聚合酶链反应技术在腓骨肌萎缩症基因诊断中的应用

目的 探讨应用聚合酶链反应（ＰＧＲ）技术建立中国人腓骨肌萎缩症（ＣＭＴ）基因诊断的方法。方法 分别应用ＰＣＲ－双酶切、聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）或ＰＣＲ直接测序等方法对３２个确诊的ＣＭＴ家系进行了ＰＭＰ２２、ＭＰＺ、Ｇx３２等致病基因的突变检测。结果 ２１．９％的ＣＭＴ家系患者有Ｇx３２、ＭＰＺ和ＰＭＰ２基因的突变。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测到１０个家系有异常泳带,经ＰＣＲ测序证实有５个为多态;另５个为与疾病相关的致病的点突变,即４个Ｇx３２和１个ＭＰＺ基因的点突变。PCR-双酶切诊断了２个包含ＰＭＰ２２基因在内的大片段重复突变的ＣＭＴ１Ａ型家系。ＰＣＲ－ＤＧＧＥ仅１个家系患者异常泳带,该结果也可经ＰＣＲ－ＳＳＣＲ方法检出。结论 ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－双酶切可作为Ｇx３２、ＭＰＺ、ＰＭＰ２２基因的点突变和ＣＭＴ１Ａ的大片段重复突变的初筛的方法,而ＰＣＲ－ＤＧＧＥ方法用于Ｇx３２基因的突变检测不理想,点突变应经ＤＮＡ测序证实。     

人胰腺腺癌中抗癌基因P53的突变

用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析及ＤＮＡ直接测序法检测了１６例胰腺腺癌的Ｐ５３基因５－８外显子，结果发现３７．５％有Ｐ５３基因点突变，突变分布于外显子５－８，无特殊突变倾向点。６例有Ｐ５３突变者，５例为１个等位基因突变，另１个等位基因丢失；１例同时含有突变型和隆型等位基因。     

应用聚合酶单链构象多态技术检测葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变

为了探索一种快速，灵敏及准确的检测红细胞葡萄糖６－磷酸脱氢酶基因点突变方法，我们采用单链构象多态技术，对２０例Ｇ６ＰＤ变异型基因外显子２进行分析。发现有４例患者双链ＤＮＡ中有一条链出现泳动变位，明显慢 于正常人及其他患者，用ＰＣＲ直接测表明在ｃＤＮＡ第９５位核苷酸发生碱基置换。结果说明ＳＳＣＰ技术检测点突变具有广泛的应用前景，比现行的突变检测方的行。作者还对ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的优点和所突变的特点进行     

PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

应用聚合酶链单链构象多态技术检测葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变

为了探索一种快速、灵敏及准确的检测红细胞葡萄糖６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）基因点突变方法，我们采用单链构象多态技术（ＳＳＣＰ），对２０例Ｇ６ＰＤ变异型基因外显子２进行分析。发现有４例患者双链ＤＮＡ中有一条链出现泳动变位，明显慢于正常人及其他患者，用ＰＣＲ直接侧序表明在ｃＤＮＡ第９５位核苷酸发生碱基置换（Ｔ→Ｃ）。结果说明ＳＳＣＰ技术检测点突变具有广泛的应用前景，比现行的点突变检测方法简便易行。作者还对ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的优点和所检测突变的特点进行了探讨。     

七例睾丸女性化综合征患者雄激素受体基因突变的研究

探讨睾丸女性化综合征发病的分子机理。运用聚合酶链式反应－单链构象多态性分析结合双链ＤＮＡ循环测序法，对７例ＴＦＭ患者的雄激素受体基因外显子Ｂ－Ｈ进行突变检测。发现３例患者分别在ＡＲ基因外显子Ｅ或Ｇ有错义突变，导致ＡＲ雄激素结合区氨基酸的改变。     

白血病中P16基因突变的检测

用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）、ＤＮＡ直接测序和多重ＰＣＲ法，检测了１８例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ），１例Ｋ５６２细胞株，９例急性粒细胞性白血病（ＡＭＬ），６例急性淋巴细胞性白血病（ＡＬＬ），２例多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者外周血／培养细胞ＤＮＡ中Ｐ１６基因的点突变和基因缺失。用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ共筛查出５例ＣＭＬ中Ｐ１６基因的异常，突变率为２７．８％（５／１８），对其中１例外显子２异常者经测序证实为第１５１密码子ＣＣＣ→ＣＧＣ的转换，导致Ｐｒｏ→Ａｒｇ的错义突变；并检出１例ＭＭ中Ｐ１６基因外显子３的异常；受检的ＡＬＬ，ＡＭＬ，Ｋ５６２细胞株中，未检出突变。各病例中均未检出Ｐ１６基因的缺失。本文探讨了白血病中Ｐ１６基因突变的意义。     

