TLR7激动剂替代IFN-γ诱导CIK细胞杀伤肿瘤的研究

目的:探讨TLR7激动剂(Toll like receptor 7 agonist,Tlr7a)替代IFN-γ体外培养细胞因子诱导杀伤性细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)抗肿瘤的免疫效应。方法:分离健康人外周血单个核细胞,在体外诱导CIK。分两组:CIK组和Tlr7a-CIK组。对各组分别进行免疫杀伤性研究,检测细胞免疫表型并分析对K562肿瘤细胞的杀伤活性。结果:CD56+细胞在Tlr7a-CIK组显著增加(P0.05),Tlr7a-CIK组杀伤活性较CIK组显著增强(P0.05)。结论:Tlr7a可以替代IFN-γ促进CIK细胞杀伤肿瘤。     

TLR7 激动剂替代IFN鄄酌诱导CIK 细胞杀伤肿瘤的研究

目的:探讨TLR7 激动剂(Toll like receptor 7 agonist,Tlr7a)替代IFN体外培养细胞因子诱导杀伤性细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK)抗肿瘤的免疫效应。方法:分离健康人外周血单个核细胞,在体外诱导CIK。分两组:CIK 组和Tlr7a-CIK 组。对各组分别进行免疫杀伤性研究,检测细胞免疫表型并分析对K562 肿瘤细胞的杀伤活性。结果:CD56+ 细胞在Tlr7a-CIK 组显著增加(P<0.05),Tlr7a-CIK 组杀伤活性较CIK 组显著增强(P<0.05)。结论:Tlr7a 可以替代IFN促进CIK 细胞杀伤肿瘤。     

树突状细胞对脐血来源细胞因子诱导杀伤、自然杀伤细胞杀伤活性及CD45RO表达的影响

目的:探索同一来源脐血树突状细胞(DCs)对细胞因子诱导杀伤(CIK)、自然杀伤(NK)细胞杀伤活性和CIK细胞上CD45RO表达的影响。方法:通过细胞因子组合诱导、扩增脐血来源的DCs、CIK和NK细胞,杀伤效应细胞分为两组:A组为接受DCs共孵育6d刺激的CIK、NK细胞,B组为未接受任何刺激的CIK、NK细胞,了解DCs对相应效靶比下CIK、NK细胞杀伤K562、HL-60细胞株细胞毒活性的影响;通过流式细胞术检测两组CIK细胞上CD45RO、CD45RA的表达率。结果:随着效靶比的升高,脐血CIK、NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤力增加。在20∶1、10∶1效靶比下,A组CIK、NK细胞对HL-60的杀伤率分别为76.77％±5.76％、55.87％±2.09％,B组为61.14％±3.72％、49.96％±1.51％,A组对HL-60的杀伤明显高于B组;在20∶1效靶比下,A组对K562的杀伤明显高于B组;而在10∶1效靶比下两组之间的杀伤活性未见显著差异;A组CIK细胞上CD45RO表达率显著高于B组。结论:DCs与CIK、NK细胞共孵育可提高CIK、NK细胞的细胞毒活性及增加CIK细胞上CD45RO的表达。     

K652重组表达IL-6基因对NK细胞表型和功能的影响

目的:为了研究表达IL-6的重组K562细胞对自然杀伤细胞(NK)细胞的扩增数量、表型和功能的影响。方法:根据人类IL-6 c DNA的5'端序列,设计PCR引物以K562细胞c DNA文库的DNA为模板进行扩增,表达,转染,在K562细胞上表达IL-6基因,构建重组的K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。流式细胞仪分析NK细胞表型。将NK细胞作用到K562细胞,对其杀伤性进行功能分析,51Cr释放实验检测NK细胞对K562细胞杀伤水平的影响。结果:成功构建了表达IL-6的重组K562细胞,和PBMC共同孵育后,培养体系经过21 d的刺激后,IL-6重组K562细胞诱导PBMC扩增,CD56+CD16+CD3-细胞数量比诱导前扩增了(760±18)倍,CD56+CD16+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的6%±0.4%,扩增后第3组结果比未扩增的多了91%±2%。细胞毒实验表明,在NK效应细胞∶K562靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了92%±2%。结论:本方法以重组K562为刺激细胞,能够实现NK细胞体外的大规模制备,建立了优化的NK细胞体外扩增方法,且扩增的细胞杀伤K562细胞的活性较好。对于NK的大量扩增和应用于临床具有重要的指导意义。     

