MRP基因定量RT-PCR内标准DNA模板和RNA模板的构建

目的：构建定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）的内标准ＤＮＡ模板和ＲＮＡ模板，定量检测多药耐药相关蛋白（ＭＲＰ）基因表达的ｍＲＮＡ。方法和结果：利用现有的ＭＲＰ全基因质粒和分子克隆技术经２次克隆将庚型肝炎病毒的一段２３８ｂｐ的核苷酸序列插入ＭＲＰ２９２ｂｐ的目的ｃＤＮＡ片段，构建了插入突变型ＭＲＰｃＤＮＡ重组体作为定量ＰＣＲ的ＤＮＡ竞争模板；再经第３次克隆构建了插入突变型ＭＲＰＲＮＡ重组体，最后经体外转录出５３０ｎｔ的正链ＲＮＡ作为逆转录的ＲＮＡ竞争模板。结论：所建立的ＲＴＰＣＲ技术简便、快速、灵敏，可检出１ｆｇ水平的ｍＲＮＡ量。用ＤＮＡ竞争模板定量检测比用ＲＮＡ竞争模板更简便、经济、可靠。     

羟基脲对βIVS—Ⅱ—654C→T基因表达的影响

为研究羟基脲（ＨＵ）对βＩＢＶ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ基因表达的影响，应用成人红系细胞体外液体培养模型，微量珠蛋白肽链生物合成速率测定和逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）介导的珠蛋白ｍＲＮＡ定量测定技术，研究了βＩＢＶ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ剪接缺陷型β＾＋地中海贫血（地贫）患者的培养红细胞在低浓度（５０μｍｏｌ／Ｌ）ＨＵ作用下珠蛋白基因表达的变化。结果表明，突变基因正常剪接的β珠蛋白ｍＲＮＡ含量升高，伴随     

羟基脲对βIVS－Ⅱ－654C→T基因表达的影响

为研究羟基脲（ＨＵ）对βＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ基因表达的影响，应用成人红系细胞体外液体培养模型，微量珠蛋白肽链生物合成速率测定和逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）介导的珠蛋白ｍＲＮＡ定量测定技术，研究了βＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ剪接缺陷型β＋地中海贫血（地贫）患者的培养红细胞在低浓度（５０μｍｏｌ／Ｌ）ＨＵ作用下珠蛋白基因表达的变化。结果表明，突变基因正常剪接的β珠蛋白ｍＲＮＡ含量升高，伴随红细胞内β珠蛋白肽链合成增加。这一结果不仅与ＨＵ治疗β地贫患者的临床结果一致，而且提示ＨＵ可能具有改善ＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ基因剪接加工的作用，从而对其表达产生影响     

中国人遗传性高铁血红蛋白血症二个家系所见Gytb5R基因Arg^57…

目的：探明遗传性高铁血红蛋白血症ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶（Ｃｙｔｂ５Ｒ）缺陷的分子机制。方法：用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，克隆３个遗传性高铁血红蛋白血症家系Ｃｙｔｂ５Ｒ９２１ｂｐ的ｃＤＮＡ编码序列，并用限制性酶切ＰＣＲ产物分析３个家系的基因组ＤＮＡ。结果：２个家系存在Ａｒｇ＾５７→Ｇｌｎ突变，３个家系均未发现Ｇｌｕ＾２２２→ｇｌｙ突变。结论：Ａｒｇ＾２２２→Ｇｌｎ突变是中国人民     

应用多重等位基因特异性PCR技术对β地中海贫血进行产前诊断

为研究β地中海贫血（β地贫）产前诊断的新途径，应用多重等位基因特异性多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术对１０例有重型β地贫风险的胎儿进行了产前诊断。将相应于－２８Ａ→Ｇ，ＣＤ１７→０，ＣＤ４１－４２（－４ｂｐ），ＣＤ７１－７２（＋Ａ）和ＩＶＳ－Ⅱ－６５４Ｃ→Ｔ等中国人最常见的五种β地贫突变类型的五组扩增引物组合成一个ＰＣＲ体系，以羊水细胞以及父母的ＤＮＡ为模板进行多重等位基因特异性扩增，结果显示：４例胎儿为２种不同突变类型复合杂合子，２例胎儿为一种突变类型的纯合子，３例胎儿为一种突变类型的杂合子，还有１例为正常胎儿。所有产前诊断的结果均与ＰＣＲ／等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交或ＤＮＡ测序结果一致。该方法为β地贫的产前诊断提供了一种简便、快速和可靠的新途径。     

