恒定自然杀伤T细胞在过敏性哮喘中的调节机制

恒定自然杀伤T(invariant nature killer T,iNKT)细胞是T淋巴细胞中独特的亚群,也是经典的自然杀伤T(NKT)细胞,既表达T细胞的表面标志,又表达自然杀伤(NK)细胞的表面标志CD161(NK1.1)分子和NK细胞受体P1C。活化iNKT的经典抗原是糖脂类抗原α-半乳糖神经酰     

不同来源人Vα24＋NKT细胞体外扩增及细胞因子分泌

为了研究人脐血（CB）、外周血（PB）及G—CSF动员后外周血采集物单个核细胞（G—PBMNC）中Vα24＋NKT细胞的表型及体外扩增、细胞因子分泌情况,分别取来自CB和PB的单个核细胞（MNC）以及G-PBMNC,在含α-半乳糖酰基鞘胺醇（α-GalCer）及细胞因子IL-2、IL-15的体系中,体外扩增培养Vα24＋NKT细胞;采用间标磁珠分选纯化NKT细胞;流式细胞术（FCM）检测NKT细胞表型、NKT细胞含量;酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞因子IL4、IFN-γ浓度。结果表明：由CB或PB或G-PBMNC诱导扩增Vα24＋NKT细胞可分别扩增221．5倍、456．5倍、756．38倍。CB或PB来源的Vα24＋NKT细胞经PMA刺激后,24小时生成IL-4、IFN-γ浓度和IL-4／IFN-γ比率分别为180．33VS190．67ng／ml、864．33vs508．49ng／ml、0．503vs0．455。由G-PBMNC诱导扩增Vα24＋NKT细胞,培养9天及12天时生成IL-4、IFN-γ浓度及IL-4／IFN-γ比率分别为139．08vs89．3ng／ml、14264．8ml、14488ng／ml、0．0531vs0．0376。结论：不同来源MNC在α-GalCer、IL-2、IL-15诱导下可以短期有效扩增Vα24＋NKT细胞,G-PBMNC诱导扩增的效果优于CB和PB。NKT细胞活化后可以分泌大量IL4及IFN-γ,但以IFN-γ为主。     

再生障碍性贫血患者骨髓自然杀伤T细胞体外活化特性研究

目的 研究再生障碍性贫血(再障)患者骨髓中自然杀伤T(NKT)细胞的数量以及体外活化后的功能状态.方法 将扩增活化骨髓单个核细胞(BMMNC)中NKT细胞的培养体系分为2组:①加入α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide,α-Galcer)+rhIL-2;②加入α-Galcer+rhIL-2+rhGCSF.以流式细胞术(FACS)检测再障患者及正常对照组BMMNC中TCRVα24+Vβ11+细胞(NKT细胞)扩增前后的比率,同时测定NKT细胞活化后胞内IFN-γ、IL-4的表达.结果 再障患者组BMMNC中NKT细胞的比率为(0.19±0.09)%,NKT细胞在①、②培养体系中扩增活化7 d后,扩增倍数分别为79.91±40.56和67.45±29.42(P＜0.05);活化后NKT细胞胞内IFN-γ阳性的比率分别为(62.31±14.67)%和(37.45±7.89)%(P＜0.01);IL-4阳性的比率分别为(27.03±9.88)%和(55.11±12.13)%(P＜0.01).正常对照组BMMNC中NKT细胞的比率为(0.25±0.12)%,较再障患者组显著升高(P＜0.05),正常对照组NKT细胞在相应的①、②培养体系中的扩增倍数均高于再障患者组(P＜0.05);活化后NKT细胞胞内IFN-γ的表达均低于再障患者组(P＜0.05).结论 再障患者骨髓中NKT细胞较正常对照显著减少,扩增能力较正常对照降低,活化后IFN-γ的表达较正常对照升高.在rhG-CSF作用下,再障患者骨髓中NKT细胞经α-Galcer刺激后的扩增能力下降,表达IL-4的NKT2型细胞优势扩增,IL-4表达及分泌增加.     

