结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药与gyrA基因突变的关系

目的:了解结核分枝杆菌临床分离株氟喹诺酮类药物耐药与gyrA基因突变的关系.方法:选取经过全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏系统(BACTEC-MGIT960)检测的氟喹诺酮类药物敏感株30株,耐药株30株,针对其gyrA基因的氟喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)进行扩增,并将扩增产物进行T-A克隆后进行测序.结果:在这60株结核分枝杆菌临床分离株中,30株敏感株均未在QRDR检出有义突变,30株耐药株中有19株QRDR存在有义突变,主要突变位点为90、91和94.gyrA基因突变占结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药菌株的63.3％(19/30).结论:gyrA基因突变与结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药密切相关.     

反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变

目的 建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变，并评价其临床应用价值。方法 应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测，所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较。结果 62株对利福平耐药的菌株中，54株碱基突变被准确鉴定，灵敏度为87．1％(54／62)，阳性预测值为：100％；40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定，特异性为100％，阴性预测值为83．3％(40／48)；准确度为92．2％(94／102)。与测序法结果符合率为99％。结论 以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高，无假阳性结果，因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛。     

斑点杂交法检测结核分枝杆菌的初步报告

目的建立一种快速、准确、简便的检测结核分枝杆菌的方法。方法异硫氰酸胍裂解、酚-氯仿抽提、异丙醇沉淀法直接抽提结核分枝杆菌rRNA,地高辛标记探针斑点杂交,酶呈色观察结果检测结核分枝杆菌,用该法检测76例临床标本。结果该法至少可检测1.6×102/m l个结核分枝杆菌;20种其它分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测结果均为阴性;两份强阳性和弱阳性标本抽提结核分枝杆菌rRNA重复杂交5次,结果完全一致;46例肺结核病人痰标本检出阳性26例,30例非结核病人痰标本检测结果均为阴性。结论斑点杂交法检测结核分枝杆菌方法简便,无需特殊仪器,有较高的敏感度、特异性和良好的重复性,适合在基层医院推广使用。     

聚合酶链反应-反向斑点杂交鉴定分枝杆菌菌种

目的 建立一种简便、快速、敏感和特异的分枝杆菌菌种鉴定方法。方法以１６ＳｒＤＮＡ为靶序列,采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－反向斑点杂交检测２５种分枝杆菌１１种分枝杆菌标准株、１２０株分枝杆菌临床分离株和２６份痰标本。结果 分枝杆菌、非分枝杆菌标准株经ＤＮＡ扩增,分枝杆菌均出现５７８ｂｐＤＮＡ片段,非分枝杆菌除假白喉棒状杆菌可见同样片段外,其余菌种均未见扩增。敏感性试验可检测出１００ｆｇ结核分枝杆菌ＤＮ     

结核分枝杆菌耐药性检测研究进展

自20世纪80年代以来，结核病疫情重新上升，据WHO估计，目前全球约有20亿人感染结核分枝杆菌(TB)，其中约有5000万人感染耐药TB。因此对TB耐药机制和耐药性检测的研究意义重大。分子生物学技术的发展，为研究TB提供了良好技术平台，极大地促进了TB耐药性检测的研究进程。目前临床正在使用和研究的药敏试验方法归纳起来有表型和基因检测2类。     

结核分枝杆菌gyrA基因突变与氟喹诺酮类药物体外最低抑菌浓度的关系

目的 探讨结核分枝杆菌gyrA基因突变与氟喹诺酮类药物体外最低抑菌浓度(MIC)的关系.方法 收集640例痰结核分枝杆菌阳性临床分离株,用探针熔解曲线法筛选gyrA基因耐药决定区突变株,对其gyrA基因耐药决定区进行测序,并检测氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星及加替沙星对不同突变位点菌株的MIC,分析其差异.结果 探针熔...     

PCR-探针熔解分析法检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药基因突变的临床应用评价

目的评价PCR-探针熔解分析法(PMAA)检测结核分枝杆菌(MTB)氟喹诺酮(FQ)药物耐药性的临床应用价值。方法采用常规比例法和PCR-PMAA对509株MTB临床分离株进行FQ药物敏感性试验。对69株比例法和(或)PCR-PMAA法检测耐药以及440株两法检测均敏感的MTB菌株中抽取的55株菌株,进行FQ药物耐药相关基因gyrA和gyrBPCR-DNA测序。结果以常规比例法为标准,PCR-PMAA检测FQ药物耐药性的敏感性、特异性、阳性和阴性预测值、符合率及约登指数分别为97.01%、99.55%、97.01%、99.55%、99.21%及0.97。比例法和(或)PCR-PMAA检测耐药的69株中,经DNA测序证实44株gyrA94位密码子GAC→AAC(D→N)或CAC(H)或GGC(G)或GCC(A)突变;4株gyrA91位密码子TCG→CCG(S→P)突变;19株gyrA90位密码子GCG→GTG(A→V)或AAG(K)突变;1株gyrB500位GAC→AAC(D→N)突变;1株在测序范围未见突变。55株两法检测均敏感样品DNA测序结果证实,gyrA和gyrB基因均未见耐药相关的基因位点突变。结论 ...     

