Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

日本血吸虫(中国大陆株)成虫表达序列标签的获取及新基因的发现

目的运用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)技术快速、经济地发现日本血吸虫(中国大陆株)新基因.方法随机挑取日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析.结果本研究共随机挑取日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA 文库单个重组克隆200个,获得了76个有EST价值的序列,其中7.9%为日本血吸虫已知序列,5.3%为日本血吸虫同源序列.曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的22.4%,未知序列占59.2% .在获得的76个有EST价值的序列中,66个成功在GenBank dbEST中登录.通过同源性分析,发现了一些令人感兴趣的基因.结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫(中国大陆株)成虫新基因.     

日本血吸虫（中国大陆株）成虫表达序列标签的获取及新基因的发现

运用表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST）技术快速、经济地发现日本血吸虫（中国大陆株）新基因。方法 随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆进行部分测序以获得EST,获得的EST通过BLAST程序同EMBL寄生虫数据库和GenBank数据库进行比较及同源性分析。结果 本研究共随机挑取日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库单个重组克隆200个,获得了76个有EST价值的序列,其中7.9%为日本血吸虫已知序列,5.3%为日本血吸虫同源序列。曼氏血吸虫或其他生物的同源序列占有EST价值的序列的22.4%,未知序列占59.2%。在获得的76个有EST价值的序列中,66个成功在GenBank dbEST中登录。通过同源性分析,发现了一些令人感兴趣的基因。结论 EST方法有助于快速、经济地发现日本血吸虫（中国大陆株）成虫新基因。     

日本血吸虫149个表达序列标签和18个全长cDNA的获取和分析

目的从日本血吸虫成虫cDNA文库中分离、鉴定和分析表达基因序列，为日本血吸虫病的防治提供侯选疫苗和药物靶点。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，将获取的表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）登录GenBank；对某些感兴趣的序列进行步移法测序获取全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果随机挑取382 个阳性克隆进行测序，获得149个EST，同源性比较发现，部分序列与血吸虫的生活史的不同阶段和不同性别序列有一定的同源性。共获取18个日本血吸虫全长cDNA，大部分为管家基因，其中部分可作为日本血吸虫的候选疫苗分析和药物靶点。结论EST技术有助于快速、经济地获取日本血吸虫表达序列。     

日本血吸虫(大陆株)卵壳蛋白编码基因的克隆和序列测定

目的：克隆和鉴定日本血吸虫虫卵卵壳蛋白（SjEP）编码基因，以寻找血吸虫新的候选疫苗和诊断分子。方法：设计合成引物，分别以日本血吸虫雌、雄成虫cDNA第一链为模板，用PCR法从中扩增出SjEP基因编码序列，将其克隆入pGEM-T载体，用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果：PCR法从雌虫cDNA中扩增出大小为624bp SjEP基因编码序列，重组质粒pGEM-SjEP经双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增，均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段，序列测定结果表明具有一个长度为624bp的完整开放阅读框，与日本血吸虫（菲律宾株）虫卵卵壳蛋白核苷酸序列有高度同源性（99．9％）。结论：本实验成功地克隆了SjEP编码基因，并进行了序列测定，为进一步研究提供了条件。     

日本血吸虫Mago nashi基因的表达及其抗体的制备

目的 获得日本血吸虫Mago nashi(SjMago)基因的原核表达蛋白并制备多克隆抗体.方法 以童虫cDNA文库为模板,PCR方法扩增该基因,将其亚克隆人原核表达载体pET28a(+)中,IPTG诱导表达重组蛋白,用含重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用Western blot和ELISA法鉴定抗体的特异性和效价.结果 成功重组SjMago基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达相对分子质量约17×103的目的蛋白,免疫家兔获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价为1∶40 960,Westernblot证实有特异性目的蛋白条带存在.结论 成功获得了原核表达的SjMago基因,制备出特异性的多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础.     