用细胞因子体外富集人外周血树突状细胞及其特征

树突状细胞(DC)是免疫系统中一类强有力的抗原提呈细胞(APC),在始动机体免疫反应中起至关重要的作用。近年来,人们极大地关注DC用于免疫治疗的前景。然而,DC在人外周血中含量甚微(约占外周血单个核细胞的0.1％),给研究带来相当困难。本研究联合应用rhGM-CSF,rhIL-4和rhTNF-α从人外周血中体外培养富集获得高纯度DC群,通过DC的特有形态鉴别以及应用X-11单克隆抗体(抗人血DC表面特异抗原决定簇的单克隆抗体),借助于间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜观察,初步描述了所获取的DC群的特征。这些结果为进一步观察人外周血DC的超微结构和细胞化学特征及其临床研究DC功能提供了基础。     

NKT细胞及其功能

近年来发现存在一类与传统的αβT细胞(CD4~+CD8~+)不同的T细胞,其αβTCR结构单一,既有T细胞抗原受体又有NK受体且显示T细胞与NK细胞两方面性质,因而称为NKT细胞。NKT细胞通过识别由非经典的MHCI类分子——CD1d分子递呈的糖脂类抗原(a-半乳糖酰基鞘氨醇,α-Gal-Cer)或寄生虫的糖磷脂酰肌醇(GPI),在Th1和Th2的细胞因子的产生及穿孔素介导的细胞毒作用中发挥了重要的作用。     

脐血与外周血NKT细胞的体外扩增及其表型比较

为了建立体外有效扩增脐血与外周血天然杀伤T细胞(NKT细胞)的方法并研究其表型的差异,分别采用单加IL-2及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法,从人脐血单个核细胞(UCB-MNC)和人外周血单个核细胞(PB-MNC)中扩增NKT细胞;用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)的比例及其它表型特征。结果显示:UCB-MNC在第7天时,其TCR Vαβ+NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±4·19)%,是原来的(8.74±4.37)×102倍(P<0.01),而且大多不表达NK1.1(CD161);TCR Vβ11+较TCRVα24+高表达;第14天时,PB-MNC中的TCR Vαβ+NKT细胞扩增量占淋巴细胞的(11.1±3.61)%,是原来的(3·72±2·01)×102倍(P<0.01),且NK1.1高表达,TCR Vβ11+与TCR Vα24+表达率基本一致。结论:α-Galcer对NKT细胞有特异的扩增功能,且脐血NKT的扩增效率较外周血高。以表型划分,脐血中的NKT细胞多为NK1.1-,而外周血多为NK1.1+,是一种新的NKT细胞亚型。     

NKT细胞及其功能

近年来发现存在一类与传统的αβT细胞（CD4^ CD8^ )不同的T细胞，其αβTCR结构单一，既有T细胞抗原受体又有NK受体且显示T细胞与NK细胞两方面性质，因而称为NKT细胞。NKT细胞通过识别由非经典的MHCI类分子－CD1d分子递呈的糖脂类抗原（α－半乳糖酰基鞘氨醇，α－Gal-Cer)或寄生虫的糖磷脂酰肌醇（GPI），在Th1和Th2的细胞因子的产生及穿孔素介导的细胞毒作用中发挥了重要的作用。     

丙型肝炎患者外周血NKT细胞含量变化特征的研究

目的探讨丙型肝炎病毒感染者外周血NKT细胞含量变化的特征。方法应用FITC标记的TcR Vα24单克隆抗体和PE标记的TcR Vβ11单克隆抗体对丙型肝炎病毒感染者外周血进行标记,流式细胞仪检测TcR Vα24/TcRVβ11双阳性NKT细胞的含量。结果抗-HCV＋、HCV RNA＋组NKT细胞明显低于抗-HCV＋、HCV RNA-组和对照组（P〈0.01）;抗-HCV＋、HCV RNA-与正常对照组的NKT细胞无显著性差异（P〉0.05）。结论NKT细胞数量减少不利于丙型肝炎病毒的清除。     

人外周血树突状细胞的体外扩增、鉴定及内吞能力的测定

目的在体外从人外周血中诱导、扩增树突状细胞(DCs).方法从健康人外周血中分离单个核细胞(PBMNCs),在rhGM-CSF、IL-4和TNF-α的诱导下培养扩增树突状细胞.光学显微镜观察其体外培养过程中的形态特征,流式细胞仪(FACS)分析其表型特征,混合淋巴细胞反应(MLR)检测其功能,辣根过氧化酶(HRP)内吞实验检测其群体内吞能力.结果 PBMNCs经过rhGM-CSF、IL-4和TNF-α诱导培养12d后,具典型的DCs形态,细胞表型为MHCⅡ类分子(HLA-DR)93.5%、CD80 96%、CD86 92.6%、CD1a 60.4%、CD83 82.6%和CD14 10.5%,具有极强的激发MLR的能力,显示成熟DCs的特征.DCs群体的内吞能力约在培养第6d达高峰,之后有明显下降.结论该方法是一种可靠的诱导、扩增DCs的方法,为DCs的深入研究和临床应用奠定了基础.     