结核分枝杆菌耐药基因突变的研究

结核病在许多国家出现回升的一个主要原因是细菌耐药性问题 ,随着联合药物治疗的使用 ,又出现了耐多药结核分枝杆菌 (结核菌 ) ,使许多结核病 ,难以治疗 ,增加了死亡率[1] 。目前对于结核菌的耐药机制的研究已有了较大的进展 ,细菌内一些酶的基因突变或缺失是导致耐药的重要原因。随着分子生物学技术的发展 ,通过聚合酶链反应 (PCR)等方法对耐药基因进行快速检测 ,大大缩短了检测时间 (2～3d) ,为耐药结核菌的治疗提供参考。本研究通过PCR -SSCP ,PCR -测序技术检测结核菌临床分离株的katG、rpoB和rpsL基因序列 ,分析济南军区结核菌…     

结核分枝杆菌快速耐药表型检测技术的新进展

结核病至今仍然是危害公共健康的一大难题.耐多药/广泛耐药的结核分枝杆菌(MDR-TB/XDR-TB)仍是制约控制结核病传播的重大影响因素,因此分析结核分枝杆菌对一线及二线抗结核药的耐药情况是十分必要的.传统检测方法耗时长且操作繁琐.近些年来,出现了一些快速的结核分枝杆菌耐药检测方法,该综述将介绍几种以结核分枝杆菌培养为基础的快速耐药检测.     

301株结核分枝杆菌耐药性分析

目的：探讨本地区初、复治肺结核病人结核分枝杆菌初治耐药和复治耐药情况及耐药结核杆菌的药物依赖性监测。方法：对在本所住院的肺结核病人痰标本分离培养出的301株结核分枝杆菌进行药物敏感性测定，所有试验均严格按照结核病诊断细菌学检验规程操作。结果：培养阳性率36．3％，链霉素(SM)、异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)4药总耐药率为54．8％，初治耐药率41．3％，复治耐药率74．6％，含异烟肼 利福平(HR)方案的耐多药结核病(MDR-TB)病人的耐药率为19．3％，药物依赖性菌株占19．2％。结论：结核菌耐药率逐年下降反映我市结核病控制工作已见成效，但仍属于高耐药区域。及早进行药敏试验筛选有效药物是成功治疗耐多药结核病的关键。     

耐多药结核分枝杆菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性研究

目的 研究耐多药结核分枝菌中embB基因突变与乙胺丁醇耐药的相关性. 方法 比例法检测84株耐多药结核分枝杆菌的乙胺丁醇(EMB)耐药性,基因测序检测embB基因的突变,2检验分析二者之间的相关性. 结果 84株耐多药结核分枝杆菌中有43株(51.2%)对EMB耐药,41株(48.8%)对EMB敏感,57株耐多药菌株(67.9%)的embB基因发生突变.在43株EMB耐药菌株中,embB基因突变的菌株为40株(93.0%),而41株EMB敏感菌株中,embB基因突变的菌株为17株(41.5%),embB基因在耐药菌株中的突变频率远高于敏感菌株(2=25.58,P=0.00).embB306是最常见的突变位点,其在耐药菌株的突变率也高于敏感菌株(2=12.37,P=0.00),embB基因和embB306位点检测EMB耐药的敏感度、特异度和准确性分别为93.0%和65.1%,58.5%和73.2%,76.2%和69.0%. 结论 EMB耐药的产生与embB基因和embB306突变有关,二者用于检测EMB耐药有一定的参考意义.     

耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因上新的突变位点

目的:分析耐左氧氟沙星结核分枝杆菌临床菌株gyrA基因的突变情况及其耐药机制.方法:用聚合酶链反应(PER)和DNA直接测序技术(DS)测定64株耐左氧氟沙星结核分枝杆菌gyrA基因的QRDR(quinolone resistance-determining regions)序列.结果:64株耐药菌株有47株QRDR序列发生突变,其中45株为单位点突变,另2株为双位点突变;突变分布为70位突变2株、89位1株、90位12株、91位4株、94位30株,其中70位和89位为新发现的突变位点.结论:结核分枝杆菌喹诺酮类药物耐受现象与gyrA基因QRDR的突变有关,包括新发现的70位和89位突变.     