日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA文库的构建及初步筛选

目的建立日本血吸虫童虫信号序列捕捉cDNA(SST-cDNA)文库,筛选日本血吸虫病潜在的疫苗候选分子。方法抽提日本血吸虫童虫mRNA,并转录合成cDNA。将纯化的cDNA插入到载体pAPtag2中,构建SST-cDNA文库。将cDNA文库质粒转染到COS7细胞中进行蛋白表达,通过检测转染细胞中胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的活性来判定插入的血吸虫童虫cDNA片段中是否带有信号序列。测定阳性克隆中外源性cDNA的核苷酸序,并通过Blast与Gen-Bank、EST数据库进行比对确定其性质。采用快速扩增cDNA未端序列方法获得基因的全长cDNA序列。用SignalP3.0、TMPred、TargetP服务器对带有信号序列基因的特征进行分析和预测。结果日本血吸虫童虫cDNA被插入到真核表达载体pAPtag2中,成功构建日本血吸虫童虫SST-cDNA文库。限制性内切酶分析表明SST-cDNA文库的容量为5×106cfu。SST-cDNA文库质粒转染到COS7细胞中后,通过近缘筛选获得21个带有信号肽cDNA序列,其中4个为未知新基因序列,5个为已知功能基因,12个与血吸虫EST序列同源。获得了8个基因的全长cDNA序列,演绎氨基酸序列特征分析表明,其中5个为膜结合蛋白基因,3个为外分泌蛋白基因。结论本研究成功构建了日本血吸虫童虫SST-cDNA文库,初步筛选获得了8个带信号肽的外分泌或膜结合蛋白分子基因。     

日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的克隆及序列分析

目的　识别和克隆日本血吸虫新基因。方法　对本实验室获得的EST进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用锚着PCR法从cDNA文库中扩增出新基因全长cDNA ,并将其克隆入原核表达载体 pGEX - 4T - 1,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能的分析。结果　EST同源性分析得到一个完整编码基因 ,开放阅读框(ORF) 4 95bp ,编码 16 4个氨基酸 ;锚着PCR法获得另一EST的 3’端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其ORF 999bp ,编码 332个氨基酸。利用生物信息学技术确定它们分别为日本血吸虫亲环素A(CyPA)和乳酸脱氢酶 (LDH)的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定证明日本血吸虫CyPA和LDH原核表达质粒构建成功。 结论　克隆到日本血吸虫亲环素A和乳酸脱氢酶编码基因的全长cDNA ,为进一步的功能研究打下了基础     

日本血吸虫Mago nashi基因RNA干扰系统的构建及鉴定

目的构建针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体。方法设计及化学合成日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的短发夹结构的寡核苷酸,通过退火成双链DNA片段,将其与经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPER质粒连接,构建表达shRNA的重组质粒。结果经酶切及测序证实针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体pSUPER构建成功。结论成功构建针对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因的RNA干扰的表达载体,为进一步研究对日本血吸虫Mago nashi样蛋白基因RNA干扰作用及该基因功能奠定基础。     

日本血吸虫肌动蛋白轻链基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因,为寻找日本血吸虫新的候选疫苗奠定基础。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pcgene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果发现xzw00081克隆的cDNA序列为日本血吸虫新基因并获得GenBank登录号(AY225851)。该cDNA序列与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,核苷酸水平的同源性为84%;氨基酸水平的同源性为86%;编码蛋白的理论相对分子质量为1053888,等电点为696;抗原表位可能位于氨基酸序列158～184处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因长374bp,编码88个氨基酸,与曼氏血吸虫肌动蛋白轻链基因高度同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫鸟氨酸转氨酶基因的获得和分析

目的运用表达序列标签(expressedsequencetag,EST)技术,从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选和鉴定日本血吸虫新基因鸟氨酸转氨酶。方法转化日本血吸虫成虫cDNA文库,随机挑取重组阳性克隆进行测序,获得EST;用NCBI站点的GenBank对所获得的新基因序列进行同源性检索;利用BLAST程序对同源性高的基因进行核苷酸和氨基酸水平的同源性比较;并利用pc-gene软件对其蛋白质结构进行初步分析。结果获得了1个日本血吸虫新基因鸟氨酸转氨酶基因(GenBank登录号AY336497)。该cDNA序列长1677bp,编码424个氨基酸,与Xenopuslaevis鸟氨酸转氨酶同源性为66%;编码蛋白的理论等电点为8.52;抗原表位可能位于cDNA序列795～846处。结论用EST寻找日本血吸虫新基因是一种可行的方法,所筛选到的日本血吸虫新基因与Xenopuslaevis鸟氨酸转氨酶基因同源,为进一步研究该基因的全序列及功能作准备。     