动员人外周血巨核祖细胞体外扩增的研究

本研究探讨多种细胞因子(TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6)组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用,研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的最佳细胞因子组合及培养时间。用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血(MPB)单个核细胞,免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞,并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天。在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数,采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量;同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养,测定巨核细胞集落形成单位(CFU-MK)的数量。结果表明经过15天的培养,在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中,以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果最好,明显高于其它3组,CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍。第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降。CFU-MK产率(/1×103个细胞)第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个,明显高于其余3组。结论以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的最佳组合,动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜。本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系。     

自然杀伤T淋巴细胞对黑色素瘤细胞的免疫调节及杀伤功能实验研究

目的探讨自然杀伤T淋巴细胞(NKT细胞)在细胞免疫调节及杀伤功能中的作用。方法建立混合淋巴细胞培养(MLC)体系,B16F10-luc-G5细胞作为靶细胞,以总淋巴细胞为效应细胞。(1)调节效应实验以NKT细胞或CD4~+CD25~+T淋巴细胞为调节细胞,分为3组:NKT组、CD4~+CD25~+T组、靶细胞空白对照组;另设有1640空白对照组(RPMI1640溶液)。(2)杀伤效应实验以NKT或自然杀伤(NK)细胞为效应细胞,分为3组:NKT组、NK组、靶细胞空白对照组。混合培养24、48、72h后,通过活体成像系统检测该培养系统的靶细胞生物发光,以监测NKT细胞的调节及杀伤效应。结果 (1)调节效应实验:NKT组及CD4~+CD25~+T组测定光子数分别与两空白对照组比较,以及NKT组内培养24h与72h时测得光子数比较,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)杀伤效应实验:NKT组及NK组与靶细胞空白对照组所测光子数比较,差异均有统计学意义(P0.05);且培养24、72h时NKT组与NK组光子数比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 NKT细胞具有抑制总淋巴细胞对靶细胞的杀伤效应,且抑制效应具有时间性,其调节作用较CD4~+CD25~+T淋巴细胞强。NKT细胞具有对靶细胞的杀伤效应,但较NK细胞弱。     

乙型肝炎病毒相关性肝硬化患者外周血NK和NKT细胞功能特点及意义

目的 探讨乙型肝炎病毒相关性肝硬化(HBV-LC)患者外周血自然杀伤细胞(NK)和自然杀伤T细胞(NKT)功能相关分子表达特点及意义.方法 收集代偿期HBV-LC患者(HBV-CLC)、失代偿期HBV-LC患者(HBV-DLC)和同期体检健康者(HC)各25例作为研究对象.流式细胞术检测各组外周血NK和NKT细胞比例、...     

分娩发动前后体内NK细胞、NKT细胞表型分析

目的研究分娩发动前后蜕膜及外周血中NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况,探讨其在产程发动中的作用。方法选取正常孕足月孕妇分为分娩发动经阴道分娩组（以下简称分娩组20例）和分娩未发动行选择性剖宫产术组（以下简称剖宫产组20例）,分离蜕膜及外周血中单个核细胞后采用流式细胞学技术分别检测CD56＋细胞、NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体的表达情况。结果外周血单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋细胞构成下降、CD56＋NKG2D＋细胞构成增加,NK细胞、NKT细胞表面NKG2D表达上升。蜕膜单个核细胞中分娩组CD56＋NKG2A＋和CD56＋NKG2D＋细胞构成及NK细胞表面NKG2A和NKG2D表达均下降,NKT细胞表面NKG2A和NKG2D表达无显著差异。结论临产前体内NK细胞、NKT细胞表面NKG2A和NKG2D受体表达的变化可能在在产程的发动中起着重要作用。     

CIK治疗前后肿瘤患者外周血CD4~＋ CD25~＋调节型T细胞变化研究

目的探讨细胞因子诱导的杀伤（Cytokine-induced killer cells,CIK）细胞治疗后肿瘤患者的免疫功能改变。方法采用流式细胞术检测28例肿瘤患者经CIK细胞治疗前后外周血CD4＋CD25＋T细胞比例。结果肿瘤患者CD4＋CD25＋T细胞比例明显高于对照组（P〈0.05）。经CIK细胞治疗后,CD4＋CD25＋T细胞比例降低,与治疗前比较有统计学意义（P〈0.05）,但治疗后CD4＋CD25＋T细胞比例仍高于对照组,且差异有统计学意义（P〈0.05）。结论肿瘤患者免疫功能处于抑制状态,CIK细胞治疗能在一定程度上提高患者机体的免疫功能。利用流式细胞术监测患者外周血CD4＋CD25＋T细胞的变化,对于评价疗效与判断预后具有一定的价值。     

