别为14.6,9.0,11.8ng.mL-1。结论:确定了蟾酥最佳提取条件,HPLC能准确测定蟾酥提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的含量,方法简便,结果准确。     

不同蟾皮提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基血浆蛋白结合率的研究

目的研究不同蟾皮提取物中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率。方法采用平衡透析法,以高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定,比较两种蟾皮提取物及不同浓度的蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基对照品溶液的血浆蛋白结合率。结果建立的LC-MS/MS法线性良好,精密度、准确度、回收率以及稳定性均符合生物样品分析要求。3种不同浓度蟾毒灵的血浆蛋白结合率分别为(75.03±1.97)%、(72.33±2.51)%、(71.80±1.53)%;蟾皮药材提取物1中的为(-16.67±1.58)%,蟾皮药材提取物2中的为(71.93±1.48)%。3种不同浓度的华蟾酥毒基血浆蛋白结合率分别为(52.33±4.13)%、(52.47±3.84)%、(47.60±2.46)%;蟾皮药材提取物1中的为(-51.23±3.53)%,蟾皮药材提取物2中的为(40.93±1.29)%。3种不同浓度的脂蟾毒配基血浆蛋白结合率分别为(91.27±1.09)%、(93.60±0.85)%、(88.13±0.76)%;蟾皮药材提取物1中的为(52.67±3.58)%,蟾皮药材提取物2中的为(80.13±2.38)%。结论蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率跟药物浓度不呈依赖性,蟾皮药材提取物1中蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率显著低于对照品蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基,而蟾皮药材提取物2的血浆蛋白结合率基本与对照品一致;提示蟾皮药材提取物1中混合物体系导致蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的血浆蛋白结合率的改变。     

温度、光照及pH对蟾酥提取液中指标成分稳定性的影响

目的:考察温度、光照及pH对蟾酥提取液中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、总蟾毒色胺稳定性的影响。方法:采用HPLC测定蟾酥提取液中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量,检测波长296 nm,流动相乙腈-水(58∶42);利用UV测定蟾酥提取液中总蟾毒色胺的含量,检测波长559 nm。分别考察高温(60,40℃),强光照射[(4 500±500)Lx]及不同pH(40℃,pH分别为4.32,4.99,5.73,6.47,6.97,7.75)条件下蟾酥提取液放置0,5,10 d后华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、总蟾毒色胺的含量变化。结果:60℃条件下放置10 d后3种指标成分降解率均5%;40℃及(4 500±500)Lx条件下华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的降解率均5%;总蟾毒色胺在上述条件下的降解率均5%。华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、总蟾毒色胺分别在pH 5.73,6.47,6.47时降解最慢。结论:蟾酥提取液中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基受高温及强光照射的影响较小,总蟾毒色胺受高温及强光照射的影响较大;pH是影响蟾酥提取液中3种指标成分稳定性的主要因素,不同pH条件对3种指标成分的稳定性有不同程度的影响。     

响应面法优化干蟾皮的提取工艺

目的:优选干蟾皮的提取工艺条件。方法:采用回流提取法提取干蟾皮,以华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量为考察指标,运用响应面法的设计,考察乙醇浓度、液料比、提取时间对提取工艺的影响。结果:优化的提取工艺条件为乙醇浓度为88.64%,液料比为12∶1,提取时间为1.49 h,在该优化条件下,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的总量为2.24 mg。结论:该优化工艺简便、预测性良好,可以为干蟾皮的开发提供参考。     

干蟾皮中蟾毒内酯类成分的提取工艺研究

目的 探讨干蟾皮中蟾毒内酯类成分的最佳提取工艺.方法 通过正交试验法考察乙醇体积分数、乙醇用量、提取时间、提取次数对干蟾皮中蟾毒内酯类成分提取效果的影响,并以酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的总量-总毒基量为考察指标,采用超高效高压液相色谱-紫外检测器检测.结果 最佳提取工艺为以10倍量80%乙醇提取2次,每次2 h.结论 所优选出的提取工艺方法可行、稳定、合理.     