乙型肝炎病毒前C区基因变异的研究

作者应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测ｅ系统阳性的慢件乙型肝炎（乙肝）患者血清乙肝病毒（ＨＢＶ）ＤＮＡ，筛选出乙肝ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）阳性／乙肝ｅ抗体（抗—ＨＢｅ）阴性和ＨＢｅＡｇ阴性／抗—ＨＢｅ阳性各２０份ＰＣＲ阳性血清，分别用人工合成的ＨＢＶ前Ｃ区基因寡核苷酸探针Ｍ０（无突变），Ｍ１（１点突变），Ｍ２（２点突变）进行斑点杂交，结果发现ＨＢｅＡｇ阴性／抗—ＨＢｅ附性慢性乙肝患含有１７例（占８５％）在１８９６位核苷酸发生点突变，形成终止密码，其中１０例（占５０％）发生２点突变。选突变ＰＣＲ产物直接测序，同样证实点突变的存在。提示乙肝患含ＨＢｅＡｇ阳性自然转换为抗—ＨＢｅ阳性、并不一定是病毒复制减弱，而可能足ＨＢＶＤＮＡ前Ｃ区发生了基因变异。     

PCR循环测序法检测K—ras和HCV5‘非编码区基因变异

建立一种简单，快速，可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析了Ｋ－ｒａｓ基因和ＨＣＶ５‘非编码区基因的变异情况。方法；ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶，荧光标记的２’３‘－双脱氧核苷三磷酸直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。     

胰腺癌患者p16基因序列分析

目的：研究ｐ１６基因的突变在人胰腺癌发生中的作用。方法：应用ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ,ＤＮＡ测序,研究ｐ１６基因的突变情况。     

苯丙酮尿症患者苯丙氨酸羟化酶基因的两个新突变

寻找中国人苯丙酮尿症（ＰＫＵ）新的基因突变点，研究其对ＰＫＵ致病的作用，藉以提高该病的临床诊断率。方法应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增苯丙氨酸羟化酶（ＰＡＨ）基因外显子４区域。对发现的新突变，通过双链ＤＮＡ循环测序方法加以确定。结果２４例ＰＫＵ样品中，７例电泳行为与正常对照有差异，分属两种类型。第一种类型仅有１例，突变单链的两条带，一条位于正常单链的前方，一条滞后。测序结果显示突变发生在内含子４的５′受体位点（ＧＴ→ＡＴ）；第二种类型较多见，突变单链的两条带均位于正常单链前方，测序结果显示突变发生在内含子３中，位于内含子３的３′端第１１个核苷酸，为Ａ→Ｃ取代。结论两种突变类型的第一种发生于切接位点，第二种为一多态性改变（突变频率为２０％）。     

结直肠癌组织Ⅱ型β转化生长因子受体基因突变的研究

目的 探讨散发性结直有肠癌组织中β转化生长因子Ⅱ型受体基因的突变情况。方法 组织ＤＮＡ提取后进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ－银染分析,经测序确定点突变类型。结果 在ＴＧＦ－βＲⅡ的ＤＮＡ７０９－７１８位点突变率为１０％,表现为１Ａ的缺失突变。突变率在近端明显高于远端。结论 在散发性结直肠癌中ＴＧＦ－βＲⅡ基因具有较低的突变率;近端结肠癌尤其是回盲部癌有较高的突变率。     

应用改进的PCR-SSCP银染色法检测卵巢上皮肿瘤p53基因突变的研究

目的：探讨ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染法检测基因点突变的准确性和检测卵巢上皮肿瘤ｐ５３基因的点突变率。方法：建立ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术检测了３６例卵巢上皮癌，１２例卵巢上皮交界瘤和１５例良性卵巢上皮肿瘤ｐ５３基因第５～９外显子的点突变。结果：ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染正常时出现２条带，突变时出现３条带；卵巢上皮癌ｐ５３基因突变率为３０．６％；第５、６、７、８、９外显子分别为１、１、６、３、０例；突变率在临床各期、组织学分级和组织学类型之间无明显差异；卵巢上皮交界瘤仅１例ｐ５３基因第７外显子发生突变，良性卵巢瘤无１例发生突变。结论：ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染法检测卵巢上皮肿瘤ｐ５３基因点突变准确率高，有助于区分卵巢上皮肿瘤的良恶性     