结核分枝杆菌耐药的分子机制及分子生物学检测方法进展

结核分枝杆菌原发性和继发性耐药是世界范围问题,因此进行结核分支杆菌的耐药性机制和检测研究,对有效地防治结核病,尤其是指导临床用药上,具有极其重要的意义。结核分枝杆菌特异性突变位点是其耐药性的分子机制。     

用反向斑点杂交法检测结核杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性

目的建立结核分支杆菌对链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药基因突变的快速检测方法。方法根据结核分支杆菌标准株H37Rv序列,自行设计针对rpsL和embB基因常见耐药突变的系列寡核苷酸探针,制成膜芯片,并对64例结核分支杆菌临床株的基因突变情况进行检测。结果在34株SM耐药菌中,有25株被检出在rpsL基因分析部位发生突变,检出率为73．5％（25／34）,其中23株（67．6％）为第43位密码子AAG→AGG突变,2株（5．9％）为第88位密码子AAG→AGG突变;在32株EMB耐药菌中,有19株在embB基因分析部位发生突变,检出率为59．4％（19／32）,其中12株（37．5％）为ATG→GTG突变;6株（18．8％）为ATG→ATA突变;1株（3．1％）为ATG-＊CTG突变。膜芯片检出的突变与基因测序结果一致。结论用膜芯片检测结核分支杆菌对链霉素和乙胺丁醇的耐药性,具有较高的特异性和敏感性,可作为常规药敏方法的补充,用于指导开展早期、有效的临床化疗。     

PCR反向点杂交技术快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种的应用研究

目的探讨PCR-反向点杂交技术(PCR-RDBHA)快速鉴定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid BALF)标本中分枝杆菌菌种的临床应用价值。方法对临床306例活动性肺结核患者、疑似非结核分枝杆菌感染肺病患者BALF标本采用PCR-反向点杂交技术和传统的改良罗氏培养法进行分枝杆菌菌种鉴定。结果 306例BALF标本PCR反向点杂交技术检测出分枝杆菌127例,阳性率为41.5%(127/306),其中结核分枝杆菌复合群(MTC)108例,占分枝杆菌的85.0%(108/127),非结核分枝杆菌(NTM)19例,占分枝杆菌的15.0%(19/127)。NTM中,6例脓肿分枝杆菌,10例胞内分枝杆菌,2例戈登分枝杆菌,1例瘰疬分枝杆菌;传统的改良罗氏培养法检测出分枝杆菌101例,阳性率33.0%(101/306),经菌种的初步鉴定,其中MTC89例,占分枝杆菌的88.1%(89/101),NTM12例,占分枝杆的11.9%(12/101)。结论 PCR反向点杂交技术能够快速鉴定BALF中分枝杆菌菌种,该方法简便、结果准确,具有良好的临床应用价值。     

上海地区肺结核病患者氧氟沙星耐药情况分析

目的 了解上海地区肺结核病患者氧氟沙星耐药的分布情况及可能的危险因素.方法 收集2009-2010年上海市各结核病定点医院的447株对任意一种一线抗结核药物(异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇)耐药的菌株,同期随机选取151株对上述4种一线抗结核药物全敏感菌株,对这598株结核分枝杆菌菌株进行氧氟沙星敏感性检测,分析氧氟沙星耐药的分布情况.收集肺结核患者的年龄、性别、抗结核治疗史和户籍资料,采用多因素分析研究氧氟沙星耐药可能的危险因素.用DNA测序分析氧氟沙星耐药菌株gyrA、gyrB基因耐药突变的特征.结果 447株耐药菌株中,72株(16.1%)对氧氟沙星耐药,MDR(至少同时对异烟肼、利福平耐药)结核分枝杆菌中氧氟沙星耐药44株(39.6%).在151株一线抗结核药物全敏感菌株中,4株(2.6%)耐氧氟沙星.多因素分析结果显示MDR和多耐药(对一种以上抗结核药物耐药,但不对异烟肼和利福平同时耐药)等与氧氟沙星耐药有关(OR分别为19.5、5.6,95% CI 分别为6.4～59.4、1.7～18.1,P均＜0.05).患者为复治病例与氧氟沙星耐药相关(OR=2.3,95%CI:1.2～4.0,P＜0.05).氧氟沙星耐药与年龄偏大有关(OR=1.03,95%CI:1.01～1.05,P＜0.05).76株氧氟沙星耐药菌株的gyrA、gyrB基因序列分析显示62株(81.6%)发生耐药突变.结论 上海地区MDR结核病患者中氧氟沙星耐药率高于对一线抗结核药物全敏感的肺结核病患者.MDR、多耐药、复治、年龄为氧氟沙星耐药可能的危险因素,其中以MDR与氧氟沙星耐药的关联强度最大.     

