重组人骨形态发生蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定*

背景：目前报道的重组腺病毒构建方法较复杂,构建周期长,导致重组腺病毒构建的成功率较低。GatewayTM技术是基于λ噬菌体的位点特异性高效重组系统,其构建重组病毒载体具有快捷高效的特点。 目的：构建含人骨形态发生蛋白2 基因的重组腺病毒载体,为应用骨形态发生蛋白2 基因治疗的研究奠定基础。 设计、时间及地点：单一样本观察,实验于2008-02/06在深圳市第二人民医院中心实验室完成。 材料：pOTB7-BMP-2 质粒、HEK293为ATTC产品;BLOCK-iTTM Adenovirus Expression System为Invitrogen产品;大肠杆菌DH5α为Biontex产品。 方法：用聚合酶链反应方法扩增骨形态发生蛋白2 目的基因,并插入载体pMD19-T Simple Vector中进行测序分析。将骨形态发生蛋白2 基因亚克隆到穿梭载体pEC3.1(+)中,构建pEC3.1-BMP-2 穿梭质粒,再将其中的表达盒通过重组克隆到pAd/BLOCK-iT™-DEST腺病毒载体中,线性化后转293 细胞进行包装获得重组腺病毒rAd-BMP2。 主要观察指标：①目的基因骨形态发生蛋白2 的聚合酶链反应扩增。②重组质粒TS-BMP2 的构建。③重组pEC3.1-BMP2 的构建。④重组pAd-BMP2 的构建。⑤重组腺病毒的制备与鉴定。 结果：正确扩增长约1.2 kb的骨形态发生蛋白2 cDNA,并成功地构建其腺病毒载体,经线性化的pAd-BMP2 DNA转染HEK293细胞,包装、扩增后得到人骨形态发生蛋白2 重组腺病毒(rAd-BMP2),其滴度约为1×1010 PFU/mL,该滴度可满足进一步的骨形态发生蛋白2 成骨作用的研究。 结论：成功地构建重组人骨形态发生蛋白2 腺病毒载体。     

血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2在激素性股骨头坏死骨缺损中均具有成血管成骨作用,目前国内在以人血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2基因联合治疗激素性股骨头坏死方面少有报道。 目的：构建人血管内皮生长因子121与人骨形态发生蛋白2双基因腺病毒穿梭质粒。 方法：将质粒pShuttle-CMV-VEGF121-IRES-hrGFP-1经Kpn Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后,将BMP2片段定向连入pShuttle-CMV- VEGF121-IRES,构建可同时表达2个目的基因重组质粒pShuttle-CMV-V EGF121-IRES-BMP2,注入H5a细胞扩增,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析及序列测定。将已构建确认正确的腺病毒质粒,经BJ5183-AD-1电转感受态细胞进行电穿孔后,铺板,筛选阳性菌落,提取质粒,进行酶切分析,PCR检测和序列分析。 结果与结论：酶切分析及核酸序列测定证实重组质粒构建正确,提示实验成功构建了血管内皮生长121及骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体。     

重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子联合促进兔骨髓基质细胞血管内皮细胞生长因子表达及其成骨潜能

背景：了解在体外或体内环境下,应用重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,能否达到既加强成骨又促进血管内皮细胞生长因子表达的双重作用。 目的：观察兔骨髓基质细胞经重组人骨形态发生蛋白2与碱性成纤维细胞生长因子刺激后,其血管内皮细胞生长因子表达及成骨潜能的变化。 方法：取兔双侧股骨骨髓基质细胞,采用骨髓基质细胞体外培养技术,单独或联合以重组人骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子刺激细胞。细胞培养5 d后,进行细胞形态、增殖情况、碱性磷酸酶活性、成骨结节、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率等项目的检测。 结果与结论：联合先后应用重组人骨形态发生蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子在细胞计数、碱性磷酸酶活性、矿化面积百分率、血管内皮细胞生长因子阳性细胞率4个检测项目上优于同时应用重组人骨形态发生蛋白2或碱性成纤维细胞生长因子以及单独应用重组人骨形态发生蛋白2或碱性成纤维细胞生长因子。结果表明合理的联合使用重组人骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子,不仅可促进骨髓基质细胞的快速增殖及向成骨细胞转化,还可促进促血管内皮细胞增生的重要介质血管内皮细胞生长因子的表达。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达*◆

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。 目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。 方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及 Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和(或)外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21 d后行矿化(钙)结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。 结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。     

