视网膜Müller细胞原代培养的技术研究

目的介绍一种新的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞条件化原代培养的方法。方法使用ＣｏｎＡ活化脾细胞培养上清液作为条件化培养基，分别培养人、大鼠、小鼠的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞，并进行形态学观察及免疫组织化学染色。结果用该方法原代培养不同种类的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞，免疫组织化学染色显示９０％以上的视网膜Ｍüｌｅｒ细胞的神经胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）和Ｓ－１００蛋白染色阳性。结论视网膜Ｍüｌｅｒ细胞的条件化原代培养是一种可靠的、快速获得不同种类视网膜Ｍüｌｅｒ细胞的理想方法。     

新生大鼠视网膜Müller细胞原代培养纯化及鉴定

目的 探讨新生SD大鼠视网膜Müller 细胞原代培养的方法.方法 用酶消化法分离制备视网膜细胞悬液,采用分次贴壁和反复吹打法分离并纯化Müller 细胞,进行形态学观察及免疫组织化学染色.结果 光镜下培养细胞体较大,呈扁平不规则形状;免疫组织化学染色显示95%以上的原代细胞神经胶质纤维酸性蛋白染色阳性;电镜下细胞内可见丰富的线粒体、高尔基体和大量直径8～10 nm的微丝结构.结论 分次贴壁和反复吹打法是一种简单可靠的视网膜Müller 细胞原代培养的方法.     

恒温摇动法纯化培养大鼠视网膜Mǖller细胞的技术研究

目的 建立一种新的纯化Mueller细胞的技术方法。方法 将原代培养后的混合性视网膜细胞固定在一个摇床平台上，保持在37℃，摇床转速调整到使培养液不生成泡沫的速度，过夜（18-24h)摇动后，将培养液上清弃去，通过免疫细胞化学的方法鉴定原代和摇动法得到的Mueller细胞的纯度。结果 原代培养的视网膜细胞有大量神经元和Mueller细胞混杂，摇动过程使得附着于Mueller细胞上的神经元细胞脱落，Mueller细胞的纯度通过GFAP确定可达95%以上。结论 恒温摇床摇动的方法，提供了一种快速可靠的纯化视网膜Mueller细胞手段。     

利用流式细胞仪分选纯化大鼠视网膜Muller细胞

背景在研究视网膜Muller细胞的病理生理过程中,建立Muller细胞的培养模型、获得高纯度的Muller细胞是基本步骤。目前使用的纯化培养Muller细胞的技术所获得的细胞纯度不够理想。目的建立一种获得高纯度原代培养视网膜Muller细胞的技术方法。方法取5只新生sD大鼠的视网膜经质量分数0．01％胰蛋白酶消化制备细胞悬液,然后在含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基中进行原代培养,细胞扩增至大于6×10^5个时收集细胞,无菌条件下用流式细胞仪进行分选,将细胞悬液中体积最大、数量最多的一种细胞分选出来继续培养并传代,应用透射电镜和光学显微镜观察细胞的形态学变化,应用免疫组织化学技术鉴定培养和传代的细胞类型及纯度。结果原代培养视网膜Muller细胞成功,其中混杂有其他类型的小细胞,生长缓慢,培养3周生长速度加快。用分次贴壁法清除成纤维细胞,经传代去除部分神经元,经流式细胞仪纯化后可获得细胞成分单一、体积最大的一批细胞。透射电镜下细胞内可见丰富的线粒体、高尔基体和大量直径8～10nm的微丝。培养细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色细胞阳性率为100％。结论利用流式细胞仪对培养的Muller细胞进行分选是可行的,能够获得高纯度的视网膜Muller细胞。     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

人视网膜Mūller细胞培养及超微结构免疫组织化学观察

用酶消化法培养人视网腆Mūller细胞井传代，用电镜及免疫组织化学(免疫组化)技术对细胞进行鉴定。结果显示Mūller细胞贴壁生长，原代细胞胞体狭长，胞质丰富，细胞内含丰富的8~10nm直径的微丝及细胞连接结构。免疫组化显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白、波形蛋白阳性，证实为Mūller细胞。提示酶消化法培养是一种可靠的、大量获取人视网膜Mūller细胞的方法． （中华眼底病杂志，1995，11：178-180）     