CD19-CAR-T和CD19-CAR-CIK细胞对表达CD19+K562细胞株杀伤作用的比较

目的 CAR-CD19-CIK和CAR-CD19-T效应细胞在体外对表达CD19的K562稳定细胞株杀伤能力和杀伤特异性的比较。方法效应细胞的构建是以通过基因合成和分子克隆手段构建CAR-CD19片段,以酶切的方法将CAR-CD19片段插入到慢病毒载体上;分离获得同一个健康志愿者外周血单核细胞,一部分加IFN-γ、重组人IL-1α、CD3单克隆抗体、重组人IL-2等细胞因子诱导CIK细胞产生;另一部分体外分选CD3阳性T细胞,CAR-19慢病毒同时感染CIK细胞和T细胞,采用流式细胞术检测转导效率和细胞分型;CD19+的靶细胞是由装载CD19基因表达的慢病毒载体转导K562细胞系,通过抗菌素的压力选择而构建;乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测CAR-CIK细胞和CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率,炎性因子检测(CBA)法检测由CAR-CIK细胞和CAR-T细胞的细胞因子的分泌水平。结果同一CD19-CAR慢病毒载体在相同转导条件下,对原代CIK细胞的转导效率是60.5%,对原代T细胞的转导效率是36.2%;当效靶比5:1、10:1和20:1在这三种比例时,CAR-19-CIK细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为14.65%、33.08%和42.5%,对K562细胞的杀伤效率分别为8.3%、10.1%和24.9%;而CAR-19-T细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为17.22%、26.52%和32.49%,对k562细胞的杀伤效率分别为0.1%、3.6%和10.3%。结论 CAR-19-CIK细胞的杀伤作用明显强于CIK细胞;CAR-19-T细胞杀伤特异性比CAR-19-CIK细胞强。本研究对CAR-T和CAR-CIK免疫细胞治疗血液肿瘤的新策略和新临床方案设计提供了有意义的实验数据。     

不同细胞因子诱导脐血来源的CIK、NK细胞对K562细胞杀伤活性的研究

目的：了解不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性的差异性。方法：通过SCF、FLT3L、IL-2、IL-7及IL-15等细胞因子的不同组合扩增的脐血CIK、NK细胞，分为3组，A组（SCF＋IL-2＋IL-7＋IL-15）、B组（SCF＋FLT3L＋IL-2＋IL-7＋IL-15）和C组（IL-2＋IL-7＋IL-15，对照组）；通过MTT法检测各组CIK、NK细胞在不同效靶比下对K562的杀伤率，计算各组的总杀伤单位。结果：经过21天培养A组体系中CIK＋NK细胞的比例平均超过60％，B组CIK＋NK细胞的比例平均超过70％，而C组约为50％；各组扩增的CB-CIK／NK细胞同组间在效靶比20：1时对K562的杀伤率均显著高于10：1（P〈0．01）。在不同效靶比下A组CIK／NK细胞对K562的杀伤率显著高于B和C组（P〈0．01）；C组CIK／NK细胞对K562的杀伤率稍高于B组，但两组间对K562的杀伤率无显著性差异。A组总杀伤单位显著高于C组，与B组无显著差异。结论：不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性有差异，考虑到对效应细胞的扩增效果，B组为具有最佳杀伤活性的脐血CIK、NK细胞培养体系，其中的SCF、FLT3L对CIK／NK细胞诱导有协同效果。     