中国人遗传性高铁血红蛋白血症二个家系所见 Cytb5R 基因 Arg~(57)→Gln 突变

目的：探明遗传性高铁血红蛋白血症ＮＡＤＨ－细胞色素ｂ５还原酶（Ｃｙｔｂ５Ｒ）缺陷的分子机制。方法：用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，克隆３个遗传性高铁血红蛋白血症家系Ｃｙｔｂ５Ｒ９２１ｂｐ的ｃＤＮＡ编码序列，并用限制性酶切ＰＣＲ产物分析３个家系的基因组ＤＮＡ。结果：２个家系存在Ａｒｇ５７→Ｇｌｎ突变，３个家系均未发现Ｇｌｕ２２２→Ｇｌｙ突变。结论：Ａｒｇ５７→Ｇｌｎ突变是中国人遗传性高铁血红蛋白血症的致病原因之一。     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

人白细胞介素—10基因探针的制备及应用

本文应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出人ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ６１０ｂｐ基因片段，将此片段插入ｐＵＣ１８质粒中，经电泳检测和序列分析证实，扩增片段和发表序列一致酶切电泳回收纯化片段，地高辛随机引物标记，制备了ｈＩＬ－１０基因探针，应用斑点杂交检测了探针的灵敏度和特异性，结果表明该基因探针具有特异性强，灵敏度高，应用方便等特点，初步用于细胞系及ＥＢ病毒阳性的淋巴瘤组织中ｈＩＬ－１０ｍＲＮＡ表达的检测，所得结果     

RARa／MYL融合mRNA是诊断和监测急性早幼粒细胞白血病的特异标志

应用四条引物（Ｒ５，Ｒ６，Ｄ３，Ｄ４）通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了２０例初治急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）患的ＲＡＲａ／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ。建立的方法可在０．１ｎｇ细胞总ＲＮＡ中检出ＲＡＲａ／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ，相当于在１０＾４～１０＾５个正常细胞中检出一个ＡＰＬ细胞，扩增产物的特异性经Ｋｐｎ Ｉ酶切法确认。１８例患表达Ｂ型融合ｍＲＮＡ（２９０ｂｐ片段），２例表达Ａ型（３１１ｂ     

应用PCR—ASO方法对广东地区非缺失型Hb H病的检测

为筛查广东地区Ｈｂ Ｈ病的基因型，用两对引物多聚酶链反应（ＰＣＲ）选择性扩增α２球蛋白基因外显子Ⅲ３１８ｂｐＤＮＡ片段和３２７ｂｐＤＮＡ片段，从７２例广东籍，经血液学确诊为Ｈｂ Ｈ病的ＤＮＡ标本中筛查出非缺失型Ｈｂ Ｈ病１０例，占Ｈｂ Ｈ病的１３．９％；缺失型Ｈｂ Ｈ病６２例，占Ｈｂ Ｈ病的８６．１％。非缺失型Ｈｂ Ｈ病α２珠蛋白基因外显子Ⅲ３１８ｂｐ ＰＣＲ产物，用两对寡核苷酸探针（Ｈｂ ＣＳ－     

HLA—DR基因反义RNA导入脐血干／祖细胞对HLA—DR抗原表达的影响

目的：探讨组织相容性抗原Ⅱ类（ＭＨＣ－Ⅱ）基因反义ＲＮＡ是否可调控脐血细胞ＭＨＣ－Ⅱ类基因的表达及降低脐血细胞的免疫原性和脐血细胞移植时发生移植物抗宿主反应（ＧＶＨＲ）的程度。方法：应用分子克隆技术构建了含人ＨＬＡ－ＤＲβ基因的逆转录病毒表达载体，经过狭缝杂交、电泳、酶切分析鉴定，获得了ＨＬＡ－ＤＲβ基因反义ＲＮＡ重组体，用ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（脂质体）将重组体导入包装细胞ＰＡ３１７。结果：产重组病毒的细胞ＰＡ３１７的病毒滴度可达１×１０５ｃｆｕ／ｍｌ。用逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）可从转染的脐血干细胞中扩增出ＤＲ－β基因ｃＤＮＡ，说明反义ＲＮＡ重组体目的基因已有效表达。用流式细胞仪测定转染的脐血细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原阳性细胞率为２８％（对照组为４５％），其抑制率为３８．２％。结论：导入脐血干细胞的ＨＬＡ－ＤＲ基因反义ＲＮＡ重组体成功地降低了其ＨＬＡ－ＤＲ抗原的表达程度，为临床上降低脐血移植的ＧＶＨＲ提供了理论依据和实验基础。     