日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因的发现

目的 运用表达序列标签（EST）技术,从日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj)cDNA文库中分离、鉴定出有潜在应用价值的血吸虫基因序列。方法 应用EST方法,从日本血吸虫cDNA文库中随机挑选出单个重组克隆,PCR扩增出插入片段,并进行PCR产物直接测序;将获得的序列资料与EBI和GenBank进行BLASTn和BLASTx同源性检索,对可能的酶类基因序列进行分析。结论 采用EST策略,可获得日本血吸虫（中国大陆株）若干酶类基因序列EST,为进一步的cDNA全长坟和克隆奠定基础。     

日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶的重组表达及其在血吸虫生活史各阶段的表达分析

目的 目的 在大肠杆菌中原核表达、 纯化日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶 （rSjFBPA）, 观察其在血吸虫生活史各阶段 的表达。方法 方法 以日本血吸虫成虫cDNA为模板扩增rSjFBPA基因, 克隆至pET28a （+） 质粒后, 再转化入E. coli BL21。 含重组质粒的菌株经IPTG诱导后, 采用SDS?PAGE和Western blotting分析鉴定重组蛋白rSjFBPA是否表达, 用层析法纯 化rSjFBPA并用SDS?PAGE鉴定其纯度。同时, 用RT?PCR方法分析SjFBPA在血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段的表 达情况。结果 结果 经PCR扩增出目的基因, 含目的基因的TA克隆质粒经双酶切和测序鉴定, 证明插入片段与预期目的基 因序列相符。Western blotting结果显示, 表达后的重组蛋白可与His?tag单克隆抗体发生特异性反应。经镍亲和层析法 制备了纯化的重组SjFBPA蛋白, 纯化重组蛋白浓度达4 mg/ml。RT?PCR结果显示, SjFBPA在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成 虫和虫卵阶段均有表达。 结论 结论 SjFBPA基因被成功克隆和表达, 其在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段均有表 达。     

血吸虫磷酸丙糖转移酶基因的克隆及表达

目的　对血吸虫磷酸丙糖转移酶基因进行克隆及原核表达 ,以寻找新的预防日本血吸虫感染的疫苗候选分子。方法　用血吸虫病人阳性混合血清经大肠杆菌预吸收后对日本血吸虫童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,所获阳性克隆测序后 ,送GenBankBLAST进行蛋白质序列同源性比较 ,证实与其它物种的磷酸丙糖转移酶有很高的同源性。将其克隆入 pGEM-T载体质粒 ,再定向亚克隆入pBK -CMV表达质粒载体上经IPTG诱导表达后 ,用SDS -PAGE和Western -blot分析和鉴定表达产物。结果　用PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定均证实TPM基因的重组成功 ,表达产物为 32kD的融合蛋白 ,表达产物可被免疫阳性血清识别。结论　首次成功构建编码日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因表达载体克隆 ,为进一步研究其作为疫苗分子的可能性奠定基础     

日本血吸虫(大陆株)成虫表达序列标签的获取及电子延伸

目的获取日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)新基因。方法从Sj(大陆株)成虫cDNA文库中随机挑选单个重组克隆进行部分测序以获取表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用其提供的BLAST程序和Genebank数据库进行序列比较和同源性分析；建立电子拼接的方法，对所获EST进行电子延伸，并对Sj延伸后序列进行同源性分析。结果在Sj成虫cDNA文库中，随机挑选182个单个重组克隆，获取53个有价值EST序列，并在Genebank中登录，获得53个EST的延伸序列及分析结果。结论Sj表达基因EST测序、同源性分析及EST的电子延伸是获取Sj新基因的有效对策。     

T载体的构建及日本血吸虫肌动蛋白基因PCR产物的快速克隆

目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf ( )经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.     