CpG-ODN活化人NK细胞的初步研究

目的：研究D型CpG-ODN对人免疫细胞的活化效应。方法：CpG-ODN体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC)，ELBA检测培养液IFN-α及IFN-γ的含量；RT-PCR检测PBMC中TLR9的表达水平；MTF法观察活化的NK对K562的杀伤作用。结果：CpG-ODN有效诱导PBMC分泌IFN-α和IFN-γ，增强活化的NK细胞对K562细胞的杀伤作用，且能显著上调TLR9 mRNA的表达。结论：在TLR9的介导下，CpG-ODN能有效激活NK细胞，参与机体免疫调节。     

DC-CIK细胞体外抗淋巴瘤细胞的免疫效应研究

目的:探讨共培养树突状细胞(Dendritic cell,DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cell,CIK),即产生的DC-CIK细胞抗淋巴瘤免疫效应的机制。方法:分离健康人外周血单个核细胞,分别于体外诱导DC和CIK,然后共培养成DC-CIK细胞。分四组:DC组、DC-T组、CIK组和DC-CIK组。对各组分别进行免疫机制研究:测定细胞因子IL-12、IL-17和IFN-γ的分泌量、检测细胞免疫表型和分析对人淋巴瘤细胞株杀伤活性。结果:在DC-CIK组,细胞因子IL-12、IL-17和IFN-γ的分泌量均明显高于其它三组(P0.05);杀伤活性亦较其它组增强(P0.05)。CD8+、CD3+/CD56+细胞在DC-CIK组亦明显增加(P0.05)。结论:DC-CIK细胞抗淋巴瘤免疫效应与分泌大量的细胞因子和产生细胞毒性细胞有关。     

抗原致敏DC与CIK共培养体外抗肾癌效应的研究

目的： 探讨肾癌(RCC)抗原致敏树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养后的DC-CIK细胞对RCC的杀伤活性。 方法： 将健康成人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC经RCC(786-0细胞株)抗原致敏后与同源CIK细胞共培养，实验分3组：RCC抗原致敏DC与CIK共培养组（A组），未致敏DC与CIK共培养组（B组），单纯CIK组（C组）。流式细胞仪检测DC及CIK免疫表型。MTT法检测3组效应细胞对786-0细胞杀伤活性。 结果： 效靶比 20∶1 时，A、B、C组对786-0细胞杀伤活性分别为（70.64±8.26）%、（53.40±7.33）%、（46.64±6.01）%，各组比较差异显著（P<0.05）；以前列腺癌PC3细胞作靶细胞对照，A组对786-0及PC3细胞的杀伤活性有显著差异（P<0.05）。 结论： RCC抗原致敏DC与CIK共培养后的DC-CIK细胞可明显提高CIK细胞对RCC的杀伤特异性和杀伤活性。     

云芝多糖增强人NK细胞杀伤功能的体外研究

目的探讨云芝多糖(PSK)对体外培养的人自然杀伤(NK)细胞杀伤功能的影响。方法采集健康成年人外周血,分离单个核细胞(PBMC),加入含白细胞介素(IL)-2的NK细胞培养液。培养第10天时加入不同质量浓度(100、75、50、25、10、5μg/m L)的PSK诱导NK细胞48 h,收集细胞检测。用CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测诱导前后NK细胞穿孔素、颗粒酶B、CD107a及NKG2D受体表达(PSK诱导为实验组,同时设不加药物及无细胞的空白对照孔为对照组)。通过CCK-8法检测对红白血病细胞株K562细胞的杀伤活性:取质量浓度25μg/m L PSK诱导48 h后NK细胞,调整细胞浓度至1×10~9/L作为效应细胞;调整红白血病肿瘤细胞株K562细胞浓度至5×10~7/L,按效靶比为5∶1、10∶1、20∶1、40∶1、80∶1的比例混合培养于96孔板内,同时设单独效应细胞孔、单独靶细胞孔(实验组)和空白孔(对照组)。结果培养10 d后NK细胞纯度达到78.70%左右。经PSK诱导48 h后,NK细胞的增殖及功能具有一定浓度依赖性,PSK质量浓度在25μg/m L对NK细胞的增殖率(51.62%±3.20%)最为明显(P0.01),之后逐渐下降。在质量浓度0~100μg/m L可以促进NK细胞的生长和增加NK细胞表面穿孔素、颗粒酶B、CD107a和NKG2D受体表达,以及增强对红白血病细胞株K562细胞的杀伤活性;尤其是当PSK质量浓度为25μg/m L时,颗粒酶B、穿孔素、NKG2D和CD107a表达为55.42%±2.34%、70.49%±1.87%、83.45%±1.77%和85.00%±2.02%,显著高于对照组(25.83%±1.31%、40.79%±1.59%、70.66%±2.39%和72.79%±2.31%)(P0.01)。在效靶比80∶1时,实验组杀伤活性为57.63%±3.42%,高于对照组(24.78%±2.47%)(P0.01)。结论 PSK在一定质量浓度下能促进NK细胞的生长,且增强NK细胞的杀伤功能。     