高效液相色谱法测定蟾酥中有效成分的含量

目的:建立HPLC法测定蟾酥药材中有效成分的含量。方法:选用0.5%磷酸二氢钾溶液乙腈(50:50)(磷酸调节pH为3.25±0.02)为流动相测定蟾酥药材中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。结果:测定组分具有良好的线性关系和分离度,华蟾酥毒基的平均回收率为100.35%,RSD=1.86%,脂蟾毒配基的平均回收率为100.38%,RSD=2.09%。结论:本方法简便、快速、准确,具有实用性     

HPLC测定心可宁胶囊中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

目的:建立心可宁胶囊(蟾酥等)中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法。方法:采用HPLC法进行含量测定。色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,流动相:甲醇-水(50∶40),流速:0.8 mL/m in,检测波长:296 nm;柱温:室温。结果:线性范围:华蟾酥毒基3.5μg~0.28μg,脂蟾毒配基3.75μg~0.30μg。平均回收率:华蟾酥毒基为99.86%,RSD为1.8%(n=5),脂蟾毒配基为99.84%,RSD为1.2%(n=5)。结论:该方法简便、灵敏、准确、专属强,能够控制产品质量。     

产地对蟾酥药材质量的影响

目的: 建立蟾酥药材质量分析方法,并分析产地对其有效成分的影响。 方法: 以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为对照,采用薄层色谱法和高效液相色谱法进行分析和含量测定。 结果: 不同产地蟾酥药材所含成分类型基本相似,但在成分含量上存在明显的差异,以脂蟾毒配基含量变化最为明显,其中产地山东的蟾酥的华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量基本最高;成分差异在薄层色谱图谱中主要表现在斑点2(脂蟾毒配基)、斑点3(华蟾酥毒基)、斑点4、斑点6和斑点9上,在高效液相图谱中表现在3,4,6,7,8,9,14,15号峰上,且还可以看出7,8号峰的含量与14号(华蟾酥毒基)、15号(脂蟾毒配基)峰含量可能存在相关性。 结论: 不同产地蟾酥药材存在明显质量差异;本文方法稳定可行,重现性和专属性好,可用于蟾酥鉴别及质量分析。     

炮制对蟾酥药材中蟾毒内酯的影响

目的:探讨炮制对蟾酥药材中蟾毒内酯类成分的影响。方法:分别采用分光光度法、薄层扫描法对蟾酥原药材与蟾酥酒制品和滑石粉制品中的蟾毒内酯类成分及脂蟾毒配基进行了测定。结果:不同制品中的蟾毒内酯成分含量无明显变化,蟾酥酒制品和滑石粉制品中的蟾毒内酯类成分的含量分别下降16.4%和32.6%,脂蟾毒配基含量分别下降14.4%和46.0%。结论:炮制可使蟾酥药材中蟾毒内酯类成分含量降低,有可能导致疗效降低。     

HPLC法测定蟾酥中4种蟾毒内酯

目的建立同时测定蟾酥药材中蟾蜍他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的方法。方法 10批蟾酥药材采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱;乙腈-0.04%三氟乙酸为流动相梯度洗脱;体积流量为1.0 mL/min;柱温为35℃;检测波长为296 nm。结果蟾蜍他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基分别在0.05～2.61μg(R2=1),0.10～4.96μg(R2=1),0.10～5.03μg(R2=1),0.10～5.18μg(R2=1)范围内线性关系良好;平均加样回收率分别为97.62%,97.34%,97.23%,97.34%,RSD值均<2.0%。结论此方法简便、准确。10批不同来源的蟾酥样品测定结果表明,药材中蟾蜍他灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基含有量相对稳定,脂蟾毒配基含有量则波动较大。     

国产蟾酥药材质量综合评价研究

 目的 综合考察国产蟾酥药材质量。方法 用HPLC测定14批蟾酥药材中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵等7种指标成分含量,并考察样品中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵等7种指标成分TLC鉴别和水分、总灰分、酸不溶灰分、醇浸出物等药材常规理化实验项目。结果 各样品中均可检测出7种指标成分的色谱峰,蟾酥药材指标成分含量和常规理化实验项目测定结果表明,不同产地蟾酥药材间品质差异较大。结论 本实验为蟾酥药材综合质量评价体系的建立提供理论和实验依据。     

基于特征图谱和一测多评法的蟾酥药材质量控制研究

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanostictus耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物。目前商品蟾酥质量问题突出,混伪、掺假现象普遍存在。亟需构建科学完善的质量控制方法,以提升蟾酥药材、饮片及其中成药制剂的质量控制水平,保障临床用药安全有效。该研究采用高效液相色谱法建立蟾酥药材的特征图谱,采用一测多评法(QAMS)测定5种主要蟾毒配基的含量。通过不同批次市售蟾酥样品的分析,建立了以五羟色胺、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为特征峰的对照特征图谱;建立了以华蟾酥毒基为内参物,同步测定蟾酥药材中5种蟾毒配基含量的一测多评法,并对相对校正因子(RCF)的耐用性和系统适用性进行了系统研究。华蟾酥毒基对日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基的RCF分别为1.05,0.895,1.09,0.913。建立的特征图谱和QAMS法,可以有效控制蟾酥药材的质量,为2020年版《中国药典》蟾酥药材质量标准的完善与提高提供参考。     