人视网膜神经胶质细胞原代培养

采用组织消化培养法培养山人视网膜神经胶质(retinal glia,RG)细胞，用免疫组织化学技术对细胞进行鉴定，显示培养细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)，S-100染色阳性。结合透射及扫描电镜观察，证实为人视网膜神经胶质细胞。 （中华眼底病杂志，1995，11：247-249）     

腹腔渗出细胞辅助原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞

目的 观察以腹腔渗出细胞为饲养细胞对原代培养的成年大鼠视网膜Müller细胞生长状态的影响。方法 制备大鼠腹腔渗出细胞,CD68免疫组织化学染色鉴定巨噬细胞,墨汁吞噬实验检测吞噬活性。酶消化法原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞,神经胶质酸性蛋白（GFAP）和波形蛋白免疫组织化学染色鉴定。饲养细胞加入Müller细胞进行共培养后,流式细胞术分析Müller细胞的生长周期,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口翻译法（TUNEL）染色检测凋亡情况。结果 大鼠腹腔渗出细胞中巨噬细胞占95%以上,对墨汁颗粒有良好的吞噬能力。原代培养的Müller细胞贴壁生长,胞体较大、扁平,第3代细胞生长减慢。加入饲养细胞后,Müller细胞生长增生加快,S期和G2/M期细胞增多（S期, t=4.172, P<0.001;G2/M期, t=3.562, P<0.01）,第1代细胞生长时间由25~30 d缩短至18~22 d,第2代由10~15 d缩短至7~10 d;Müller细胞凋亡减少（t=3.804, P<0.01）。结论 以腹腔渗出细胞为饲养细胞能促进Müller细胞的生长增生,抑制其凋亡,加快Müller细胞的培养速度,是原代培养成年大鼠视网膜Müller细胞的一种有效方法。     

视网膜石蜡切片法改进及其分子结构与PMI关系的研究

目的：寻找一种更好的制作视网膜石蜡切片方法,探讨不同时间点视网膜层细胞凋亡蛋白Bax表达含量变化与死亡时间的关系。 方法：将Wistar大鼠按死后0,12,24,36h随机分为A,B,C,D四组,各组的眼球标本应用本研究新型改进方法制作石蜡切片后,分别做HE、免疫组织化学、荧光染色;进行图像分析与统计学处理。 结果：采用改进的石蜡切片制作方法,HE染色显示死后0h各组视网膜组织结构和层次均基本保持完整, 细胞形态清晰;随着时间的延长,视网膜各层逐渐发生紊乱并出现核固缩。免疫组织化学、免疫荧光染色结果均显示随着死亡时间的延长,A、B、C三组Bax表达含量依次增多,D组下降。两两比较,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论：改进的石蜡视网膜组织切片制作方法较好,值得推广。Wistar大鼠死后不同时间视网膜层细胞凋亡蛋白Bax表达与死亡时间具有相关性,为法医进一步推断死亡时间的研究奠定了基础。"     

SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨视网膜神经细胞培养的上清液对胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES）体外分化的诱导作用。 方法 收集SD大鼠视网膜神经细胞培养上清液，抽滤后按2∶3比例与DMEM培养液混合，用该混合液进行ES 细胞的诱导分化，每天倒置相差显微镜观察ES细胞的生长及分化情况,对诱导分化后的细胞进行神经丝蛋白(nellcofilament protein，NFP)免疫组织化学检查。 结果 加入了视网膜神经细胞培养上清液的ES细胞生长出类似神经细胞突起样结构，NFP免疫组织化学染色阳性。 结论 SD大鼠视网膜神经细胞培养的上清液具有诱导ES细胞向神经细胞分化的作用。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 134-136)     

转化生长因子α对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体调控作用的研究

目的 观察转化生长因子α（TGFα）对鼠视网膜Müller细胞谷氨酸转运体 (GLAST) mRNA、蛋白质表达及摄取活性的调控作用。方法 取出生后7～10 d 的新生昆明小鼠视网膜组织，体外进行Müller细胞的培养。同一原代细胞的第3～4代细胞培养后随机分为2组：①TGFα干预组：分别加入浓度为50、75、125、150 ng/ml的TGFα，每种浓度3孔；②对照组：仍用含20%胎牛血清的Dulbeccon改良Eagle培养基培养。采用L-3H-谷氨酸摄取分析方法观察不同浓度TGFα对Müller细胞GLAST摄取活性的影响；逆转录聚合酶链反应方法分析Müller细胞GLAST mRNA表达的差异；免疫组织化学染色方法检测Müller细胞GLAST蛋白质表达的变化。结果随着TGFα浓度的增加，L-3H-谷氨酸的摄取量及GLAST mRNA表达量均逐渐增加，TGFα浓度为125 ng/ml时，L-3H-谷氨酸的摄取量达到最大值，为对照组的266%，同时GLASTmRNA表达量也达到最大值，为对照组的近4倍。免疫组织化学染色显示当TGFα浓度为125 ng/ml时，干预组Müller细胞内的GLAST蛋白表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 TGFα可通过上调GLAST mRNA和蛋白质的表达增加视网膜Müller细胞谷氨酸转运体GLAST的摄取活性。     

