负载食管癌抗原的DC诱导特异性CTL对食管癌细胞体外杀伤作用观察

目的观察负载食管癌抗原的树突状细胞（DC）活化的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）对食管癌细胞的体外杀伤作用。方法冻融法获取食管癌细胞抗原,联合应用粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导培养外周血DC并负载肿瘤抗原,激活自体T淋巴细胞,制备特异性CTLs。将其加入食管癌细胞中培养48 h,用MTT法检测食管癌细胞裂解率,ELISA法检测γ干扰素（γ-IFN）水平。结果负载食管癌抗原的DC激活的CTLs表现出对食管癌Eca109细胞的特异性杀伤作用,γ-IFN水平为（1 625±37.55）pg/ml;而对A549细胞仅有微弱的杀伤作用,γ-IFN水平为（169.04±13.81）pg/ml。未负载食管癌抗原DC刺激的CTLs对食管癌细胞几无杀伤作用。结论负载食管癌抗原的DC激活的CTLs在体外对食管癌细胞能产生高效而特异性的杀伤作用。     

致敏DC诱导CTL特异性杀伤HL-60细胞的实验研究

目的 :探讨来自外周血单个核细胞的树突状细胞 (DC)负载冻融或弱酸洗脱的HL 6 0多肽抗原 ,体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)对HL 6 0细胞的杀伤作用。方法 :应用GM CSF、TNF α和IL 4自外周血单个核细胞诱导出DC ,使其负载两种HL 6 0多肽抗原 ,致敏同种T淋巴细胞 ,产生CTL。以胃癌细胞系SGC790 1为对照组 ,观察DC∶CTL∶HL 6 0 /SGC 790 1为 1∶10 0∶2 ,CTL对HL 6 0特异性免疫杀伤活性。结果 :弱酸洗涤法或冻融法所提取的抗原多肽致敏DC诱导的CTL对HL 6 0细胞的杀伤率分别为 6 8.2 9%± 11.37%和4 5 .95 %± 8.4 7% ,二者差异有极显著性意义 (P <0 .0 1)。对SGC 790 1细胞的杀伤率分别为 2 4 .6 0 %± 4 .4 0 %和 16 .0 9%± 4 .98% ,二者差异有极显著性意义 (P <0 .0 1)。结论 :相对于冻融HL 6 0细胞抗原多肽 ,DC可更有效地提呈酸洗HL 6 0抗原多肽 ,并通过特异性CTL产生对HL 6 0细胞高效而特异的杀伤作用     

负载酸洗脱食管癌抗原肽的脐血树突状细胞对CTL杀伤活性的影响

分离脐血中的单个核细胞,以酸洗脱食管癌抗原肽负载获得分化成熟树突状细胞（DCs）,检测其对特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的诱导和体外杀伤效应的影响。结果发现,负载食管癌抗原肽的脐血DCs诱导的CTL对酸洗前食管癌细胞株T.Tn的杀伤率显著高于酸洗后组和各对照组（P均〈0．05）,而对无关肿瘤细胞株Hep2无显著杀伤作用。认为负载食管癌抗原肽的脐血DCs体外可诱导CTL产生特异性杀伤效应。     

食管癌TDLN细胞对食管癌裸鼠移植瘤的体内抑瘤作用

目的探讨肿瘤引流区淋巴结细胞对食管癌裸鼠移植瘤的体内杀伤作用,为其临床应用提供依据。方法将30只食管癌移植瘤裸鼠模型随机分为对照组、IL-2组、LAK组、I-TDLN组及G-TDLN组。分别予生理盐水、IL-2、LAK细胞及体外培养的I-TDLN、G-TDLN细胞局部注射干预。分别于干预后1、2、3、4周测定各组肿瘤抑制率;干预后4周测定各组肿瘤细胞凋亡率;观察肿瘤组织病理学变化。结果 TDLN组各时点肿瘤抑制率均明显高于对照组、IL-2组及LAK组,G-TDLN组高于I-TDLN组（P均〈0.05）,各组肿瘤抑制率均逐渐升高,于第3周达高峰;对照组、IL-2组、LAK组、I-TDLN组、G-TDLN组细胞凋亡率依次升高,P均〈0.05。LAK组及TDLN组肿瘤组织均有T淋巴细胞和DC浸润,但TDLN组明显多于LAK组。结论体外培养的食管癌TDLN细胞在体内可抑制食管癌移植瘤生长,其机制为直接杀伤肿瘤细胞并诱导肿瘤细胞凋亡。本研究为食管癌TDLN细胞用于临床食管癌的细胞免疫治疗提供了理论依据。     