构建人热休克蛋白70基因重组腺病毒载体及鉴定

背景：腺病毒载体作为低毒高效的基因载体已被广泛应用,但是人热休克蛋白70基因腺病毒载体较为少见。 目的：构建重组人热休克蛋白70基因的腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达。 方法：采用AdMax腺病毒系统将外源基因人热休克蛋白70基因重组入腺病毒载体中,转染人胚肾293细胞并重组包装出毒,检测外源基因的表达和病毒滴度。 结果与结论：观察转染后的人胚肾293细胞出现明显细胞病变效应后,收获并纯化重组病毒;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况良好,Western blot检测人热休克蛋白70蛋白表达良好,收获病毒的滴度为1×1011 efu/mL,证明实验已成功构建携带人热休克蛋白70基因的重组腺病毒载体。     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2) 是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。 目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。 设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07/2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。 材料：pcDNA3.1(+)载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。 方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录-聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM-T- hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T- hBMP-2质粒和pcDNA3.1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3.1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP-2的表达。 主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA 反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM-T-hBMP-2 和pcDNA3.1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。 结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1.2 kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3.1- hBMP-2构建正确;该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP-2的构建及鉴定

背景：骨形态发生蛋白等因子及以其为中心构建的支架或载体已经广泛应用于实验研究中，并逐渐应用于临床，然而，治疗效果的示踪方法为实验提出了挑战。增强型绿色荧光蛋白基因的发现和应用解决了这一难题。 目的：构建双顺反子真核表达载体PIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2，检测其表达情况。 方法：利用RT-PCR方法从人骨肉瘤组织中提取人骨形态发生蛋白2基因，使之与PMD18-T载体连接，经酶切回收后，与目的载体pIRES2-增强型绿色荧光蛋白连接。用PCR技术及基因测序鉴定构建结果。然后将构建好的载体转染人胚肾293细胞，通过荧光显微镜及Western blot技术观测其表达。 结果与结论：实验成功扩增了人骨形态发生蛋白2基因并构建了pIRES2-增强型绿色荧光蛋白-人骨形态发生蛋白2载体，将pIRES2-EGFP-hBMP-2用脂质体转染入人胚肾293细胞后48 h，荧光显微镜观察约30%细胞发出绿色荧光，Western blot结果发现在Mr46×106处有一特异性骨形态发生蛋白条带，表明所构建载体中靶基因能成功表达。     

人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒的快速构建及其鉴定

目的 构建人的AWP1与红色荧光蛋白(RFP)融合基因的重组腺病毒载体，为研究AWP1的生物功能提供工具。方法将克隆的AWP1 cDNA插入高效表达RFP的载体pDsRedl-N1的多克隆位点，与RFP序列形成AWP1-RFP融合基因，将该融合基因亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV和pAdShuttle-CMV中：经酶切鉴定正确后Pine I线形化，与骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183以同源重组：用lipofectAMINE将Pac I线形化的同源重组腺病毒载体转染293细胞以包装腺病毒：通过同源重组病毒载体和病毒颗粒基因组的DNA测序及PCR扩增和在293细胞中的表达鉴定重组腺病毒。结果同源重组载体和病毒颗粒的DNA测序和PCR分析显示AWPIcDNA序列正确，感染293细胞获得了AWP1-RFP融合蛋白的高效表达。结论成功构建和包装了人AWP1-RFP融合基因重组腺病毒。     

Brg1调控重组人骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞分化*

背景：Brg1是依赖ATP的染色质改变复合物的核心催化亚基,该亚基在基因的转录调控、复制、重组,骨骼肌的分化、抑制肿瘤的发生等活动中起着重要的作用。 目的：探索Brg1基因在骨形态发生蛋白2诱导成骨细胞分化过程中的调控机制。 方法：采用胶原酶消化法进行小鼠颅骨成骨细胞的原代培养;分别用0,50,200 μg/L的重组人骨形态发生蛋白2诱导原代培养的成骨细胞的分化,摸索骨形态发生蛋白2的最佳作用剂量;实时荧光定量PCR和Western blot进行骨形态发生蛋白2对Brg1的作用时间的动力学分析;实时荧光定量PCR和钙钴染色法检测敲除Brg1对骨形态发生蛋白2诱导的成骨分化的影响;构建Dlx5腺病毒重组表达载体,实时荧光定量PCR和钙钴染色法检测Brg1在骨形态发生蛋白2诱导的成骨分化过程中对Dlx5的调控作用。 结果与结论：用自行合成的重组人骨形态发生蛋白2可诱导原代培养小鼠成骨细胞分化,200 μg/L剂量有着较好的诱导分化效果;重组人骨形态发生蛋白2可诱导Brg1基因转录水平和翻译水平表达水平上调;敲除Brg1可抑制重组人骨形态发生蛋白2诱导的成骨分化;Brg1能够调控Dlx5的表达水平。说明Brg1通过调控Dlx5的表达水平调控重组人骨形态发生蛋白2诱导的小鼠成骨细胞的分化。 2     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达*★