CIK细胞的生物学特性及荷瘤鼠体内分布特点研究

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)在荷瘤鼠体内的分布规律。方法:用MTT比色法测定CIK细胞对Hela-luc细胞的杀伤作用。以人宫颈癌细胞Hela-luc接种BALB/c裸鼠建立动物模型。体外培养CIK细胞后以荧光染料CFSE标记,经不同途径注射入荷瘤鼠体内。用激光共聚焦显微镜和流式细胞技术检测方法分析CIK细胞在各器官的分布情况。结果:CIK细胞在体外培养14～18天时,细胞数量生长达高峰,此时CD3+CD56+T细胞的数量也达最高值。以10∶1、20∶1、40∶1的比例将效、靶细胞作用48小时后,CIK细胞对Hela-luc细胞的杀伤率分别为(24.08±3.18)%、(51.16±2.64)%、(72.14±4.21)%。CIK细胞经腹腔注射,肿瘤组织24小时达到最高(20.56%),瘤旁注射,肿瘤组织3小时达到最高(25.75%)。结论:CIK细胞在体外对宫颈癌Hela-luc细胞有较强的杀伤作用。CIK细胞在体内分布于肺、肝、肿瘤部位,其分布在各脏器中浓度规律与不同的输注途径有一定关系。针对不同解剖部位的肿瘤可以选择不同的CIK细胞输注途径以最大限度地提高疗效。     

肿瘤抗原联合CD40L致敏树突状细胞诱导CTLs杀伤K562细胞的实验研究

目的：以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导为树突状细胞（DCs），负载K562细胞冻融抗原，并联合CD40L诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对K562细胞的杀伤作用。方法:密度梯度离心法、贴壁法分离健康人外周血单核细胞，应用rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α等细胞因子诱导扩增，培养DCs，用K562细胞冻融抗原联合rhsCD40L致敏DCs。实验分4组：K562细胞冻融抗原致敏DCs为实验组A，联合CD40L致敏DCs为实验组B，未致敏DCs为对照组A，单核细胞+异体淋巴细胞组为对照组B，观察CTLs对K562细胞的杀伤效应。结果:培养出具有典型特征的DCs，表达CD40最高达96%、CD86达97%、CD80为77%、CD1a为 69%，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为 20∶1 时，实验组A对K562细胞的杀伤率为71.3%，实验组B为86.9%，对照组A为37.6%，对照组B为21.1%。实验组均显示高水平杀伤率，与对照组比较差异显著（P＜0.05），实验组B加CD40L杀伤率高于实验组A（P＜0.05） 。结论：K562细胞冻融抗原冲击致敏DCs能有效诱导T细胞特异性抗白血病作用，联合CD40L能增强其CTL的杀伤作用。     