树突状细胞致敏的肿瘤疫苗对胰腺癌细胞的杀伤效应

目的:研究胰腺癌细胞冻融物致敏树突状细胞(DC)诱导的细胞毒性T细胞(CTL)对原代培养的自体胰腺癌细胞的杀伤作用．方法:从6例手术切除的胰腺癌组织中分离胰腺癌细胞,反复冻融获得肿瘤抗原;以该肿瘤抗原致敏外周血DC,诱导T细胞转变为CTL;采用Cr51释放法观察CTL对原代培养的自身胰腺癌细胞的杀伤活性,分别以来源于胰腺癌细胞株Pancl的肿瘤抗原致敏DC和未致敏DC刺激的CTL作为抗原对照和阴性对照．结果:实验组CTL对自身细胞的杀伤活性为69．05%±15．79%→88．05%±15．34％,抗原对照组CTL的杀伤活性为43．08％±6．92％→67．30％±8．91％,两组CTL杀伤率均显著高于阴性对照组(P<0．01);而实验组与抗原对照组相比,前者的杀伤活性显著高于后者者(P<0．05)．结论:胰腺癌细胞冻融物致敏的DC疫苗可以诱导T细胞产生高效的针对自体癌细胞的细胞毒效应;新鲜肿瘤组织来源的胰腺癌细胞比传代的Pancl细胞具有更好的抗原性．     

两种不同抗原致敏方式负载DC疫苗对Lovo细胞的体外杀伤作用

目的比较重组痘苗病毒负载人癌胚抗原（CEA）基因转染方式与Lovo细胞裂解物诱导方式对产生DC疫苗的影响。方法分别采用重组痘苗病毒负载CEA基因转染方式及Lovo肿瘤细胞裂解物转染方式转染未成熟DC,诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。体外培养CTL并检测其活性;MTT法检测两组CTL对kovo细胞的杀伤作用。结果两种方式致敏DC均可诱导激活CTL并分泌INF-γ,而重组痘苗病毒转染Dc组CTL诱导率高于细胞裂解物组;重组痘苗病毒转染组诱导的CTL对Lovo细胞的特异性杀伤活性显著高于细胞裂解物组。结论两种不同抗原致敏方式负载DC疫苗均能够诱导高效而特异的CTL杀瘤活性,而使用重组痘苗病毒转染CEA至DCs的方式明显优于肿瘤细胞裂解物的抗原负载方式,为DC疫苗用于结肠癌的免疫治疗奠定基础。     

树突状细胞诱导抗胃癌移植瘤免疫

目的　研究树突状细胞 (DC)体外诱导的抗肿瘤免疫能否抑制裸鼠移植瘤生长并预防其发生。方法　联合应用粒 /巨噬细胞集落刺激因子 (GM -CSF)及白介素 4(IL 4)直接从胃癌患者外周血中培养出DC ;以SGC -790 1细胞的肿瘤抗原粗提物刺激DC使其激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) ;建立裸鼠SGC -790 1细胞移植瘤模型 ;DC诱导的CTL治疗裸鼠SGC -790 1细胞移植瘤 ,观察移植瘤生长 ;DC诱导的CTL预防性治疗裸鼠 ,观察随后接种的SGC -790 1细胞移植瘤发生情况。结果　DC诱导的CTL不仅能抑制裸鼠移植瘤生长并能预防其发生。结论　经肿瘤抗原激活的DC作为一新概念上的抗肿瘤疫苗有可能在治疗肿瘤及预防其术后复发和转移中发挥重要作用。     

不同肝癌细胞抗原致敏树突状细胞体外诱导CTL活性的研究

目的比较不同方法提取的肝癌细胞(SMMC-7721)抗原致敏树突状细胞(Dendritic cell DC)后,对特异性细胞毒性T细胞(CTL)的诱导作用。方法分离脐带血单个核细胞,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增出脐血DC;SMMC-7721细胞经反复冻融,直接超声破碎及热休克处理后再超声破碎细胞三种方法提取肿瘤抗原,然后分别致敏DC,以MTT法检测脐血DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL杀伤活性。结果热休克处理后再超声破碎法提取的抗原致敏DC,能诱导更强的刺激T细胞增殖的能力,并且可以诱导更强的CTL活性。结论加热处理后再超声破碎细胞提取的肿瘤抗原致敏DC,在体外可诱导强大的抗肿瘤免疫保护效应。     