应用逆转录－多聚酶链反应方法检测多发性骨髓瘤患者MDR1的表达

应用逆转录－多聚酶链反应方法检测多发性骨髓瘤患者ＭＤＲ１的表达齐君原武永吉应用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，对１４份正常骨髓标本和１３例多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者的１６份骨髓标本进行了多药耐药基因ＭＤＲ１ｍＲＮＡ检测；对ＭＤＲ１ｍＲＮＡ与Ｍ...     

凝血因子Ⅷ cDNA的克隆及分子裁剪

凝血因子Ⅷ基因的分子克隆是制备重组因子ＦⅧ及进行甲型血友病基因治疗的基础。本研究采用基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，ｍＲＮＡ的逆转录酶／聚合酶链反应扩增以及基因组ＤＮＡ文库的筛选等多种技术，得到了编码Ｆ Ⅷ的合部ｃＤＮＡ片段，并剪接成了可供表达的两种Ｆ ⅧｃＤＮＡ分子：一种包括Ｆ Ⅷ全部编码序列，长７８２８ｂｐ。另一种是缺失编码大部分Ｂ结构域及部分轻链Ｎ端的缺友型，长５３２３ｂｐ。     

应用PCR－ASO方法对广东地区非缺失型HbH病的检测

为筛查广东地区ＨｂＨ病的基因型，用两对引物多聚酶链反应（ＰＣＲ）选择性扩增α２珠蛋白基因外显子Ⅲ３１８ｂｐＤＮＡ片段和３２７ｂｐＤＮＡ片段，从７２例广东籍，经血液学确诊为ＨｂＨ病的ＤＮＡ标本中筛查出非缺失型ＨｂＨ病１０例，占ＨｂＨ病的１３．９％；缺失型ＨｂＨ病６２例，占ＨｂＨ病的８６．１％。非缺失型ＨｂＨ病α２珠蛋白基因外显子Ⅲ３１８ｂｐＰＣＲ产物，用两对寡核苷酸探针（ＨｂＣＳ－正常和Ｈｂ广西－正常）进行斑点杂交，检出ＨｂＣＳ８例，Ｈｂ广西２例。提示广东地区ＨｂＨ病以基因缺失型为主，非缺失型ＨｂＨ病基因突变大多发生在α２基因     

RARα／MYL融合mRNA是诊断和监测急性早幼粒细胞白血病的特异标志

应用四条引物（Ｒ＿５，Ｒ＿６，Ｄ＿３，Ｄ＿４）通过逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测了２０例初治急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）患者的ＲＡＲα／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ。建立的方法可在０．１ｎｇ细胞总ＲＮＡ中检出ＲＡＲα／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ，相当于在１０￣４～１０￣５个正常细胞中检出一个ＡＰＬ细胞，扩增产物的特异性经ＫｐｎＩ酶切法确认。１８例患者表达Ｂ型融合ｍＲＮＡ（２９０ｂｎ片段），２例表达Ａ型（３１１ｂｐ片段）。２例患者在完全缓解（ＣＲ）达４周和１６周时仍可检出融合ｍＲＮＡ。１例患者在ＣＲ期ＲＴ－ＰＣＲ检测持续阳性，４周后；临床复发。４例在ＣＲ期随访９～２９周融合ｍＲＮＡ均阴性。２例急性白血病在维甲酸治疗前拟诊ＡＰＬ，但ＲＴ。ＰＣＲ检测阴性，这２例对维甲酸治疗无效，核型分别是ｔ（８；２１）和正常。我们认为，ＲＡＲα／ＭＹＬ融合ｍＲＮＡ与ＭＹＬ／ＲＡＲα融合ｍＲＮＡ一样，也是诊断和监测ＡＰＬ的一个敏感和特异的标志。     