蟾皮药材质量标准研究

目的:对中药材蟾皮的水分、总灰分、酸不溶性灰分及有效成分等物质质量进行研究,建立蟾皮药材的质量标准。方法:按《中国药典》(2010年版)一部附录lX H中的烘干法测定水分、附录IX K灰分测定法测定灰分;采用薄层色谱法对蟾皮中华蟾酥毒基、脂蟾毒配基进行定性鉴别;用高效液相色谱法对其有效成分进行含量测定。结果:蟾皮的水分含量平均为10.99%,总灰分含量平均为13.21%,酸不溶性灰分含量平均为4.58%。华蟾酥毒基和脂蟾毒配基分别在2.77～177.50μg.mL-1,1.68～107.50μg.mL-1范围内呈良好线性关系。结论:本研究为蟾皮药材标准的制订提供了参考。     

蟾蜍类药材质量研究

目的:研究不同产地、不同生长年限的蟾蜍类药材质量均一性。方法:用高效液相色谱法测定12份蟾蜍类药材样品中蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基,4种指标成分含量。结果:各样品中均可检测出4种指标成分,不同产地蟾酥、干蟾、蟾衣药材间品质差异较大;干蟾样品中4种指标成分含量,小的干蟾个体明显高于大的干蟾个体样品;蟾衣样品中,脂蟾毒配基含量:蟾衣(大)蟾衣(小),蟾毒灵含量:蟾衣(小)蟾衣(大)。结论:本实验为合理开发、应用蟾蜍类药材资源提供理论和实验依据。     

蟾酥不同干燥方法比较研究

目的:研究不同干燥方法对蟾酥药材质量的影响。方法:以水分含量和三种蟾毒配基类成分脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵的含量为指标,检测室内避光阴干、室内晾晒、室外晒干、45℃烘干、80℃烘干五种不同干燥方法对蟾酥质量的影响。结果:室内阴干、室内晾晒、室外晒干5 d后,水分达到《中国药典》要求,45℃烘干、80℃烘干干燥的样品分别于48 h、12 h达到要求;不同干燥方法的蟾酥中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基总量都大于6.0%,且室内阴干室内晾晒阳光晾晒恒温45℃恒温80℃。结论:综合考虑蟾毒配基类成分含量、成本及操作难易度等因素,蟾酥的干燥宜采用室内避光阴干的方法。     

蟾酥的化学成分

目的:研究蟾酥的化学成分,为蟾酥的资源综合利用提供依据。方法:使用正向硅胶,二醇基硅胶,RP-18及LH-20羟丙基葡聚糖凝胶等材料从蟾酥的石油醚、乙酸乙酯、丙酮和甲醇提取部位进行分离纯化,通过理化性质及1D(1H,13C)和2D-NMR(COSY,NOESY,HSQC,HMBC)波谱分析鉴定其化合物的结构。结果:分离纯化得到12个化合物,分别鉴定为isobufalin methyl ester(1),华蟾毒它灵(2),蟾毒灵(3),远华蟾毒精(4),蟾毒它灵(5);蟾毒色胺类为5-hydroxy-Nacetyltryptamine(6),hippophamide(7),其他类为正十五烷酸(8),4,4'-二苯甲烷二氨基甲酸甲酯(9),obtucarbamate A(10),邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(11),邻苯二甲酸二异辛酯(12)。结论:化合物1为新的天然产物,化合物6~8,10,12为首次从蟾酥中分离得到。     

高效液相色谱法测定救心软胶囊中蟾酥的含量

目的建立救心软胶囊中蟾酥的主要成分华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量测定方法。方法采用反相高效液相色谱(RP-HPLC),以C18为固定相,流动相为乙腈-0.5%磷酸二氢钾(用磷酸调节pH值为3.0)(45∶55),检测波长296nm。结果华蟾酥毒基和脂蟾毒配基与其他成分分离良好。华蟾酥毒基在进样量0~5.86μg(r=0.999 8),脂蟾毒配基在进样量0~5.88μg(r=0.999 97)线性关系良好,华蟾酥毒基和脂蟾毒配基加样回收率为99.81%,RSD为2.25。结论该法操作简便、准确、重现性好,可用于救心软胶囊中蟾酥的质量控制。