健脾中药诱导人胃癌细胞裸小鼠移植瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究健脾类中药复方四君子汤及以四君子汤等健脾药物为基础结合清热解毒、软坚散结中药组成的复方SRRS对人胃癌细胞裸小鼠移植瘤的抑瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡的关系.方法采用人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠皮下移植瘤模型.实验动物共30只,造模后随机分为3组,每组10只:SRRS方剂组,予240 g/L SRRS煎剂0.5mL/d灌胃;四君子汤组,予160 g/L四君子汤煎剂0.5 mL/d灌胃;对照组,予生理盐水0.5 mL/d灌胃,共40 d.应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)、电镜,结合流式细胞仪分析技术,观察SRRS方剂及四君子汤的抑瘤作用与肿瘤细胞凋亡率及形态学改变.结果四君子汤、SRRS方剂对人胃癌细胞裸小鼠移植瘤抑瘤率分别为34%,47%,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡指数(AI)分别为:16%±3%,13%±3%,与对照组AI:3%±1%比较,显著提高(四君子组P＜0.01;SRRS方剂组P＜0.05,均为t检验);流式细胞分析示四君子汤组凋亡率:11%±6%,SRRS方剂组:12%±6%,均较对照组:7%±1%提高(t检验,P＜0.05);但四君子汤和SRRS方剂组之间的凋亡率TUNEL法和流式细胞分析均无差异.电镜下二中药治疗组见较多凋亡细胞和凋亡小体;对照组凋亡细胞和凋亡小体极少.结论中药四君子汤、SRRS方剂在体内的抑瘤作用与诱导胃癌细胞凋亡有关,其诱导细胞凋亡作用可能主要与健脾药物有泄?诱导肿瘤细胞凋亡可能是健脾药物抗癌作用的机制之一.     

三羟基异黄酮诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的研究

目的探讨三羟基异黄酮诱导人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤凋亡的机制。方法建立人胃癌原代细胞裸鼠移植瘤模型并测定移植瘤的生长曲线;25只Balb/c裸鼠接种胃癌原代细胞悬液生成移植瘤后均分为五组,不同剂量的三羟基异黄酮(0.5、1.0和1.5mg/kg)、生理盐水和DMSO进行瘤旁注射,透射电镜和TUNEL法检测肿瘤组织凋亡情况,免疫组化法和RT-PCR法检测肿瘤组织凋亡相关基因bcl-2和bax的表达情况。结果三羟基异黄酮对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用;透射电镜发现三羟基异黄酮导致移植瘤内大量细胞发生凋亡;TUNEL染色法发现三羟基异黄酮注射组瘤细胞的凋亡指数(28.7%±1.1%、33.4%±1.4%和37.1%±1.0%)明显高于生理盐水和DMSO对照组(P<0.05),而两个对照组(11.8%±0.4%和11.7%±0.4%)之间差异无统计学意义。免疫组化法发现三羟基异黄酮注射组的Bcl-2蛋白阳性细胞率(11.8%±0.9%、5.7%±0.8%和4.0%±0.8%)明显低于两个对照组(P<0.05),而两个对照组(19.5%±0.6%和17.6%±1.4%)之间差异无统计学意义;而Bax蛋白阳性细胞率(20.0%±1.2%、24.7%±0.9%和29.3%±1.6%)明显高于两个对照组(P<0.05),而两个对照组(10.3%±0.4%和10.9%±0.9%)间差异无统计学意义;RT-PCR法发现三羟基异黄酮注射组的bcl-2mRNA条带强度随剂量增大而递减,并明显低于对照组(P<0.05);而baxmRNA条带强度递增,并明显低于对照组(P<0.05),而两对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论三羟基异黄酮对胃癌原代细胞移植瘤有明显的抑制作用,通过下调bcl-2和上调bax的表达而诱导胃癌裸鼠移植瘤细胞发生凋亡,是其抗胃癌作用的机制之一。     

