鲍曼不动杆菌外膜蛋白A1S_1969的克隆表达及免疫保护机制初步研究

目的制备鲍曼不动杆菌(Ab)A1S_1969重组蛋白,利用小鼠全身脓毒血症感染致死模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,探讨可能的免疫保护机制,为筛选Ab疫苗有效的保护性抗原奠定基础。方法基于反向疫苗学技术筛选出Ab外膜蛋白A1S_1969,利用p GEX-6P-2质粒构建GST融合表达载体,重组表达的A1S_1969蛋白经亲和层析高效纯化后与铝佐剂吸附制备而成重组A1S_1969免疫原;采用Balb/c小鼠全身感染模型评价A1S_1969重组蛋白的免疫保护效果,通过ELISA检测免疫小鼠Ig G抗体滴度和Ig G抗体亚型。制备A1S_1969重组蛋白抗血清进行体外调理吞噬杀菌实验。结果成功克隆、表达并纯化A1S_1969重组蛋白,纯度90%。动物免疫保护结果显示A1S_1969重组蛋白组小鼠存活率为55.6%,对照组小鼠存活率为20.0%(P0.05);末次免疫7 d后小鼠体内总Ig G抗体滴度为1∶64 000,以Ig G1亚型为主;体外调理吞噬杀菌实验结果显示A1S_1969特异性血清抗体可以增强中性粒细胞对Ab的杀菌作用,实验组杀菌率可达55%,对照组无杀菌活性。结论 A1S_1969重组蛋白可显著提高全身脓毒血症感染致死模型小鼠的存活率,具有良好的免疫保护效果。     

空肠弯曲菌PEB1 DNA和PEB1蛋白联合免疫小鼠的效果评价

目的初步检测抗空肠弯曲菌感染外膜黏附蛋白(PEB1)核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫诱导小鼠免疫应答水平。方法通过灌胃免疫的方法,将制备的核酸疫苗pcDNA3.1(-)-PEB1及蛋白疫苗PEB1采用核酸初次免疫-蛋白加强免疫及分别单独免疫的方法免疫雌性BALB/c小鼠,以PBS及空质粒pcDNA3.1(-)对照,检测各组小鼠体液免疫应答及细胞免疫应答水平。末次免疫后第28天,对各组小鼠灌胃攻击空肠弯曲菌,评价疫苗保护率。结果免疫后第56天,核酸蛋白联合免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数(SI)为2.625±0.275,脾细胞培养上清中IFN-γ含量为(258.92±13.472)pg/mL。血清IgG抗体滴度为(2.507±0.124)μg/mL,胃和小肠黏膜冲洗液sIgA抗体滴度为(80.351±5.769)ng/mL,脾细胞培养上清中IL-4(377.47±14.560)pg/mL水平均明显高于各对照组(P0.05)。小鼠攻击试验显示:核酸蛋白免疫组的疫苗保护率为91.53%。结论PEB1核酸蛋白联合免疫组诱导的免疫应答水平和疫苗保护率高于单独核酸疫苗免疫组和单独蛋白疫苗免疫组。     

壳聚糖包裹IL-21与PEB1核酸纳米粒子疫苗免疫应答的研究

目的研究壳聚糖包裹PEB1和IL-21核酸纳米粒子疫苗诱导小鼠免疫应答水平。方法复合物凝聚法制备壳聚糖纳米粒子,肌肉注射Balb/c小鼠,检测免疫期和感染期小鼠血清特异性Ig G水平、脾细胞悬液细胞因子水平、脾细胞增殖指数及疫苗保护率。结果扫描电镜观察纳米颗粒平均粒径在(300±23)nm左右,包封率为(91.23±3.24)%;实验组小鼠,特别是IL-21基因佐剂组,在血清特异性Ig G、脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4、脾细胞增殖水平和疫苗的临床保护效应上都显著高于对照组(P0.05);但壳聚糖纳米颗粒组效果不明显(P0.05)。结论 IL-21基因佐剂可以显著提高并维持小鼠稳定持久的免疫应答水平。但壳聚糖对免疫应答仅起到一定的促进作用。本研究的顺利开展,为空肠弯曲菌疫苗的临床应用提供了一定的理论支持。     

