用双水相体系萃取青霉素酰化酶的研究

本文首先研究了大肠杆菌青霉素酰化酶生产菌AS1.76的细胞破碎过程,用冻融法通过四次处理,青霉素酰化酶的释放率可达77％,通过实验重新确定了NIPAB法中Na_2CO_3的用量。 本文研究了用PEG4000/磷酸盐体系提取细胞破碎液中的青霉素酰化酶,通过实验确定了最佳体系:PEG4000浓度16％(w/w),磷酸盐浓度14％(w/w),一步萃取收率在90％以上,纯化因子311,为工业上采用双水相萃取青霉素酰化酶提供了一条新途径。     

青霉素酰化酶溶液浓度对活力测定的影响

青霉素酰化酶是经巨大芽孢杆菌发酵产生于发酵液中,经离心除菌丝,再用硅藻土或氧化铝吸附后,硫酸铵洗,铵洗脱,超滤浓缩至发酵液浓度的80至100倍以上。得到可用     

青霉素酰化酶基因组大肠杆菌在两水相体系中转化反应

以青霉素酰化酶基因重组大肠杆菌Ａ５６（ｐＰＡ２２），经戊二醛交联（防止细胞自溶）后，在ＰＥＧ２００００－ＤｅｘｔｒａｎＴ７０两水相体系中进行转化反应，生产６－氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ）。实现含酰菌体在两水相体系中的单侧分配。考察了菌体中量对青霉素转化率的影响。在两水相体系中进行５批半连续转化反应，底物浓度为７％，转化率在９０％以上，反应时间为４０分钟，比生产速率为３．６～４．６μｍｏｌ／ｍｌ．ｍｉ     

青霉素酰化酶研究进展

青霉素酰化酶除了在医药工业上用于大规模生产β－内酰胺类抗生素中间体和半合成β－内酰胺类抗生素之外,还有其它的一些潜在应用;对青霉素酰化酶的研究一直吸引着各国科研人员的兴趣,近年来,用一些经典的和现代的技术手段,对青霉素酰化酶产生菌进行改良,通过理化诱变,使酶活力提高;通过定点突和化学修饰,将酶活性中心的丝氨酸变成半胱氨酸或含硒原子的半胱氨酸,使酶的合成活力相对于水解活力大幅提高,通过基因工程技术提高酶的表达水平,促进分泌或改进生产菌的缺陷,出现了介孔分子筛,二甘醇二甲基酯丙烯酸酯接枝尼龙共聚物等新的;固定化材料及酶膜反应器,多室固定化酶反应器,有望用于工业化生产。ββ     

青霉素酰化酶电极

用海藻酸钠-氯化钙包埋法制备青霉素酰化酶电极,电极涂液中海藻酸钠浓度为1％,酶量大于15U/100mg较好。经聚乙烯亚胺处理的电极的抗磷酸盐性能良好,测试在pH 7.05缓冲液中进行,加样搅拌平衡后,取停止搅拌5min后的pH读数,△pH-青霉素G浓度的线性范围为0～1.88mg/ml。温度和pH对pH响应值均有影响。     

固定化酰化酶在青霉素裂解反应中的影响因素分析

在酶促脱酰法裂解青霉素工业钾盐生产药用中间体6-氨基青霉烷酸(即6-APA)的反应杌理中,在不同反应物浓度、pH及温度下将直接影响酰化酶的活性及其使用寿命。本文通过多组实验进行比较分析摸索出酰化酶的最适宜的工艺条件以达到延长酰化酶的使用寿命,降低6-APA的生产成本的目的。     

青霉素酰化酶提取及其与固定化酶的动力学参数测定和比较

采用冻融-溶媒法从大肠杆菌中提取青霉素酰化酶(经硫酸铵沉淀、透析、冷冻干燥),制得酶粉,活力为1100.37u/g,经六批提取试验,平均提取收率47.93％。分别测定游离酶及其固定化酶米氏常数Km值。游离酶的Km值为2.39mM,固定化酶按其颗粒大小不同,Km值分别为5.62、8.46、8.42mM。 在对pH稳定性测定中,游离酶最适pH为7～8,而固定化后在pH5～9之间都较稳定。对温度的稳定性测定中,游离酶与固定化酶在40℃以下都较稳定,但在45℃保温一小时后,游离酶只存留活力39.51％,而固定化酶却存留活力86.92％,二者有显著差异、温度再高相差更大。因此酶经固定化后,对pH和温度的稳定性都有明显提高。金属离子对青霉素酰化酶的活力有所影响。特别是铁离子和铜离子影响较大,故酶反应容器不能采用铁和铜的材料。     

青霉素G酰化酶的亚基重组

青霉素G酰化酶在半合成β-内酰胺类抗生素工业中催化关键反应。将来源于Esherichia coli的α亚基分别与Kluyvera citrophila,Providencia rettgeri,Alcaligenes faecalis的β亚基重组得到三种杂合酶,杂合酶表达量随野生型PGA同源性的减小而降低,E.coli和A.faecalis氨基酸序列的相同性低至41%,其杂合酶仍然具有水解3-苯乙酰胺-6-硝基苯甲酸的活力。     

用CHITOSAN固定化青霉素酰化酶

本文报道以Chitosan为载体制备固定化青霉素酰化酶的研究结果。1.4％ Chitosan醋酸溶液先用12.5％戊二醛交联,洗涤,研磨,得颗粒。再用1.5％pH5.5和1.5％pH8.5多聚磷酸处理,得机械强度良好的载体。此载体先后经0.5％戊二醛和对甲苯磺酰氯双活化后,再与青霉素酰化酶偶联。所得固定化酶的活力达20.8u/g。固定化青霉素酰化酶的反应最适温度略高于游离酶,最适pH略低于游离酶;其Km值基本接近游离酶。固定化酶经反复使用,活力基本不变。     