一种新的NADH-细胞色素b5还原酶基因点突变

目的　为了查明中国人遗传性高铁血红蛋白血症（ＲＣＭ） 患者的ＮＡＤＨ细胞色素ｂ５ 还原酶（ｂ５Ｒ） 基因突变类型,探讨ＲＣＭ 发生的分子机制。方法　从已报道的１ 例ＲＣＭⅠ型患者的外周血白细胞中提取ＲＮＡ,应用逆转录聚合酶链反应法（ＲＴＰＣＲ） 扩增了ｂ５ＲｃＤＮＡ（９２１ ｂｐ）,测定其ｂ５ＲｃＤＮＡ的全部编码序列。结果　ｂ５ＲｃＤＮＡ基因的第２０３ 位密码子存在（ＴＧＣ→ＴＡＣ）Ｃｙｓ→Ｔｙｒ 的错义突变。经基因组ＰＣＲ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ） 分析证实该突变并非ＰＣＲ过程中的错配。结论　Ｃｙｓ２０３ →Ｔｙｒ 是ＲＣＭ 的一种新的基因突变类型     

定量不对称PCR－SSCP检测携带N－ras基因点突变的微量残留白血病细胞

定量不对称ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测携带Ｎ－ｒａｓ基因点突变的微量残留白血病细胞蔡辉国，陈佩贞，张立冬，马双，王立，杨天楹我们采用多聚酶链反应－单链ＤＮＡ构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析检测携带Ｎ－ｒａｓ基因点突变的微量残留白血病细胞（ＭＲＬＣ），其灵敏...     

荧光定量PCR检测外周血中JAR细胞的探讨

目的 建立灵敏可靠的外周血中检出滋养细胞肿瘤细胞的方法，为早期诊断滋养细胞肿瘤的转移奠定实验基础。方法 在已知数量的ＪＡＲ细胞掺入１０ｍｌ外周血中建立肿瘤细胞血行转移实验模型，荧光定量逆转录－聚合酶链反应（ＦＱ－ＲＴ－ＰＣＲ）定量检测ＪＡＲ细胞的β－ｈＣＧ－ｍＲＮＡ。结果 ＦＱ－ＲＴ－ＰＣＲ可检测到相当于１个ＪＡＲ细胞表达的β－ｈＣＧ－ｍＲＮＡ量，但当ＪＡＲ细胞被掺入１０ｍｌ外周血中时，细胞数〉１     

MDM2基因在急性白血病中作用的研究

目的：分析ＭＤＭ２基因ｍＲＮＡ表达增高的原因。方法：用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交、点杂交和逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法研究４１例不同类型急性白血病和两个相关的白血病细胞系ＭＤＭ２基因的扩增和ｍＲＮＡ表达。结果：发现５１．２％的患者ＭＤＭ２基因的ｍＲＮＡ表达水平明显增高，所有患者及两个细胞系均未发现有ＭＤＭ２基因扩增。结论：可能在急性白血病中ｐ５３基因可由于ＭＤＭ２基因ｍＲＮＡ的过度表达而抑制其蛋白的生物活性。ＭＤＭ２基因ｍＲＮＡ表达水平与急性白血病的ＦＡＢ分型以及患者的染色体核型无明显相关性，可能与疾病的预后有关。     

HpaⅡ—PCR检测小儿急性白血病降钙素基因高度甲基化

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）结合ＨｐａⅡ限制性内切酶消化法（ＨｐａⅡ－ＰＣＲ）检测５８例急性白血病（ＡＬ）患儿降钙素（ＣＴ）基因的甲基化状态。病例组待检细胞ＤＮＡ经ＨｐａⅡ消化后，再用两对ＣＴ基因特异性引物作ＰＣＲ扩增，分别产生长度为５６６ｂｐ和１．４ｋｂ特异片段。急性淋巴细胞白血病阳性率７１．４％（２５／３５），急性非淋巴细胞白血病７８．２％（１８／２３）。敏感性达１０－３。证明ＣＴ基因５′高度甲基化是白血病细胞克隆的特异标志。本课题受卫生部、四川省人民医院出国人员基金资助