人源白细胞介素21对外周血及脐血来源CIK细胞产生和抗肿瘤活性的作用研究

目的：研究新近发现的免疫调节因子——白细胞介素21（IL-21）对外周血及脐血来源的CIK细胞产生及抗肿瘤活性的体外作用。方法：采集分离正常人的外周血及脐血单个核细胞，加用细胞因子诱导培养CIK细胞，在有无人源IL-21（200ng／μl）培养条件下，检测CIK细胞表达及杀伤K562细胞和急性白血病患者肿瘤细胞活性的变化；检测培养上清IFN-γ的浓度及杀伤活性以及RT-PCR法检测培养细胞的IFN-γ RNA表达的不同。结果：在人源IL-21的作用下，培养14天时，①CIK细胞的产生由17．5％升至26．5％（外周血来源）；33．8％升至55．9％（脐血来源）。②CIK细胞对K562细胞的杀伤作用由24．0％升至52．2％（外周血来源）；35．1％升至79．7％（脐血来源）；脐血来源CIK细胞对13例急性白血病患者肿瘤细胞杀伤作用由27．4％升至58．3％。③外周血来源培养上清IFN-γ的浓度上升了近一倍，对K562的杀伤作用增加了近一倍；脐血来源培养上清IFN-γ的浓度上升了三倍多，对K562的杀伤作用增加了近二倍；④外周血和脐血来源培养细胞的IFN-γ RNA表达均明显增高。结论：人源IL-21可增加外周血及脐血来源CIK细胞产生及增强其抗肿瘤活性，通过增加IFN-γ的表达产生为其作用机制之一，提示IL-21在增强肿瘤免疫治疗中具有潜在的临床应用前景。     

不同刺激因子组合诱导NK细胞体外扩增及其功能的研究

目的探讨不同刺激因子组合对人自然杀伤细胞(NK细胞)体外扩增及其功能的影响。方法 VarioMACS分选健康成人外周血单个核细胞(PBMC)中的NK细胞,依据添加刺激因子的不同分为A组(IL-2)、B组(IL-2+IL-15)、C组(IL-2+IL-15+饲养细胞),饲养细胞为30 Gyγ射线照射后的同种异体外周血单个核细胞(allogeneic PB-MNCs,AlloMNCs),未添加任何刺激因子的细胞的作为对照组,在干细胞生长培养基(SCGM)中进行培养扩增14 d,第1天添加PHA及OKT3,第5天离心洗去;台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞术检测分选及扩增前后CD56+CD3-NK细胞纯度;改良的MTT法检测NK细胞对K562、HO8910及PBMC的杀伤活性。结果经VarioMACS免疫磁珠阴性分选后NK细胞纯度由分选前的(9.2±2.9)%提高到(93.5±3.2)%,培养14 d后,除对照组NK细胞纯度降低外,其余组与扩增前无明显差异(P>0.05)。细胞扩增倍数分别为17.2±1.7、51.3±6.6和82.4±9.8倍,均显著高于对照组(5.7±1.2)(P<0.01)。实验组组间比较,C组明显高于A组和B组(P<0.01)。细胞杀伤实验表明,当效靶比为10∶1时,各组的杀伤活性显示为C组>B组>A组>对照组,C组扩增的NK细胞对K562及HO8910的杀伤率可分别达到(70.1±8.9)%和(64.6±6.2)%,显著高于对照组、A组(P<0.01)和B组(P<0.05),对PBMC的杀伤率仅为(4.2±1.2)%。结论经VarioMACS分选获得的NK细胞,在体外使用SCGM培养基培养,添加IL-2、IL-15和照射后AlloMNCs作为刺激因子,可获得高效扩增和有效活化的NK细胞,为NK细胞的肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增高纯度NK细胞的方法。     

抗原负载的DC诱导CIK对MDA-MB-231细胞的杀伤活性研究

探讨乳腺癌相关抗原负载后树突状细胞(DC)联合细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的杀伤效应。采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC),常规法诱导DC、CIK细胞;流式细胞技术分析测定细胞表型;用反复冻融法制备MDA-MB-231细胞的相关抗原,并测定抗原浓度;MTT法分别测定在四个不同效靶比时CIK、DC+CIK和抗原负载的DC+CIK三组效应细胞对MDA-MB-231乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:CIK细胞分别与DC和Ag-DC共培养后,可见CD3+CD56+双阳性表达细胞较培养前显著增加(P<0.05);将负载肿瘤相关抗原的DC与CIK共培养后,杀瘤活性明显提高(P<0.05)。提示,抗原负载的DC与CIK细胞共同孵育培养后,在相同效靶比时,对MDA-MB-231乳腺癌细胞杀伤效应与CIK细胞和DC-CIK两组效应细胞相比有显著提高,表明抗原负载后可提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,为乳腺癌临床生物免疫治疗提供实验室基础。     