登革病毒多价DNA疫苗构建及免疫保护效果验证北大核心CSCD

目的研究登革病毒(dengue virus,DENV)的多价DNA疫苗pVAX1-EDIII在小鼠体内的免疫原性及其保护作用。方法采用真核表达载体p VAX1,设计并构建含4种血清型登革病毒EDIII结构域的DNA疫苗。在第0、14和42天采用电脉冲肌肉导入方式免疫小鼠。末次免疫后1周,ELISA检测针对4种血清型登革病毒的血清特异性IgG抗体水平;ELISpot检测免疫后小鼠脾细胞分泌特异性IL-4、IFN-γ的水平;体内中和实验检测小鼠免疫后血清对感染DENV和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)乳鼠的保护效力。结果与对照组相比,电脉冲肌肉导入DNA疫苗诱导产生较高滴度的IgG抗体与较强的细胞免疫应答。免疫后血清对致死剂量DENV感染的3日龄乳鼠有完全保护作用,对ZIKV感染C57BL/c 1日龄乳鼠有部分保护作用。结论电脉冲肌肉导入登革DNA多价疫苗免疫可诱导针对4种血清型登革病毒的特异性体液免疫以及细胞免疫应答并能有效抵抗DENV的致死剂量攻毒,对ZIKV也能产生一定的保护效应,具有广谱抗黄病毒感染的潜力。     

恶性疟疾疫苗M.RCAg-1与候选佐剂纳米乳配伍的免疫原性研究

为了评价纳米乳作为佐剂对恶性疟疾人工重组蛋白疫苗M.RCAg-1免疫原性的影响,将纳米乳佐剂与M.RCAg-1相配伍,于第0、14、28 d肌肉注射免疫小鼠,抗原量为20μg/只。第3次免疫后10 d,眼球取血并取脾细胞。采用ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体水平、抗体亚类及其对抗原单表位的识别,用间接免疫荧光反应(IFA)检测抗体对恶性疟原虫天然蛋白的识别,用ELISPOT法检测小鼠脾淋巴细胞免疫应答水平。结果显示疫苗佐剂组小鼠血清中抗M.RCAg-1的抗体水平可达1∶108;疫苗佐剂组产生的特异性Ig G抗体以Ig G1为主;疫苗佐剂组抗体对抗原单表位和天然虫体的识别效果显著。各表位和蛋白诱发免疫小鼠分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数高于分泌IL-4的特异性淋巴细胞克隆数。结果提示纳米乳作为恶性疟疾疫苗M.RCAg-1的佐剂,能够显著提高机体的体液免疫和细胞免疫应答水平。     

B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究

目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据。方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。构建成功的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达。大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果:构建的核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。在疫苗免疫后的2、4、6周,pc DNA3.1(+)/NMB0315组和pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G组血清总Ig G及Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P0.001);小鼠血清Ig G2a/Ig G1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P0.01)。免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P0.01,P0.01,P0.05)。pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G、pc DNA3.1(+)/NMB0315疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1∶128和1∶64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pc DNA3.1(+),Cp G]72 h存活率为0。结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用。     

TAT-Ag85B蛋白疫苗的制备和抗结核分枝杆菌效果评价

目的探讨利用HIV反向转导结构域(TAT-PTD)系统表达的转导性Ag85B蛋白疫苗的抗结核分枝杆菌效应。方法构建p ET28a-Ag85B、p ET28a-TAT-Ag85B质粒,原核表达纯化和鉴定后获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;将BALB/c小鼠随机分为3组:Ag85B组,TAT-Ag85B组,PBS组。重组蛋白经皮下免疫小鼠3次,末次免疫后1周处死部分小鼠,ELISA检测小鼠血清中Ag85B抗体滴度,以及脾细胞分泌的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)的水平;用流式细胞术检测巨噬细胞经Ag85B、TAT-Ag85B蛋白刺激后表面分子CD80、CD86变化情况;剩余小鼠经尾静脉感染H37Rv结核分枝杆菌,感染后第1、2、4、8周动态监测小鼠肺和脾内结核分枝杆菌载量,并在感染后8周取肺脏进行HE染色,观察肺组织病变情况。结果成功获得Ag85B、TAT-Ag85B蛋白;与Ag85B相比,TAT-Ag85B诱导小鼠表达高水平的Ig G和IFN-γ、IL-2,感染小鼠的脾、肺结核分枝杆菌载量明显减少,肺组织病变范围小、结核分枝杆菌数量少。另外,TAT-Ag85B增强巨噬细胞表面分子CD80/CD86的表达。结论 TAT-Ag85B蛋白疫苗增强巨噬细胞的抗原提呈能力,诱导小鼠产生强烈的Th1免疫应答,有一定的抗结核分枝杆菌保护作用。     