基因芯片技术检测结核分支杆菌耐利福平基因突变的研究

目的建立基因芯片检测结核分支杆菌耐利福平基因突变，结合基因测序和常规药物敏感性试验进行比较，探讨其实用价值。方法根据结核菌rpoβ基因突变特点，设计不同的寡核苷酸探针，点样制备可检测rpoβ基因突变的芯片，检测利福平（Rifompicin，RFP）株的rpoβ变异情况。结果137株临床分离结核菌，49株耐RFP，占35．8％，平均MIC为179．6±135．0ug／mL。Rpop突变率为95．7％（47／49），主要为点突变。突变点依次为531 Ser（TCG）→Leu（TTG）（40．8％）、531 Ser（TCG）→Trp（TGG）（12．2％）、526 His（CAC）→Tyr（TAC）（6．1％）、526His（CAC）→Asp（GAC）（6．1％）。526 His（CAC）→Asn（AAC）（6．1％）、526 His（CAC）→Pro（CCC）（8．2％）、516Asp（GAC）→Val（GTC）（12．2％）、533 Leu（CTG）→Arg（CGG）（4．1％）和513 GIn（CAA）→Pro（CCA）（2．1％）。结论本研究建立的检测结核菌rpoβ基因突变的基因芯片技术敏感性高，特异性强，可应用于结核菌耐RFP基因的检测。     

直接杂交法检测痰液中结核分枝杆菌

目的 建立了一种高度灵敏、特异、快速和简便的探针杂交检测技术，以解决临床上结核病快速诊断的难题。方法 采用简易的方法处理标本，以对结核分枝杆菌特异的生物素标记188bpDNA探针进行点杂交，与链霉亲合素标记的辣根过氧化酶偶联后，以化学发光自显影方式记录检测信号。结果 此法的第三性可检出200个菌，较PCRI地为高，对20种分枝杆菌和9种非分枝杆菌检测时发现只有结核分枝杆菌呈阳性，以本法检测104例临床标本。结果发现，对其中45例结核病人痰涂片阳性标本。41例结核病人痰涂片阴性标本和18例非结核标本。检测阳性率分别为100%、65.9%和0.0%。结论 本法简便，特异。     

探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变

目的 评价探针熔解分析法快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变的应用价值,为临床检测提供指导依据.方法 613份痰标本于2009年9月至2010年4月收集自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心.结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于国家结核病参比实验室.37株包含结核与非结核分枝杆菌的标准盘由中国药品生物制品检定所提供.首先采用梯度稀释的野生型标准株H37Rv DNA考察探针熔解曲线分析法的分析灵敏度,然后用标准盘验证其检测特异性,最后以测序法为对照方法,采用613份结核分枝杆菌的标本评价该方法的临床应用价值.结果 探针熔解分析法可检测到3拷贝/反应,且能特异检测结核分枝杆菌.613份结核分枝杆菌的检测结果显示,符合要求的583份标本的试剂盒检测结果与测序结果完全一致,其中embB306突变菌株数为34株,embB 378-380突变菌株数为23株,embB 406突变菌株数为3株,embB 497突变菌株数为3株.结论 探针熔解分析法检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药突变特异性好,灵敏度高,能有效地检测临床标本常见乙胺丁醇耐药突变位点,是值得推广的快速检测方法.

Abstract：

Objective To evaluate the potential use of a probe melting analysis (PMA) assay in detecting the embB mutations which confer resistance against ethambutol in Mycobacterium tuberculosis. Methods The analysis sensitivity and specificity of PMA were investigated by detecting a serially diluted H37 Rv DNA and a reference panel from National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product. Six hundred and thirteen sputum samples were collected from the Xiamen Center for Disease Control and Prevention, Xiamen First Hospital and Center for Zhangzhou Disease Control and Prevention from September 2009 to April 2010. The PMA assay was then evaluated by detecting 613 clinical isolates and the results were compared with the sequencing results. Results The PMA assay could specifically detect Mycobacterium tuberculosis and had a limit of detection of 3 copies per reaction. The assay results with 613 clinical isolates showed that PMA gave a 100% concordance with sequencing in the 583 qualified samples, among which 34 were mutations at embB 306,23 at embB 378-380, 3 at embB 406 and 3 at embB 497. Conclusions PMA assay is a sensitive and specific method enabling efficient detection of common embB mutations causing ethambutol-resistance. The rapidness of this method together with its reliability would facilitate its use in routine testing.