α晶状体蛋白对脂多糖诱导的视网膜小胶质细胞增生及TNF-α表达的影响

目的观察α晶状体蛋白对脂多糖（LPS）诱导的视网膜小胶质细胞增生及肿瘤坏死因子α（TNF—α）生物学活性的影响。方法原代培养视网膜小胶质细胞，并采用CD11b细胞免疫荧光及流式细胞仪鉴定纯度，加入α晶状体蛋白及LPS后，通过MTT（四氮唑蓝比色细胞增生测定）检测α晶状体蛋白对LPS活化的小胶质细胞增生能力的影响，并采用ELISA、RT—PCR检测TNF—α蛋白水平及mRNA水平表达的变化。结果原代培养的小胶质细胞经免疫组织化学鉴定及流式细胞仪鉴定纯度分别达到95．8％和91．4％，经10^-4／Lα晶状体蛋白预处理后，LPS诱导的小胶质细胞增生被抑制（P〈0．01）；与未处理组比较，TNF—α蛋白质量浓度及mRNA表达量明显降低（P〈0．05）。结论α晶状体蛋白可以减少LPS诱导的原代培养视网膜小胶质细胞增生及TNF—α表达。     

高糖对体外培养的视网膜Müller细胞膜离子通道的影响

目的 观察在高浓度葡萄糖条件下，体外培养的兔视网膜Müller细胞的钙依赖性钾(K_Ca)通道的变化。 方法 高浓度葡萄糖条件下体外培养兔视网膜Müller细胞，并用免疫组织化学染色及透射电镜鉴定培养的Müller细胞，采用膜片钳方法观察不同时间高糖条件下视网膜Müller细胞K_Ca通道的变化。 结果 高糖对体外培养的Müller细胞K_Ca通道有阻滞作用，其阻滞作用呈时间依赖性。 结论 高浓度葡萄糖可能通过阻滞K Ca通道而降低 Müller细胞的生物学功能。 （中华眼底病杂志，2003，19：164-167）     

CD81在正常大鼠神经视网膜上的表达

目的 观察CD81在正常大鼠神经视网膜上的表达.方法 用抗CD81抗体对正常大鼠视网膜组织进行免疫组织化学染色,并对神经视网膜进行Western blot分析,同时用细胞免疫组织化学染色法检测体外培养视网膜神经胶质细胞的CD81表达.结果 大鼠视网膜神经节细胞层、内丛状层和外丛状层呈阳性网状致密染色;Western blot分析神经视网膜层出现CD81阳性条带;体外培养的大鼠视网膜神经胶质细胞也呈CD81阳性表达.结论 正常大鼠的神经视网膜表达CD81,视网膜神经胶质细胞是表达CD81的一种细胞类型.     

鼠视网膜神经细胞的原代培养

鼠视网膜神经细胞的原代培养刘瑶陈钦元若仓雅登王文吉关键词神经元视网膜细胞，培养的免疫组织化学神经细胞是视网膜光感受及神经信息传递功能的执行者，各种致病因子对视网膜功能的损害最终表现为神经元功能的丧失。因此，研究离体状态下视网膜神经元的生理、生物化学特...     