表达呼吸道合胞病毒G蛋白胞外区的重组H1N1流感病毒单剂滴鼻免疫可在小鼠诱导强免疫应答与保护

目的基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒, 将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后, 单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠, 并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后, 分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒, 通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较, 免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。     

不可分型流感嗜血杆菌P6 DNA疫苗与蛋白疫苗序贯免疫效应研究

观察不可分型流感嗜血杆菌P6DNA疫苗初免蛋白疫苗加强免疫方式的免疫效果。大量扩增pcDNA3-P6。将65只BALB/c小鼠随机分PBS对照组、pcDNA3.1对照组、pcDNA3.1-P6组、P6蛋白组、pcDNA3.1-P6/P6蛋白组,分别于0、14、28d免疫。质粒每次每只接种100μg,蛋白每次每只接种10μg。末次免疫后14d,每组取10只小鼠取血,ELISA检测血清中特异性IgG抗体滴度。每组取3只小鼠处死,制备脾淋巴细胞,ELISA检测IL-4和IFN-γ水平,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖指数。用15LD50NTHi攻击每组剩余10只小鼠,观察免疫保护作用。结果:pcDNA3.1-P6/P6蛋白组小鼠的脾淋巴增殖指数和IFN-γ水平明显高于质粒组和蛋白组(P0.05)。pcDNA3.1-P6/P6蛋白组小鼠IgG抗体滴度、IL-4水平和动物生存率明显高于质粒组(P0.05)但和蛋白组相比无明显差异(P0.05)。因此pcDNA3.1-P6初免P6蛋白加强免疫的方式可以提高疫苗的免疫效果。     

抗旋毛虫病Ts87 DNA疫苗滴鼻初免—蛋白疫苗加强免疫策略增强免疫保护应答

为优化抗旋毛虫病核酸疫苗免疫策略,本文探讨了Ts87 DNA疫苗滴鼻初免与蛋白疫苗皮下注射加强免疫诱导产生的保护效果及免疫应答特征.分别在第0d以旋毛虫Ts87 DNA疫苗SL7207/pVAX1-Ts87滴鼻初免,第14/28 d以蛋白疫苗rTs87皮下注射加强免疫小鼠,在第35 d攻击感染旋毛虫肌幼虫,第84 d剖杀小鼠,计算减虫率观察免疫保护效果;进行小鼠血清中特异性IgG抗体效价、抗体亚型分析及肠道盥洗液sIgA水平分析,检测脾淋巴细胞增殖反应、脾及颈部淋巴结细胞分泌细胞因子水平.结果显示,DNA疫苗滴鼻初免—重组蛋白加强的联合免疫组的保护作用优于单独DNA疫苗滴鼻及单独重组蛋白免疫组,显著提高了减虫率(46.1％);DNA疫苗滴鼻初免和蛋白疫苗加强免疫方式不仅诱导小鼠产生了粘膜免疫应答,同时也诱导了有效的细胞和体液免疫应答,其免疫应答类型是以Th2型为主的混合型Th1/Th2免疫反应.该研究为新型抗旋毛虫病疫苗接种策略的优化提供了实验依据.     

乙型肝炎疫苗联合B7-H1蛋白疫苗对HBV转基因小鼠抗HBsAg免疫应答的影响

目的:研究B7-H1蛋白疫苗对HBV转基因小鼠免疫应答的影响,探索治疗慢性乙型肝炎的新方法。方法:用不同剂量的乙型肝炎疫苗和B7-H1蛋白疫苗联合免疫HBV转基因小鼠,应用ELISA法检测转基因小鼠在不同时间点血清抗B7-H1抗体滴度,同时在免疫后第14周末处死小鼠取脾细胞,检测不同的免疫方法对小鼠脾细胞产生HBsAg特异性Th1类细胞因子(IFN-γ及IL-2)、对HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量及对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果:成功完成小鼠的免疫计划,5周起血清中即能测到B7-H1抗体,同一时间点各组之间的抗体滴度值并无明显差异。加B7-H1蛋白免疫各组与相同剂量单用HBsAg蛋白免疫各组相比:IL-2均明显减低(P<0.05),分泌IFN-γT的T细胞数量下降,但脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平各组间无明显差异;MTT法测定的淋巴细胞增殖能力各组间也无明显变化。结论:B7-H1蛋白疫苗可诱导HBV转基因小鼠产生明显的抗B7-H1抗体应答,但不能增强抗HBsAg的免疫应答。较小剂量的HBsAg即可引起HBV转基因小鼠Th1类细胞因子(IFN-γ及IL-2)的分泌以及淋巴细胞增殖。     

抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答

目的 评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法 分别用AE、 AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、 IL-2、 IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果 AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-...     