不同细胞因子组合对脐血造血干细胞体外扩增效果分析

目的观察不同细胞因子组合对脐血干细胞体外扩增效果的影响。方法用含15%胎牛血清的改良细胞培养液,按加入的不同细胞因子组合分成7个实验组(A—G)进行细胞培养。分别于培养0d、3d、7d、14d取培养液,台盼蓝染色计数单个核细胞的总数、流式细胞仪分析CD34+细胞含量。结果与对照组相比,含细胞因子的7个实验组单个核细胞的数量均显著增加,除F组在培养d14时扩增达到峰值(15.60±10.90)×109/L外,其它各实验组在扩增d7时,均达到了扩增峰值并以E组为最高(17.11±6.12)×109/L,培养延续到d14时,各组均有不同程度的下降。所有实验组CD34+细胞的百分比也显著提高,A、D、E、F、G组均在d7达到了峰值,B、C组则在第14d达到峰值。经计算,扩增7d时CD34+细胞单位体积含量范围在(34.7±10.4)×107/L(A组)—(168.6±43.5)×107/L(这种表述似乎不太合适),对应的扩增达10—50倍。结论不同细胞因子组合可以提高脐血单个核细胞和CD34+细胞的扩增效率,SCF+IL-3,-6,-2,-4的组合在d7时达到了最佳的扩增。     

细胞因子体外诱导脐血CD34+细胞增殖并向巨核细胞/血小板分化的研究

本研究旨在观察几种不同细胞因子组合通过体外培养以诱导造血干/祖细胞增殖和向巨核细胞/血小板分化.应用无血清培养基(StemSpan SFEM)体外扩增脐血CD34+细胞并向巨核细胞/血小板定向分化,将不同细胞因子组合分为3个阶段培养,并比较其培养效果.结果表明,在第一阶段的第14天时,SCF + TPO + FL + ...     

CD1d-restricted Recognition of Synthetic Glycolipid Antigens by Human Natural Killer T Cells

A conserved subset of mature circulating T cells in humans expresses an invariant Vα24-JαQ T cell receptor (TCR)-α chain rearrangement and several natural killer (NK) locus–encoded C-type lectins. These human T cells appear to be precise homologues of the subset of NK1.1⁺ TCR-α/β⁺ T cells, often referred to as NK T cells, which was initially identified in mice. Here we show that human NK T cell clones are strongly and specifically activated by the same synthetic glycolipid antigens as have been shown recently to stimulate murine NK T cells. Responses of human NK T cells to these synthetic glycolipids, consisting of certain α-anomeric sugars conjugated to an acylated phytosphingosine base, required presentation by antigen-presenting cells expressing the major histocompatibility complex class I–like CD1d protein. Presentation of synthetic glycolipid antigens to human NK T cells required internalization of the glycolipids by the antigen-presenting cell and normal endosomal targeting of CD1d. Recognition of these compounds by human NK T cells triggered proliferation, cytokine release, and cytotoxic activity. These results demonstrate a striking parallel in the specificity of NK T cells in humans and mice, thus providing further insight into the potential mechanisms of immune recognition by NK T cells and the immunological function of this unique T cell subset.     

CD4+T细胞细胞因子测定及在SLE治疗中的意义

目的　研究外周血CD4+ T细胞细胞因子测定对SLE患者治疗及疗效监测的意义。方法　 37例SLE患者和15例对照组应用流式细胞仪测定外周血IFN γ、IL 2和IL 4在CD4+ T细胞内的分泌。结果　活动期SLE患者IFN γ和IL 2在CD4+ T细胞的表达率较正常对照组显著降低 (P <0 .0 1) ,IL 4在CD4+ T细胞的表达率与对照组比较无明显差异 (P >0 .0 5 )。静止期SLE患者IFN γ、IL 2和IL 4在CD4+ T细胞的表达率与对照组比较无明显改变 (P >0 .0 5 )。IFN γ和IL 2降低的SLE患者发病年龄小 ,病情较重。结论　CD4+ T细胞细胞因子的测定可用于指导SLE患者的治疗及疗效监测。