3种不同抗凝剂对外周血培养的NK细胞功能影响

目的探讨外周血经3种不同抗凝剂处理后培养的自然杀伤(NK)细胞的增殖率和杀伤功能的影响研究。方法采集10例年龄(35±5)岁健康志愿者15 m L外周血,分别置于含乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2,EDTA组)、细胞保存液(细胞保存液组)和肝素钠(肝素钠组)的抗凝管中。用淋巴细胞分离液收集单个核细胞,在NK细胞培养液中培养单个核细胞12 d,并观察细胞生长情况。在第4、6、8、10、12天时,收集细胞用CCK8法检测NK细胞的增殖情况。在细胞增殖最明显的第12天收集细胞,通过流式细胞仪检测各组NK细胞的颗粒酶、穿孔素和CD107a。台盼蓝染色检测细胞活性。通过CCK8法检测各组对肿瘤细胞株K562杀伤活性。结果通过细胞增殖发现,EDTA组NK细胞增殖不明显,肝素钠组和细胞保存液组增殖明显。第12天时检测发现,肝素钠组增殖倍数为128.15±6.38,细胞保存液组增殖倍数为107.51±5.70;肝素钠组优于细胞保存液组(t=6.20,P=0.00)。肝素钠组NK细胞纯度表达为(84.49±2.35)%,也明显高于细胞保存液组NK细胞表达[(77.63±1.37)%]。经台盼蓝染色检测,肝素钠组和细胞保存液组细胞活性率均为100%。通过流式细胞仪检测发现,肝素钠组NK细胞颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达都明显高于细胞保存液组(t=12.76、17.76、5.67,P=0.00、0.00、0.00)。对肿瘤细胞株K562杀伤结果显示,肝素钠组NK细胞杀伤活性(50.12%±3.42%)明显高于细胞保存液组(41.88%±2.47%)(t=4.78,P=0.001)。结论肝素钠和细胞保存液均可用于NK细胞培养的血液抗凝,但肝素钠组NK细胞的杀伤功能明显优于细胞保存液组。     

模拟微重力影响EPO诱导K562细胞向红系分化的机制研究

目的:航天飞行性贫血现象的机制尚不清楚。本实验利用第4代细胞旋转培养系统(RCCS-4)模拟微重力,研究其对促红细胞生成素(EPO)诱导培养K562细胞向红系分化的影响及其机制。方法:实验分为地面培养组(Control组)、EPO诱导组(EPO组)、模拟微重力组(MG组)和模拟微重力+EPO组(MG+EPO组),利用RCCS-4模拟微重力,分别在地面和模拟微重力环境下,采用EPO诱导培养K562细胞。采用联苯胺染色法观察各组K562细胞向红系分化情况;流式细胞术检测K562细胞CD71抗原表达水平,Western-blotting方法检测K562细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白(AKT)及红系特异核蛋白转录因子-1(GATA-1)表达水平,流式细胞术检测K562细胞凋亡情况。结果:联苯胺染色阳性率比较,MG组和MG+EPO组明显低于EPO组(P<0.01);CD71抗原表达水平为MG+EPO组明显低于EPO组(P<0.01);AKT/GATA-1蛋白表达量MG组低于Control组,MG+EPO组低于EPO组(P<0.01);各组K562细胞凋亡率检测发现MG组和MG+EPO组(70.25±0.17%)较Control组和EPO组明显增加(P<0.01)。结论:模拟微重力可以通过下调红系分化相关蛋白AKT及GATA-1表达和诱导细胞凋亡来抑制EPO诱导K562细胞向红系分化。     