结核分枝杆菌Rv2450蛋白诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的:以原核表达的结核分枝杆菌Rv2450蛋白在小鼠体内诱导体液和细胞免疫应答。方法:采用皮下包埋的方法,以预先转移到硝酸纤维素膜上的原核表达的Rv2450蛋白免疫小鼠(10只)3次,每次间隔2周。用间接ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。末次免疫完成后4周,处死3只免疫小鼠并分离脾淋巴细胞,体外经PPD(2μg/孔)刺激后,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖指数。用ELISA法检测脾淋巴细胞悬液中IFN-γ、IL-10及IL-12的水平。结果:Rv2450蛋白免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶3200,淋巴细胞增殖指数为3.76±0.19。免疫小鼠脾淋巴细胞培养液中IFN-γ、IL-10及IL-12的含量,分别为(1740±19)ng/L、(678±15)ng/L、(469±13)ng/L,均高于各组的生理盐水对照组(P<0.05)。结论:Rv2450有可能作为新型结核疫苗的候选组分。     

结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

目的:研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性.方法:用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类.分离免疫小鼠脾淋巴细胞,检测淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应.毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数.结果:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答,免疫小鼠脾淋巴增殖明显,IFN-γ和IL-12含量增加,CD4+和CD8+细胞百分比明显增加,CTL杀伤效应明显,对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用.结论:MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答,有可能作为新型TB疫苗候选.     

IL-12、IL-18基因对HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导的免疫应答的影响

目的 研究IL-12、IL-18基因对HIV-1外膜蛋白基因疫苗诱导免疫应答的影响，以探求HIV-1核酸疫苗的新策略。方法 pVAX1GP120联合IL-12、IL-18基因或者pVAX1GP120单独免疫BALB／c小鼠，采用ELISA检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ水平，以NIT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细脯增殖，用乳酸脱氢酶（LDH）试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞（CIL）的应答。结果 与pVAX1GP120免疫组比较，pVAX1GP120联合IL-12、IL-18基因免疫组小鼠血清的抗HIV-1 gp120抗体滴度升高，IFN-γ升高，小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数（SI）以及特异性CTL活性均高，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 IL-12、IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠，有可能增强特异性TH1细胞和CTL反应，IL-12、IL-18基因对体液免疫可能有抑制作用。因此，IL-12、IL-18基因对于治疗性HIV-1核酸疫苗可能是具有较好应用前景的免疫佐剂。     

含信号肽Mtb8.4基因疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用

目的研究含信号肽MTB8.4基因疫苗的免疫原性及对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用。方法雌性C57BL/6N小鼠32只,随机分为4组,即含信号肽的MTB8.4(MS)基因疫苗组、BCG组、pcDNA3.1 组和PBS组。ELISA检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行CTL杀伤检测。用结核杆菌H37Rv强毒株静脉攻击小鼠,计数肺和脾组织中的结核杆菌菌落数,观察小鼠部分肺和脾组织的病变程度;Z-N染色查结核杆菌,观察该疫苗对小鼠结核杆菌感染的免疫保护作用。结果MS基因疫苗能够诱导较强的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,细胞因子IFN-γ和IL-2分泌增加,IL-4分泌减少,特异性CTL活性增加;免疫组小鼠肺和脾组织中的结核杆菌菌落数较空载体组显著减少,组织病变明显减轻。结论结核病MS基因疫苗能诱导较强的Th1型细胞免疫应答,对小鼠结核杆菌感染有一定的免疫保护作用,但尚需进一步提高。     

pBudCE4.1/PPE68DNA疫苗诱导Balb/c小鼠产生Th1免疫应答

目的构建结核分枝杆菌PPE68 DNA疫苗,并探讨其在小鼠体内诱导的Th1免疫应答。方法将结核分枝杆菌PPE68基因和复制子OriM基因亚克隆入真核表达质粒pBudCE4.1中构建穿梭质粒,并用其免疫Balb/c小鼠,于第3次免疫后2周处死小鼠,分别检测免疫小鼠血清IgG2a水平、IFN-γ和IL-12水平;特异性蛋白刺激后淋巴细胞增殖状态;小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果 PPE68 DNA疫苗免疫小鼠后血清中的IgG2a水平、IFN-γ和IL-12均有意义的提高,脾淋巴细胞增殖显著。脾肺未见明显病理改变。结论 PPE68DNA疫苗可有效诱导小鼠Th1免疫应答,为进一步研究其抗MTB的免疫保护作用奠定了基础。     