肝癌树突状细胞疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞的效应

肝癌患者体内的树突状细胞(DC)负载肝癌相关抗原，诱导机体产生有效的免疫应答，是肝癌治疗的一条有效途径。     

rmhTNF对人胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型的治疗作用

背景:重组改构人肿瘤坏死因子(rmhTNF)是原型TNF-α的改构体,前期实验显示其对体外培养的人胃癌细胞株具有抑制增殖和诱导凋亡作用。目的:初步研究rmhTNF对人胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型的治疗作用。方法:雄性BALB/c裸鼠皮下接种人胃癌细胞株BGC-823构建移植瘤模型,随机予rmhTNF、TNF-α,5-氟尿嘧啶(阳性对照)和0.9%NaCl溶液(阴性对照)进行干预,观察各组裸鼠一般情况、移植瘤生长情况及其组织病理学改变。结果:建模裸鼠成瘤率为100%。各药物干预组移植瘤生长均明显减慢,其中rmhTNF组生长抑制最为明显,生长曲线较阴性对照组明显下移,抑瘤率显著高于TNF-α组和阳性对照组(83.1%对59.8%和50.1%,P0.01),一般情况与接种前相比无明显改变,移植瘤组织中可见较多凋亡和坏死细胞。结论:BGC-823细胞在BALB/c裸鼠皮下有良好的成瘤性。rmhTNF在体内能直接诱导胃癌细胞凋亡和坏死,对人胃癌细胞株裸鼠移植瘤模型具有治疗作用。     

restin基因转染对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响

目的:探讨restin基因转染对胃癌细胞BGC803裸鼠移植瘤生长抑制作用及对肿瘤血管生成的影响.方法:将重组质粒pEGFP-restin转染BGC-803细胞,以绿色荧光蛋白示踪其对胃癌细胞BGC-803生长的影响:RT-PCR鉴定目的基因的表达:通过裸鼠移植瘤实验比较restin对裸鼠移植瘤的生长抑制作用,免疫组织化学染色方法观察微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果:重组质粒经RT-PCR扩增后在600bp处稳定表达:将pEGFP-restin重质粒转染胃癌细胞BGC-803,荧光显微镜下见转染组细胞发出绿色荧光,肿瘤细胞形态不一;裸鼠移植瘤实验显示,与对照组(空载体组和未转染组)比较,转染组胃癌细胞生长速度缓慢,肿瘤体积小(P＜0.01);空载体组与转染组的抑瘤率分别为3.60%、29.02%:免疫组化显示,转染组肿瘤微血管密度减少(4.25±0.29 vs 9.79±0.94,10.34±1.22,均P＜0.05),转染组VEGF表达降低(12.24 3.45 vs 44.52±9.70,39.76±6.38,均P＜0.05).结论:restin基因转染可抑制裸鼠移植瘤生长,影响肿瘤新生血管形成可能是其抗肿瘤作用之一.     

乙型肝炎病毒变异对其特异性CTL反应的影响

特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）反应是人体清除ＨＢＶ的主要机制，与临床结局密切相关，了解病毒变异对ＣＴＬ反应的影响尤为重要。 １．ＣＴＬ表位区内的变异：ＣＴＬ通过识别ＨＢＶ抗原特异性表位而清除病毒，ＨＢＶ编码的蛋白产物上都有这种表位。表位区内的变异可能引起（１）与ＨＬＡ分子结合的病毒抗原肽“错位变异”，抗原提呈失败；（２）ＣＴＬ不能识别变异的表位；（３）变异性肽配体与ＣＴＬ受体结合，使ＣＴＬ分化信号发生改变而失去对靶抗原的杀伤作用。但ＨＢＶ可表达多种抗原性、且变异绝大多数不在表位区内，个别ＣＴＬ…     

NDV联合负载胃癌细胞抗原DC-CIK对胃癌细胞的杀伤效果及机制

目的探讨新城疫病毒（NDV）联合负载胃癌细胞抗原（Ag）的树突状细胞（DC）及细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对胃癌细胞的杀伤效果及机制。方法用人外周血单个核细胞诱导培养DC及CIK,体外培养人胃癌细胞SGC-7901,反复冻融法制备胃癌细胞Ag悬液冲击致敏DC,CIK与负载胃癌细胞Ag的DC共培养。建立胃癌裸鼠模型,将其随机分为四组各6只。PBS组瘤内注射PBS100μl／只;NDV组瘤内注射NDV0．25ml／只;Ag-DC-CIK组瘤内注射负载抗原的DC诱导的CIK细胞0．2ml／只;NDV＋Ag-DC-CIK组先瘤内注射NDV0．25ml／只,1d后再注射负载抗原的DC诱导的CIK细胞0．2ml／只;各组均隔日注射1次,共3次。14d后测量肿瘤体积,计算抑瘤率。观察肿瘤坏死情况并评分。结果NDV＋AS—DC-CIK组肿瘤平均体积小于NDV组和Ag—DC-CIK组,抑瘤率、肿瘤坏死面积评分高于NDV组和Ag-DC—CIK组;P均〈0．05。结论NDV和负载胃癌细胞Ag的DC-CIK能协同杀伤胃癌细胞,杀伤效果强于二者单用效果;其机制为NDV可增加胃癌细胞的抗原性,为CIK细胞提供更多靶点。     

胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究

目的观察人胰腺癌Mia Pa Ca-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell,DC)体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)的能力。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将Mia Pa Ca-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1m RNA转染DC,以未负载抗原的DC为对照。采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达。四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率变化;混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL细胞因子释放量。结果 Mia Pa Ca-2总RNA与MUC1 m RNA分别转染后48 h DC中目标抗原的相对表达量分别为37.24±3.17和34.53±2.02,两者比较无显著差异(P0.05)。电转染后96 h Mia Pa Ca-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%,低于MUC1 m RNA单转染时DC的存活率(80%左右)(P0.05)。转染Mia Pa Ca-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8 432±611.25,显著高于MUC1单独转染组3 664±305.17(P0.05);且转染Mia Pa Ca-2总RNA DC激发特异性CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ水平亦显著高于MUC1 m RNA单独转染组(P0.05)。结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗原负载DC有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。     

胃肠安对人胃癌细胞SGC-7901原位移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

背景:以健脾类中药为基础的复方胃肠安可抑制人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠皮下移植瘤细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,提高进展期胃癌的3年生存率。目的:通过观察胃肠安对人胃癌细胞裸小鼠原位移植瘤生长和凋亡的影响,探讨其抑制肿瘤的作用机制。方法:以高效液相色谱(HPLC)法监测复方胃肠安制剂的稳定性;采用胃小囊法,予45只雄性BALB/c-nu/nu裸小鼠接种人胃癌细胞SGC-7901移植瘤模型,造模第28天,选出扪及胃部肿块直径为3mm左右的裸小鼠共43只,随机分为胃肠安组(14只)、5-氟尿嘧啶(5-FU)组(14只)和对照组(15只);采用免疫组化SP法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达;采用缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡指数。结果:胃肠安组原位瘤抑制率为40.8%,肝转移率(7.7%)和总转移率(30.8%)显著低于对照组(50.0%和71.4%)(P<0.05);胃肠安组原位移植瘤PCNA阳性率和总阳性率(51.0%±11.4%和60.4%±13.3%)显著低于对照组(61.6%±11.6%和74.4%±7.9%)(P=0.0287和P=0.0029);胃肠安组细胞凋亡指数(17.3%±8.9%)显著高于对照组(7.8%±3.0%)(P=0.0010)。结论:复方胃肠安可抑制人胃癌细胞裸小鼠原位移植瘤的生长和转移,并可抑制人胃癌细胞原位移植瘤的细胞增殖和诱导凋亡。     

中药安普生对人胃癌SGC—7901细胞裸鼠移植瘤的治疗研究

将已接种了人胃癌ＳＧＣ－７９０１细胞的裸鼠随机分为４组，分别局部注射生理盐水、安普生、５－Ｆｕ、华蟾素后进行肿瘤生长抑制率、光镜组织学及电镜超微结构观察。结果表明，安普生组的瘤体积呈动态小趋势，肿瘤细胞坏死明显，抑瘤效果明显优于其他组；且未见任何毒副作用。为临床治疗胃癌提供了理论依据。     

DC、CIK白体回输对化疗后胃癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞的影响

目的研究树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）自体回输对化疗后胃癌患者T淋巴细胞亚群及NK细胞的影响。方法将92例胃癌患者随机分为观察组及对照组各46例,两组均行常规化疗,观察组于化疗结束后1个月实施DC、CIK自体回输治疗,治疗时间〉2个疗程。采集两组化疗前后及观察组DC和CIK自体回输之后4周的外周血,以流式细胞仪对外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞进行检测。结果两组化疗后CD;、CD4＋、CD4＋／cDf、NK水平均明显降低,观察组DC与CIK回输后CD^＋3、CD^＋4、CD^＋4／co^＋8、NK水平明显高于本组及对照组化疗后,P均〈0．05。结论化疗后胃癌患者DC、CIK白体回输后CD^＋3、CD4^＋4、CD^＋4／CD^＋8、NK水平升高,即细胞免疫功能得到改善。