导入NKG5—SV基因增强细胞杀伤活性的研究

目的研究免疫效应蛋白NKG5的拼接异构体基因NKG5-SV导入外周血自然杀伤细胞(NK细胞)对其杀伤活性的影响.方法Percoll细胞分离液分离外周血NK细胞,流式细胞仪检测分离后CD56阳性细胞浓度.以逆转录病毒为载体将NKG5-SV基因和对照基因LacZ导入NK细胞,Northernblot检测NKG5-SV的表达,K562细胞杀伤实验检测病人NK细胞转染NKG5基因前后和正常人NK细胞的NK活性.结果Percoll分离后的淋巴细胞CD56阳性细胞为77.44%,分离前为15.88%.病人NK细胞经NKG5-SV基因转染后NKG5-SVmRNA表达增高.病人NK细胞、NK-LacZ细胞、NK-NKG5-SV细胞和正常人NK细胞对K562的杀伤活性分别为5.96%±0.38%、6.03%±0.42%(P＞0.05)、27.67%±0.18%(P＜0.01)、30.33%±0.83%(P＜0.01).结论免疫效应蛋白基因导入NK细胞,可增强NK细胞的杀伤活性.     

肿瘤患者自体CIK细胞输注增强再次制备时CD3~+CD56~+细胞的体外扩增能力

目的探讨自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)输注治疗对再次制备CIK细胞亚群的构成和活性的影响。方法选取经2个疗程CIK细胞治疗的患者201例,分为CIK治疗后90 d内(含90 d)制备检测组和大于90 d制备检测组。台盼蓝拒染法检测细胞增殖;流式细胞术分析CD3、CD4、CD8,CD56和NKG2D受体表达情况的变化;乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。结果 CIK细胞输注治疗后90 d内再次制备CIK细胞的CD3+CD56+细胞百分率(16.7±9.1)%,与CIK细胞输注治疗前相比(13.5±8.6)%,显著增加(P0.01),而且,表面受体NKG2D表达水平((84.1±10.8)%,也比CIK细胞输注治疗前明显增高((81.1±14.8)%)(P0.05)。与此相反,CIK细胞输注治疗后导致再次制备时,CIK细胞群体中CD3+CD4+百分率(15.2±9.7)%,与CIK输注治疗前(17.6±12.5)%相比,显著下降(P0.01)。值得注意的是,CIK细胞输注治疗后超过90 d再次制备CIK细胞的CD3+CD56+细胞分布和NKG2D受体表达,与CIK细胞输注治疗前相比均无明显变化,但CIK细胞输注治疗后仍可导致再次制备时,CIK细胞群体中CD3+CD4+百分率(14.5±9.4)%,与CIK细胞输注治疗前相比(18.2±12.9)%,明显下降(P0.01)。另外,2组再次制备CIK细胞的总数和体外细胞杀伤活性无明显差异。结论 CIK细胞输注治疗有助于提高肿瘤患者CD3+CD56+细胞前体细胞,在相同CIK细胞培养制备体系中增殖、定向分化和活化的能力,该作用持续时间不超过90 d,因此,CIK细胞治疗疗程间隔时间不应超过90 d。     

细胞毒效应的DNA荧光测定法测定恶性肿瘤患者外周血NK细胞活性

本文根据溴化乙锭(EB)可特异地与双链DNA嵌合产生荧光反应的特性,建立了细胞毒效应的DNA荧光测定法。本法的主要特点是通过测定效应细胞和靶细胞作用后残留靶细胞DNA的荧光强度和对照靶细胞的DNA荧光强度,分析效应细胞对靶细胞的杀伤效应。研究结果表明,人外周血淋巴细胞与人红白血病K562靶细胞按不同的效靶比例共同培养20小时后,未损伤的残留靶细胞DNA的荧光强度和对照靶细胞DNA的荧光强度的比值与效应细胞的杀伤效应呈负相关性。本文检测了34例正常人和30例恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞的NK细胞活性,其平均值分别为51.96±6.62%和25.02±10.83%两者之间有非常显著的差异(P<0.01),表明用DNA荧光测定法检测NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性具有较高的敏感性。