目的：拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体，观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。 方法：通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因，PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因，分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上，构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和 pTrack-CMV-VEGF165，经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165，经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞，收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。 结果：PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒，PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变；荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达，且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强；经多轮感染、扩增后，病毒效价可达（2.0~5.0）×1010 pfu/mL。转染48 h后，293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高（F=427.93，17.93，P < 0.05）。 结论：成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒，血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

神经鞘瘤中NF2基因外显子2突变及意义

目的 :研究神经鞘瘤中 型多发神经纤维瘤病基因 (NF2 )外显子 2的突变及其意义。方法 :用 PCR- SS-CP、 DNA测序检测 36例神经鞘瘤 (听神经瘤 16例 ,其它 2 0例 )中 NF2基因外显子 2的突变。结果 :我们共发现 4例突变 ,均为听神经瘤 ,其中移码突变 2例、反义突变 2例。结论 :NF2基因外显子 2的突变可能是听神经瘤发生中的关键因素。     

Repeat variation in the human PER2 gene as a new genetic marker associated with cocaine addiction and brain dopamine D2 receptor availability

Low dopamine D2 receptor (D2R) levels in the striatum are consistently reported in cocaine abusers; inter-individual variations in the degree of the decrease suggest a modulating effect of genetic makeup on vulnerability to addiction. The PER2 (Period 2) gene belongs to the clock genes family of circadian regulators; circadian oscillations of PER2 expression in the striatum was modulated by dopamine through D2Rs. Aberrant periodicity of PER2 contributes to the incidence and severity of various brain disorders, including drug addiction. Here we report a newly identified variable number tandem repeat (VNTR) polymorphism in the human PER2 gene (VNTR in the third intron). We found significant differences in the VNTR alleles prevalence across ethnic groups so that the major allele (4 repeats (4R)) is over-represented in non-African population (4R homozygosity is 88%), but not in African Americans (homozygosity 51%). We also detected a biased PER2 genotype distribution among healthy controls and cocaine-addicted individuals. In African Americans, the proportion of 4R/three repeat (3R) carriers in healthy controls is much lower than that in cocaine abusers (23% vs 39%, P=0.004), whereas among non-Africans most 3R/4R heterozygotes are healthy controls (10.5% vs 2.5%, P=0.04). Analysis of striatal D2R availability measured with positron emission tomography and [¹¹C]raclopride revealed higher levels of D2R in carriers of 4R/4R genotype (P<0.01). Taken together, these results provide preliminary evidence for the role of the PER2 gene in regulating striatal D2R availability in the human brain and in vulnerability for cocaine addiction.     

小鼠SK2基因亚克隆的构建和鉴定

背景：小电导Ca2+激活钾(small conductance Ca2+-activated potassium channels，SK channels)通道存在于大多数可兴奋性细胞并在动作电位的复极化中发挥着重要作用。但SK通道与Ca2+及其他分子的偶合及调控途径尚未明确。 目的：为观察SK2通道基因区段与Ca2+及其他分子的偶合及调控，构建pGBAT7和SK2基因片段重组子。 方法：根据SK2基因的全长序列，设计3个SK2基因片段引物，经PCR扩增，测序 鉴别后，分别亚克隆到酵母表达质粒pGBKT7。构建的pGBKT7-SK2亚克隆通过电转染法分别转染到酵母AH109菌中并被激活。pGBKT7-SK2亚克隆从酵母AH109菌中提取，电泳和测序鉴定。 结果与结论：SK2目的基因PCR扩增产物分别为411，546，729 bp。成功构建了3个含有411，546，729 bp的pGBKT7-SK2亚克隆，电泳和测序鉴别表明构建的pGBKT7-SK2亚克隆完全符合设计要求。转染到酵母AH109菌中pGBKT7-SK2亚克隆可被激活，为探讨SK2通道与其他分子的功能相关提供了重要的物质基础。     