青霉素酰化酶提取工艺的改进

青霉素酰化霉是由巨大芽孢杆菌经二级发酵，在生产过程中分泌到细胞体外的一种胞外酶。在工业生产中，我们对发酵液中酶的吸附和洗脱工艺进行改进，收到了明显的效果。     

固相青霉素酰化酶稳定性考察

眯了增加固相酶的稳定性，延长固相酶的使用寿命，增加固相酶裂解钾盐的批数，我们对固相酶的稳定 做了多方面考察，了解到固相酶适应的最佳环境，如裂解罐及管线无菌，裂解的ＰＨ温度，酶的清洗消毒方式以及生产暂停时酶的处理方法和酶的更换方法等。     

利用无机载体固定化青霉素酰化酶的研究

以无机材料６２０１型担体作载体,进行青霉素酰化酶固定化的研究。考察了ＡＰＴＳ和戊二醛浓度、给酶量以ｐＨ等因素对固定化酶酶活的影响。结果表明,以６２０１型担体为载体制备得到的固定化酶具有较高的酶活回收,达４２．８％;操作稳定性良好;用其连续水解３０批青霉素Ｇ的钾盐溶液,酶活未见明显下降;该固定化酶与游离酶相比,可在较宽的ｐＨ范围保持高酶活。     

固定化青霉素酰化酶反应器研究进展

介绍固定化青霉素酰化酶反应器的研究现状，将这类反应器分为搅拌釜反应器、柱式填充床反应器、中空纤维膜反应器以及电渗析耦合反应器，从工程角度分析了各类反应器的优缺点，并展望其今后的发展趋势。     

青霉素酰化酶的分离和纯化

采用渗透法冲击法提取大肠杆菌E.coli108青霉素酰化酶，得到了高比活的粗酶液，收率为93．3％，经硫酸铵分级沉淀、DEAE－Cellulose－52离子交换柱层析不得到了聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条单带的酶，酶液比活为28．09u/mg，提纯了5．32倍，纯酶总收率为36．5％。     

溶解氧浓度和补加苯乙酸对大肠杆菌工程菌青霉素酰化酶合成的影响

用2升全自动发酵罐观察大肠杆菌工程菌Ec108(pPAHD1)青霉素酰化酶(Penicillin-G-acylase)基因的表达,发现溶解氧浓度对生物量的扩增和基因产物的积累有显著的影响。对数前期扩增生物量时需要相对高的溶解氧,以不低于相对饱和度80％为宜;而产酶阶段则要求相对低的溶解氧环境,可保持相对饱和度5％。按溶解氧峰形变化特征,指导补加苯乙酸的时机;以尖峰出现的间距,决定补加剂量,采用每次补加0.03～0.05％为佳。在罐压0.3kg/cm2,通气比1:0.5及恒温条件下,借助上述手段,最高酶活水平已达342u/100ml(NIPAB法),比摇瓶发酵酶活提高1.8倍。     

基因工程菌株产生的青霉素酰化酶的纯化及其性质

以构建的青霉素酰化酶基因工程菌(E.Coli 108/PPAHD 1)为材料,经硫酸铵沉淀、离子交换和制备电泳等手段将青霉素酰化酶的纯度提高了155倍,比活达17 u/mg,其凝胶电泳呈现单带。该酶有两个亚基,分子量分别为62300 d 和14900 d。并测定了该酶对温度及 pH 稳定范围、米氏常数等电点。     

用脱乙酰几丁质制备固定化青霉素酰化酶

以青霉素酰化酶基因工程菌为酶源,选用脱乙酰几丁质为载体,试用了4种固定化方法,从4个方面(pH、温度、盐浓度和结合酶量)摸索了固定化条件。结果在适宜条件下获得比活900U/g(干)(NIPAB法)的固定化青霉素酰化酶,回收率可达56%。并测定其酶学性质。     

青霉素酰化酶:固定化及其应用

青霉素酰化酶广泛应用于β-内酰胺类抗生素中间体和半合成β-内酰胺类抗生素的合成。虽然游离酶具有极高的催化活性,但其对温度、pH值、溶剂极性等的耐受范围极窄,极易失活,而且在有机溶剂中发生的失活是不可逆的。为了提高其各方面稳定性,不断有新的固定化方法提出。本文综述了青霉素酰化酶的固定化方法及其应用。     

吸附法纯化青霉素酰化酶

目的纯化发酵液中的青霉素酰化酶。方法采用吸附纯化法。结果按 1 2 % (W /V)的比例将皂土加到含青霉素酰化酶的发酵上清液中 ,可将 98%的酶吸附 ,而同时吸附的杂蛋白质仅占发酵上清液总蛋白质的 14 5 %左右。吸附过程受pH影响较大 ,在 pH 6 5～ 7 5时 ,吸附效果最佳。使用不同种类的缓冲液洗涤酶 -皂土复合物 ,发现缓冲液的种类对酶的洗涤影响不大。使用含5 0 %以上的PEG和 8 0 %的NaCl的磷酸缓冲液可以将酶全部洗脱。结论此法可在常温下操作 ,酶活力收率较高 ,具有潜在的工业应用价值     

使用复合化学方法改进大肠杆菌细胞中青霉素酰化酶的提取

青霉素酰化酶是一种能转化天然青霉素的酶.它水解苯乙酸和一些密切相关的芳香脂肪酸的酰胺.在适当条件下,它还能催化6-氨基青霉烷酸生成半合成青霉素.虽然青霉素酰化酶广泛存在于细菌和真菌中,但人们为达到较高的生产水平已构建重组菌株,本文涉及的就是由Genetica开发的重组大肠杆菌菌株G271.