一个非氨基糖甙类抗生素致聋家系mtDNA突变研究

目的：对１个有明确母系遗传的非氨基糖甙类抗生素致聋“线粒体耳聋”家系致病的分子生物学机制进行探索。方法：应用ＰＣＲ、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＤＮＡ序列分析等分子生物学技术对其线粒体ＤＮＡ突变进行研究。结果：家系中全部患者和１个母系亲属存在线粒体ＤＮＡ１２Ｓ ｒＲＮＡ基因１５５５位点Ａ－Ｇ的突变,家系中的正常后代和２０个正常对照个体未发现突变。结论：线粒体ＤＮＡ Ａ１５５５Ｇ点突变是导致该家系耳聋的主要因     

Rett综合征患者线粒体DNA突变的初步分析

目的 探讨线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征发病中的作用。方法应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）分析及ＤＮＡ直接测序结合错配ＰＣＲ的方法，对１５例Ｒｅｔｔ综合征患儿及其中１４例的母亲的外周血白细胞线粒体ＤＮＡ的部分片段进行分析。结果１３例患儿及其中１１例的母亲的线粒体ＤＮＡ上，编码１６ＳｒＲＮＡ基因的２６５０－３０００区域ＤＮＡ突变，其中７例患儿及其中６例的母亲存在２８３５位点的点突变（Ｃ－Ｔ），３０例正常对照均未发现有此点突变。结论线粒体ＤＮＡ在Ｒｅｔｔ综合征的发病中起一定作用。     

应用不对称PCR—SSCP检测人胰腺癌P53抑癌基因的突变

目的：了解内蒙古地区胰腺癌患者Ｐ５３抑癌基因的突变情况。方法：采用不对称ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术检测胰腺癌患者Ｐ５３基因在５，６，７和８外显子的基因突变，它与传统的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ相比有更多的优势，克服了传统方法中双链ＤＮＡ不完全变性或非特异扩增造成的解读困难和错误判读，而且应用一对引物中不同当量的２个引物配成的反应混合物Ｍｉｘ１和Ｍｉｘ２，对标本进行两次检验，可以两次判定结果，进一步增加了实验的可靠     

应用改进的PCR—SSCP银染色法检测卵巢上皮肿瘤p53基因突变？…

目的：探讨ＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染法检测基因点突变的准确性和检测卵巢上皮肿瘤ｐ５３基因的点突变率。方法：建立ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染技术检测了３６例卵巢上皮癌，１２例卵巢上皮交界瘤和１５例良性卵巢上皮肿瘤ｐ５３基因第５￣９外显子的点突变。结果：ａＰＣＲ－ＳＳＣＰ银染正常时出现２条带，突变时出现３条带，卵巢上皮癌ｐ５３基因突变率为３０．６％；第５、６、７、８、９外显子分别为１、１、６、３、０例，突变率在临     

人肝癌裸鼠移植瘤株p53基因突变及测序研究

目的 研究从厦门同安肝癌高发区所建的裸鼠移植瘤（ＨＨＣ，ＨＨＣ１５）是否存在ｐ５３基因突变。方法 从两移瘤提取的总ＤＮＡ用分子生物学方法检测并测序，如ＰＣＲ方法扩增ｐ５３基因部分第７外显子，地高辛标记ＤＮＡ探针斑点杂交法，ＤＮＡ限制性酶切片段长度多态分析和激光荧光ＤＮＡ测序等。结果 ＨＨＣ４细胞ＤＮＡ有ｐ５３基因第２５０密码子（Ｃ→Ａ）的突变；ＨＨＣ１５有ｐ５３基因第２４９密码子（Ｇ→Ｔ）的突变。     

用PCR突变技术克隆艾滋病病毒蛋白酶基因

用ＰＣＲ突变技术克隆艾滋病病毒蛋白酶基因｜｜［阎小君，苏成芝，吉昌华．中国病毒学，１９９３；８：１５４～１５９］作者设计并合成了一对用于ＰＣＲ技术的突变引物ＨＩＶ－１Ｐｒ１和ＨＩＶ－１Ｐｒ２，分别在两引物中设计了两个突变点，使突变后基因含有ＥｃｏＲＩ...     

胃癌中MTS1基因外显子2突变及缺失的研究

ＭＴＳ１是Ｋａｍｂ在１９９４年发现的一种新的抑癌基因。在很多类型肿瘤中经常出现ＭＴＳ１基因的纯合性缺失或突变。本文利用ＰＣＲ方法研究了ＭＴＳ１基因第２外显子在胃癌中的纯合性缺失情况，２４例标本中发现２例缺失。用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ并结合ＰＣＲ产物直接测序技术分析了２４例原发性胃癌标本中ＭＴＳ１基因第２外显子突变情况，只发现１例突变，此结果提示胃癌中ＭＴＳ１基因突变率较低。