日本血吸虫10.6 kDa膜蛋白基因的克隆及表达

目的　寻找新的预防日本血吸虫感染疫苗候选分子。　方法　用具保护性的抗血吸虫膜单抗及免疫血清筛选日本血吸虫 c DNA文库 ,PCR扩增 c DNA插入片段 ,A - T连接法将筛选获得的 3个基因片段克隆到p GEM- T载体上 ,自动测序仪测序 ,序列送 BL AST基因服务站进行同源性分析。重新设计引物扩增编号为 B8克隆的开放阅读框碱基序列 ,先将其克隆入 p GEM- T载体质粒 ,再定向亚克隆入 p BK- CMV表达质粒 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE和 Western blotting分析表达产物。　结果　经双酶切及 PCR法均证实基因重组成功。其特异性表达产物约为 10 .6 k Da蛋白抗原。表达产物可被免疫血清及单抗识别。　结论　构建了编码日本血吸虫 10 .6k Da蛋白基因表达克隆。     

编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆、测序及同源性分析

目的筛选日本血吸虫成虫 cDNA 文库,得到基因克隆并测序。方法体外将以阳性克隆为模板的 PCR 产物和 pGEM-T 载体连接,转染大肠杆菌 XL1-blue,经抗生素及生色底物 X-gal 初筛,再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定为重组质粒后,DNA 自动测序仪测序。序列送blast 基因服务站进行同源性分析。结果构建三个含日本血吸虫 cDNA 基因片段的重组子,其中一个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体的基因序列。结论获得编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖基因片段,为分析其作为候选重组疫苗分子的潜能打下基础。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达载体的构建及序列分析

目的 为了进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能，丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因；将Sj16基因定向克隆入pcDNA3，转化感受态DHA5α菌；用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆。以重组pcDNA3－Sj16质粒为模板，用双脱氧链末端终止法测定Sj16基因序列，应用软件辅助分析Sj16序列及进行Sj16与曼氏血吸虫的Sm16同源性比较。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因，重组质粒中含有Sj16基因，成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因真核表达重组质粒pcDNA3－Sj16；Sj16基因开放读码框有354碱基，编码117氨基酸，N端18个氨基酸可能为信号肽序列；Sj16与Sm16有高度同源性，只存在一个氨基酸的差异。结论 成功克隆了Sj16基因的真核表达载体，并测定、分析了Sj16基因序列，为深入研究Sj16的免疫调节功能，丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下基础。     

日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达

目的 克隆和表达日本血吸虫大陆株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)编码基因。方法依据GenBank日本血吸虫HGPRT开放阅读框(ORF)设计一对引物，上游和下游引物分别引入BamH I和Sal I酶切位点。以日本血吸虫大陆株（安徽株，简称Sjc-A）成虫总RNA为模板，反转录PCR (RT-PCR)扩增日本血吸虫大陆株HGPRT(SjcHGPRT)全长编码基因。经双酶切纯化的PCR产物与同样双酶切纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET28a-SjcHGPRT，转化感受态E．coli BL21，并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcHGPRT/E．coli BL21I程菌用IPTG诱导表达，重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot分析。结果 SjcHGPRT编码基因RT-PCR产物约700 bp，构建的pET28a-SjcHGPRT重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小的基因片段，根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与报道的日本血吸虫大陆株（湖南株，简称Sjc-H）及曼氏血吸虫HGPRT分别有99%和83%的同源性。获得的重组蛋白(reSjcHGPRT)经SDS-PAGE和Western blot分析，分子量约30 kDa，并能被抗His-G-HRP抗体、日本血吸虫感染小鼠血清和日本血吸虫病人血清识别。结论 日本血吸虫大陆株(安徽株)HGPRT表达获得成功，并获得了纯化重组蛋白，为开展该分子功能和免疫原性研究奠定了基础。