The course of awake breathing disturbances across the lifespan in Rett syndrome

Rett syndrome (RTT), an X-linked dominant neurodevelopmental disorder caused by mutations in MECP2, is associated with a peculiar breathing disturbance exclusively during wakefulness that is distressing, and can even prompt emergency resuscitation. Through the RTT Natural History Study, we characterized cross sectional and longitudinal characteristics of awake breathing abnormalities in RTT and identified associated clinical features. Participants were recruited from 2006 to 2015, and cumulative lifetime prevalence of breathing dysfunction was determined using the Kaplan-Meier estimator. Risk factors were assessed using logistic regression. Of 1205 participants, 1185 had sufficient data for analysis, including 922 females with classic RTT, 778 of whom were followed longitudinally for up to 9.0?years, for a total of 3944 person-years. Participants with classic or atypical severe RTT were more likely to have breathing dysfunction (nearly 100% over the lifespan) compared to those with atypical mild RTT (60–70%). Remission was common, lasting 1?year on average, with 15% ending the study in terminal remission. Factors associated with higher odds of severe breathing dysfunction included poor gross and fine motor function, frequency of stereotypical hand movements, seizure frequency, prolonged corrected QT interval on EKG, and two quality of life metrics: caregiver concern about physical health and contracting illness. Factors associated with lower prevalence of severe breathing dysfunction included higher body mass index and head circumference Z-scores, advanced age, and severe scoliosis or contractures. Awake breathing dysfunction is common in RTT, more so than seizures, and is associated with function, quality of life and risk for cardiac dysrhythmia.     

Prevalence of the LRRK2 G2019S mutation in a UK community based idiopathic Parkinson's disease cohort

The LRRK2 G2019S mutation is the commonest genetic cause of Parkinson's disease (PD) identified to date, although estimates of its prevalence in idiopathic disease vary considerably. Our objectives were to determine G2019S mutation frequency in an unselected, community based cohort of idiopathic PD cases from the UK and to describe phenotypic characteristics among carriers. The mutation was present in two of 519 cases (0.4%) and none of 887 control individuals. The true prevalence of the mutation in idiopathic disease, its penetrance, and the phenotypic heterogeneity of associated cases have important implications for genetic screening in the clinical field.     

Screening for SNCA and LRRK2 mutations in Greek sporadic and autosomal dominant Parkinson's disease: identification of two novel LRRK2 variants

Mutations in SNCA and LRRK2 genes, encoding alpha-synuclein and leucine-rich repeat kinase 2, respectively, cause autosomal dominant Parkinson's disease (AdPD). The LRRK2 G2019S (c.6055G > A) and R1441G (c.4321C > G) mutations have also been identified in sporadic PD (sPD). We studied 55 unrelated patients with AdPD, 235 patients with sPD, and 235 healthy age- and gender-matched controls all of Greek origin. Patients with AdPD were screened for SNCA and LRRK2 mutations by direct sequencing. SNCA gene dosage analysis was also performed for AdPD using quantitative duplex polymerase chain reaction of genomic DNA. In addition, we investigated the frequency of the LRRK2 G2019S mutation in sPD. We found no missense mutations or multiplications in the SNCA gene. Here we report two novel variants, A211V (c.632C > T) and K544E (c.1630A > G) in LRRK2 gene in two patients with AdPD that was not present in controls. We identified only one patient with sPD (1/235; 0.4%) carrying the G2019S mutation. LRRK2 mutations are present in AdPD and sPD patients of Greek origin.     

Early-onset parkinsonism linked to combined heterozygous mutations in PANK2 and PLA2G6: A case report

Homozygous mutations as well as compound heterozygous mutations in PANK2 or PLA2G6 have been reported to bring about early-onset parkinsonism (EOP). However, EOP caused by joint heterozygous mutations of the two genes is unusual. Here, we report a case of complex heterozygous mutations involving both the PANK2 and PLA2G6 genes in a Chinese woman.     

神经鞘瘤的NF2基因突变分析

目的 分析散发神经鞘瘤发生NF2基因突变及其与临床行为之间的关系。方法 应用PCR－SSCP、DNA测序观察36例神经鞘瘤中发生的NF2基因突变，用Ki-67、PCNA免疫组织化学分析听神经瘤的增殖指数。结果 36例神经鞘瘤中有13个突变，包括缺失、插入所致的移码突变6例，2例无突变，2例反义突变，3例剪接位点改变；其中发生于E2的4例、E4的2例、E6的4例、E13的2例；发生突变的听神经瘤生长指数、增殖指数亦较高。结论 NF2基因突变是神经鞘瘤发生中的常发事件，其与肿瘤的临床行为之间有一定的关系。