体外培养兔视网膜Müller细胞葡萄糖转运载体蛋白1表达及其影响因素研究

目的观察高糖以及高浓度胰岛素等不同因素对体外培养兔视网膜Müller细胞葡萄糖转运载体蛋白1(GLUT1)表达的影响。方法利用组织块悬浮法原代培养兔视网膜Müller细胞，分为正常对照组、高糖组、胰岛素组、高糖加胰岛素组，通过激光共聚焦显微镜结合免疫细胞化学、荧光染色的方法，定位定量分析GLUT1的表达情况。结果高糖及高浓度胰岛素条件下视网膜Müller细胞GLUT1的表达均明显增强，并主要位于细胞浆靠近核膜周围。结论视网膜Müller细胞可表达GLUT1，高糖以及高浓度胰岛素均可使其表达增强。 （中华眼底病杂志，2008，24：265-267）     

缺氧对视网膜Mueller细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的 探讨缺氧对体外培养的大鼠视网膜Mueller细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor，PEDF）表达的影响。方法 采用RT-PCR和western印迹分析方法分别对不同缺氧时间视网膜Mueller细胞VEGF和PEDF的mRNA及蛋白水平进行测定。结果 Mueller细胞VEGF mRNA及蛋白表达在缺氧12h后明显升高，缺氧24h更为显著，24h时2者分别为对照组的2．12倍（P＜0．05）和1．70倍（P＜0．05）。PEDF mRNA及蛋白表达在缺氧6h后明显下降（P＜0．05），缺氧24h下降更为显著，24h时2者分别为对照组的0．11倍（P＜0．01）和0．54倍（P＜0．05）。结论 缺氧条件下，体外培养的大鼠Mueller细胞VEGF和PEDF表达失衡，PEDF表达下降，同时VEGF表达增加，2者的表达失衡可能在视网膜病理性新生血管形成过程中起一定作用。     

猪视网膜色素上皮细胞的体外培养与鉴定

目的建立猪视网膜色素上皮（RPE）细胞体外分离、纯化培养体系并进行鉴定,为研究RPE细胞的功能及治疗相关眼底疾病提供细胞来源。方法采用胰蛋白酶消化法获取猪RPE细胞进行原代及传代培养,倒置显微镜观察细胞生长过程及形态变化并计算生长数据,角蛋白和RPE65蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果用胰蛋白酶消化法分离培养的猪RPE细胞生长良好,表现为多边形和梭形两种形态,原代细胞胞浆内含有丰富的色素颗粒,传代细胞内色素颗粒较原代细胞少。免疫组织化学法证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。结论培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源,体外分离、纯化和培养猪RPE细胞的成功,为RPE细胞功能和相关视网膜疾病的深入研究提供了细胞来源。     

体外培养的兔睫状体色素上皮细胞表达转化生长因子-β1

目的研究体外培养条件下兔睫状体色素上皮(ciliarypigmentepithelium,CPE)细胞是否表达转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1),探讨TGFβ1在增殖性玻璃体视网膜病变中的作用。方法体外培养兔眼CPE细胞,取第3代细胞应用免疫组织化学Supervision染色方法检测TGFβ1的表达,用PBS代替第1抗体作为阴性对照。结果与正常活体组织不同,体外培养的兔CPE细胞经免疫组织化学染色,其细胞膜和细胞浆呈棕黄色阳性着色,阴性对照组未见明显棕黄色阳性着色。结论CPE细胞具有合成和表达TGFβ1潜能,为进一步研究增殖性玻璃体视网膜病变、房水形成和睫状体炎症奠定了基础。     

大鼠视网膜微血管内皮细胞的原代培养及鉴定改进

【摘要】 目的 探讨大鼠视网膜微血管内皮细胞原代培养改进方法,为研究视网膜新生血管疾病的病理机制奠定基础。设计 实验研究。研究对象 大鼠视网膜微血管内皮细胞。方法 采用机械剪除大鼠视网膜血管联合酶消化分离,用含胎牛血清、内皮细胞培养特制添加剂等的条件培养基培养及纯化大鼠视网膜微血管内皮细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状态。应用因子VIII、血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）免疫鉴定细胞。主要指标 微血管内皮细胞形态,免疫荧光染色。结果 原代培养的大鼠视网膜微血管内皮细胞贴壁后散在分布,呈单层排列,多为梭形,边界清楚,少量呈铺路石样螺旋向外生长,3~5天后融合,呈簇状单层分布。免疫荧光细胞染色显示,因子VIII抗体染色核周出现黄绿色荧光反应,CD31因子抗体染色以胞浆着色为主。细胞纯度较高,荧光染色阳性细胞率为95%。结论 采用机械剪除大鼠视网膜血管、胰蛋白酶和胶原酶消化、含特制添加剂培养基的应用、明胶包被培养瓶等综合法可获得较纯的大鼠视网膜微血管内皮细胞。（眼科,2012,21：261-263）