暴露N端对趋化因子LTN黏膜佐剂作用的影响

我们前期构建了编码CVB3结构蛋白VP1的真核表达质粒(pVP1),通过滴鼻免疫诱导了一定水平的细胞和体液免疫应答。为了进一步增强其免疫效果,我们在该黏膜疫苗中引入新型黏膜佐剂LTN,发现当两种质粒共免疫时可显著增强pVP1诱导的CVB3特异性血清IgG和黏膜IgA水平,促进脾脏及黏膜局部IFN-γ+T细胞产生,显著减轻CVB3感染小鼠心肌病理损伤。随后我们对该疫苗体系进行了优化,使用双顺反子形式将编码VP1和LTN的基因构建在同一质粒上,通过滴鼻免疫小鼠后同样获得了免疫增强作用;当尝试将LTN N端融合至VP1蛋白,以该融合质粒pVP1-LTN滴鼻免疫小鼠后发现其增强免疫应答的能力显著下降;为排除融合蛋白空间构象改变及空间位阻对LTN佐剂功能的影响,我们在蛋白连接处引入柔性接头肽段(G4S)3,构建了融合质粒pVP1-IRES-LTN,发现该疫苗增强全身及黏膜局部特异性抗体细胞免疫应答的能力也非常有限,与pVP1-LTN相比并无明显差异,因此不能有效清除心肌病毒和减轻心肌损伤,提示融合蛋白的空间位阻或构像改变并非是影响LTN佐剂效应的关键因素,而暴露的LTN N端对其增强全身及黏膜局部免疫应答强度、提高心肌炎的免疫保护作用十分关键。     

Prion疾病疫苗研究策略

朊病毒病是一类侵袭人类及多种动物中枢神经系统的致死性退行性脑病,目前缺乏有效的预防和治疗方法.朊病毒病的重组蛋白亚单位疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗、病毒样颗粒疫苗、树突状细胞疫苗、黏膜免疫疫苗等已取得一定进展,但现有的免疫策略仅能部分克服免疫耐受,诱导较低或中等滴度的抗体,对PrPSc感染动物模型只能提供部分保护,Prion疫苗研究任重而道远.     

细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的:探讨细粒棘球绦虫(Eg)转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗诱导BALB/c小鼠产生的免疫应答及其对Eg原头节攻击感染的保护性作用。方法:热絮凝法提取转基因苜蓿的叶蛋白,再用无菌双蒸水将叶蛋白提取液的浓度配制成20g/L。分别用100μL灌胃和10μL滴鼻免疫小鼠,每3d免疫1次,连续免疫2个月。同时设转空质粒(pBI121)苜蓿叶蛋白及正常苜蓿叶蛋白对照组。末次免疫后8周,用Eg原头节腹腔注射进行攻击感染(50个Eg原头节/每鼠),感染后24周剖杀小鼠,分离并称重细粒棘球蚴组织,计算囊重减少率;采眼球血,常规ELISA检测血清中IgG及其亚类和IgE水平;取脾,分离脾细胞,流式细胞术(FCM)检测脾CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比;脾细胞体外经脾细胞悬液或加入Eg粗抗原(EgAg)、伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激培养后,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测免疫小鼠脾T淋巴细胞增殖情况,AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)双染色法检测脾细胞的凋亡发生率,常规ELISA法检测脾细胞培养上清液中IL-12、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平。结果:与正常蛋白对照组相比,疫苗口服接种组小鼠检获包囊质量明显降低,囊重减少率为64.1%,脾细胞凋亡发生率明显降低,脾T细胞增殖水平、CD4+T细胞亚群的百分比和CD4+/CD8+比值显著升高,血清中IgG、IgG2b和IgE水平显著升高,脾细胞培养上清液中IFN-γ、1L-12和TNF-α水平显著增高,IL-10水平明显降低。结论:细粒棘球绦虫转Eg95-EgA31融合基因苜蓿疫苗口服接种可抑制免疫鼠脾细胞发生凋亡,诱导免疫鼠脾T细胞增殖,产生Th1型细胞免疫应答以对抗Eg原头节的攻击感染,CD4+ T细胞亚群、IgG、IgG2b和IgE在疫苗诱导的保护力中起重要作用。